專利名稱：一種壁虎抗癌提取物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種壁虎抗癌提取物。
背景技術：
壁虎是我國傳統的治療腫瘤的中藥材。大量的臨床報道顯示，壁虎治療惡性腫瘤效果顯著，干、鮮壁虎、含壁虎的血清、壁虎復方制劑、壁虎蛋白酶水解液等對腫瘤均有較好的療效。謝爽、王學美等(謝爽，王學美， 謝東澤.鮮壁虎提取物抑制C6膠質瘤細胞增值和誘導細胞凋亡的研究.腫瘤防治研究，2003，30 :458-461)用不同濃度的鮮壁虎提取液(取活體無蹼壁虎冷凍處死，清水洗浄，粉碎勻漿，凍融10次，自然沉淀取上清，低溫離心10000r/min,離心20min,取上清)對C6膠質瘤細胞進行研究,結果鮮壁虎提取液在64mg/L、128mg/L、256mg/L濃度時，可以顯著抑制C6膠質瘤細胞的生長，且有明顯的量-效關系。楊麗華、王學美等(楊麗華，楊金霞，王學美等.壁虎多糖對鼠源肝癌H22體內外作用研究.天津中醫藥，2008，25 :494-496)進行了壁虎多糖對鼠源肝癌H22體內外作用研究，結果發現壁虎多糖在體外作用很強，但對體內移植瘤無作用，因此對壁虎多糖的抗腫瘤作用提出了質疑。李耀輝、耿秀芳等(李耀輝，盛繼文，耿秀芳等.無蹼壁虎藥用成分抗腫瘤效果.陜西中醫，2009，30 :899-901)把鮮壁虎置入酒精致死，搗碎勻漿，こ醇溶液浸泡，蒸發除こ醇，再除脂類，得到水提物，最后冷凍干燥，得到干燥物。然后該干燥物以こ醇溶解，經Al2O3柱層析，得到15個層析藥物樣品。經過實驗研究發現，這些樣品中的第3到第9部分有抑制H印G-2的作用，其余部分作用不明顯。而李耀輝等(李耀輝，劉冬梅，盛繼文等.無蹼壁虎抗腫瘤成分的提取及其對CT-26小鼠結腸腺癌的抑制作用.第四軍醫大學學報，2009，30 :1103-1106)在無蹼壁虎抗腫瘤成分的提取及其對CT-26小鼠結腸腺癌的研究中，報道有19個層析成分，其中第11到第19個樣品無作用，第I到第10樣品均有一定的抗腫瘤作用其中第I到第6樣品作用最強。康建功、李耀輝等(康建功，張仕狀，李耀輝等.鮮無蹼壁虎抗腫瘤活性成分抑制CT-26腫瘤細胞生長實驗研究.中國醫院藥學雜志，2007，27 441-444)還比較了鮮壁虎活性成分及其脂質體對CT-26的作用，發現活性成分脂質體在體內的作用較強。上述大量的研究結果表明，壁虎提取物具有肯定的抗腫瘤作用，并且在實體瘤治療方面有良好的應用前景，但目前的壁虎提取物的提取方法較為復雜，而且壁虎提取物對腫瘤的抑瘤效果很難達到氟尿嘧啶和阿霉素的抑瘤水平。

發明內容
本發明的目的是提供一種抑瘤效果好的壁虎抗癌提取物。為了實現以上目的，本發明所采用的技術方案是一種壁虎抗癌提取物，其采用如下方法提取而成I)將壁虎清洗、晾干，破碎成粉末，置于pH為7. 4的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸的緩沖溶液中，浸泡12小吋；
2)浸泡后破碎，離心取上清液加入無水こ醇至こ醇終濃度為55%進行提取，然后離心取上清液即得壁虎醇提液；3)將壁虎醇提液蒸發濃縮，加入硫酸銨至其濃度為25%，調整pH至7，4°C靜置3 4小時，每隔30min攪拌一次，然后離心取上清得上清液；將得到的上清液加入硫酸銨至其濃度為50%，調整PH至4. 6，4°C靜置3 4小吋，每隔30min攪拌一次，然后離心得到沉淀；4)將沉淀裝入截留分子量為3. 5KDa透析袋中，將透析袋置于(TC蒸餾水中進行透析，直至透析袋中出現白色絮狀物；
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5)取出透析袋將白色絮狀物進行真空冷凍干燥，得到壁虎抗癌提取物。步驟2)和步驟3)中所述離心為7000g離心20分鐘。步驟2)所述破碎為超聲細胞破碎、膠體磨勻漿。步驟2)所述加入無水こ醇后，于4°C靜置3 4小吋，每隔30分鐘攪拌一次。步驟3)所述調整pH采用的是鹽酸。本發明的壁虎抗癌提取物，采用醇提、鹽析、透析的方法，從壁虎中提取出具有抗腫瘤作用的多肽分子，使提取物具有很強的抗腫瘤效果，可以作為高效、低毒的抗腫瘤新藥物的活性成分。經過試驗證明本發明的壁虎抗癌提取物具有很好的抗癌作用，達到了常規抗癌藥物氟尿嘧啶和阿霉素的抗癌水平，可以提高機體的免疫力，而且壁虎提取物中含有天然的壁虎多肽，具有毒性低、副作用小的優點。另外本發明的制備方法簡單，易于推廣應用。
