專利名稱：一種菜籽活性多肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品加工技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種菜籽活性多肽的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
油菜是重要的油料作物之一，我國油菜產(chǎn)量居世界第一位。一般情況下，油菜籽經(jīng)加工可得約3506菜籽油和65%左右菜籽粕。菜籽粕中富含粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、卵磷脂、多種維生素、氨基酸等，其蛋白質(zhì)中可消化蛋白質(zhì)含量可達(dá)27. 8%。此外，菜籽粕中還含有較高膽堿、生物素、葉酸、煙酸及硫胺素、核黃素等B族維生素和Ca、P、Fe, Se, Cu、Zn、Mn等多種微量元素。菜籽粕的粗蛋白含量一般在35%-45%，為優(yōu)質(zhì)的全價植物蛋白，對其進(jìn)行開發(fā)利用具有重要的經(jīng)濟(jì)意義與社會意義。但是，目前我國對菜籽粕的利用相當(dāng)有限，僅用作肥料或按少量比例添加到反芻動物和淡水魚類的養(yǎng)殖飼料中，這造成了一定資源浪費(fèi)。蛋白質(zhì)是一切生命活動的主要體現(xiàn)者和物質(zhì)基礎(chǔ)。一切生命活動都與蛋白質(zhì)有關(guān)，因此有關(guān)蛋白質(zhì)的研究一直以來都是生物技術(shù)領(lǐng)域的研究的熱點。而近年來，越來越多的研究表明肽比蛋白質(zhì)具有更優(yōu)秀的性質(zhì)。現(xiàn)代生物代謝研究發(fā)現(xiàn)由多個氨基酸結(jié)合而成的低聚肽比游離氨基酸更容易被消化吸收，其中尤以二肽、三肽吸收為最好最快。相比于原料蛋白及相同組成的氨基酸，酶解產(chǎn)物多肽能表現(xiàn)出良好的持水力、凝膠性、表面活性等物理功能特性以及抗氧化、降血脂、調(diào)節(jié)免疫力等多種生理功能，而這些是原料蛋白質(zhì)和組成游離氨基酸所不具備的。因此，將菜籽粕用來加工高附加值產(chǎn)品，具有顯著的社會意義和經(jīng)濟(jì)意義。蛋白質(zhì)的水解方法一般包括酸堿降解法和酶解法。酸堿法水解動物蛋白是利用蛋白質(zhì)在不同PH下溶解度不同，先在極端條件下使絕大部分蛋白質(zhì)溶解，去掉不溶解物，再調(diào)PH至蛋白質(zhì)的等電點沉淀回收。化學(xué)降解法以其操作簡單、成本低、蛋白質(zhì)收率高等特點成為早期蛋白質(zhì)水解的主要手段，但隨著對蛋白質(zhì)水解的研究深入，漸漸發(fā)現(xiàn)化學(xué)法水解蛋白質(zhì)存在許多缺陷，如(1)過于極端劇烈的反應(yīng)條件給環(huán)境帶來很大的污染，同時也加重了后續(xù)環(huán)境治理的成本；( 酸堿的調(diào)節(jié)會導(dǎo)致水解產(chǎn)物成分復(fù)雜，鹽分過高，使用范圍受到很大限制，而現(xiàn)今的肽類產(chǎn)品大都作為食品、保健品、化妝品等；(3)激烈的反應(yīng)過程會使氨基酸的構(gòu)型由L-氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)镈-氨基酸，而D-氨基酸的功能性遠(yuǎn)不如L-氨基酸；(4)酸堿法難以控制反應(yīng)進(jìn)程，不能實現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的定位水解。綜合考慮，近幾年已經(jīng)很少采用化學(xué)法水解蛋白質(zhì)，取而代之的是酶法水解蛋白質(zhì)。采用生物法水解食物蛋白比化學(xué)酸堿處理法具有更突出的優(yōu)勢，如蛋白酶能在溫和的條件下水解食物類蛋白，不會造成大的環(huán)境污染；蛋白酶水解蛋白質(zhì)也不會造成氨基酸構(gòu)型的變化，較好的保存了氨基酸原有的功效；蛋白酶水解可以實現(xiàn)定位水解，易于實現(xiàn)水解進(jìn)程的控制，從而使肽類的應(yīng)用性和功能性變廣，滿足市場的需求。但是酶解蛋白質(zhì)并不是一個簡單的工藝過程，它涉及到很多步驟。第一步就是篩選合適的酶，因為酶不僅影響反應(yīng)的速率、產(chǎn)物的得率，而且還直接影響到產(chǎn)品的風(fēng)味、理化特性和生理活性，選擇依據(jù)不僅與酶自身的作用位點的專一性有關(guān)，還與底物以及工藝條件有很大關(guān)系。總體來說，菜籽蛋白氨基酸組成合理，接近聯(lián)合國糧農(nóng)組織(WHO)和世界衛(wèi)生組織(FAO)推薦的氨基酸組成模式，但高溫榨油工藝會造成蛋白質(zhì)變性，另外，從菜籽粕中分離得到的菜籽粗蛋白或多或少存在一些抗?fàn)I養(yǎng)因子，使