具體實施例方式實施例I、壁虎晾干與粉碎把清洗過的干無蹼壁虎IOOOg晾干后，用粉碎機粉碎為粗粉。2、浸泡、破碎與勻漿置于4000mL Tris-HCl緩沖液中(pH = 7. 4)，浸泡過夜，超聲細胞破碎，膠體磨勻漿并收集勻漿液。3、離心與醇提7000g (IIOOOrpm)離心，20min，得上清液3800ml，向上清溶液中邊緩慢加入無水こ醇(99. 7%)4676ml使こ醇終濃度為55%，4°C靜置3 4小時，每隔30min攪拌一次，然后7000g (IIOOOrpm)離心，20min，取上清即得壁虎醇提物水溶液。4、旋轉蒸發濃縮55°C，0. 085-0. IMPa下濃縮醇提物水溶液至200ml。5、鹽溶與鹽析向壁虎醇提物水溶液中緩慢加入66. 7ml飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨飽和濃度為25%，用HCl溶液調PH至7，4°C靜置3 4小吋，每隔30min攪拌一次，然后7000g (I IOOOrpm)離心,20min,取上清得上清夜260ml ;向所得上清溶液中加入133ml飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨飽和濃度為50%，再用HCl調PH至4. 6，4°C靜置3 4小吋，每隔30min 攪拌一次,然后 7000g (IIOOOrpm)離心，20min,得沉淀 222. 6g。6、透析使用截留分子量為3. 5KDa透析袋，裝入適量鹽析物置于(TC蒸餾水中，磁カ攪拌，每30min換一次蒸餾水，直至內溶物中出現大量白色絮狀物。7、凍干取透析袋內溶液放于凍干瓶，在真空度為20Pa，溫度為_50°C條件下在真空冷凍干燥機上在干燥48H，得到干燥物62. lg。實驗例
I、不同濃度的壁虎抗癌提取物對人肝癌細胞H印G2的增殖抑制作用MTT法檢測壁虎抗癌提取物對人肝癌細胞HepG2的增殖抑制將RPMI1640培養基培養的肝癌細胞H印G2每孔IX 104/mL接種于96孔板，用不同濃度(O. 625,0. 75、I. 5、3mg/ml)的壁虎抗癌提取物，分別處理24、48、72h。結束前4h每孔加入新鮮配制5mg/mLMTT液20 μ L，繼續培養4h，棄去培養基，每孔加入ニ甲基亞砜(DMSO) 150 μ L，待完全溶解后，酶標儀測定490nm波長處測定各孔的吸光度Α，并按下式計算抑制率。抑制率(％ ) = [1_(A實驗組/A陰性對照)]X 100%。實驗重復3次。結果見表I表I不同濃度的壁虎抗癌提取物對人肝癌細胞H印G2的增殖抑制作用(^ ±s, η =
5)
權利要求
1.一種壁虎抗癌提取物，其特征在于其采用如下方法提取而成 1)將壁虎清洗、晾干，破碎成粉末，置于pH為7.4的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸的緩沖溶液中，浸泡12小時； 2)浸泡后破碎，離心取上清液加入無水こ醇至こ醇終濃度為55%進行提取，然后離心取上清液即得壁虎醇提液； 3)將壁虎醇提液蒸發濃縮，加入硫酸銨至其濃度為25%，調整pH至7，4°C靜置3 4小時，每隔30min攪拌一次，然后離心取上清得上清液；將得到的上清液加入硫酸銨至其濃度為50%，調整PH至4. 6，4°C靜置3 4小時，每隔30min攪拌一次，然后離心得到沉淀； 4)將沉淀裝入截留分子量為3.5KDa透析袋中，將透析袋置于0°C蒸餾水中進行透析，直至透析袋中出現白色絮狀物； 5)取出透析袋將白色絮狀物進行真空冷凍干燥，得到壁虎抗癌提取物。
2.根據權利要求I所述的壁虎抗癌提取物，其特征在干所述步驟2)和步驟3)中離心為7000g離心20分鐘。
3.根據權利要求I所述的壁虎抗癌提取物，其特征在于步驟2)所述破碎為超聲細胞破碎、膠體磨勻漿。
4.根據權利要求I所述的壁虎抗癌提取物，其特征在于步驟2)所述加入無水こ醇后，于4°C靜置3 4小吋，每隔30分鐘攪拌一次。
5.根據權利要求I所述的壁虎抗癌提取物，其特征在于步驟3)所述調整pH采用的是鹽酸。
全文摘要
本發明公開了一種壁虎抗癌提取物，首先將壁虎晾干粉碎，在pH為7.4的緩沖溶液中浸泡12小時，然后加入無水乙醇進行乙醇提取，并對提取液蒸發濃縮，再將濃縮液加入硫酸銨鹽析，最后經過透析得到白色絮狀物沉淀，將其干燥得到壁虎抗癌提取物。本發明的壁虎抗癌提取物，采用醇提、鹽析、透析的方法，從壁虎中提取出具有抗腫瘤作用的多肽分子，使提取物具有很強的抗腫瘤效果，可以作為高效、低毒的抗腫瘤新藥物的活性成分。經過試驗證明本發明的壁虎抗癌提取物具有很好的抗癌作用，達到了常規抗癌藥物氟尿嘧啶和阿霉素的抗癌水平，可以提高機體的免疫力，而且壁虎提取物中含有天然的壁虎多肽，具有毒性低、副作用小的優點。另外本發明的制備方法簡單，易于推廣應用。
文檔編號A61P35/00GK102688475SQ20121001085
公開日2012年9月26日 申請日期2012年1月14日 優先權日2012年1月14日
發明者宋 瑩, 崔朝初, 李瑞芳, 段冷昕, 王建剛 申請人:河南科技大學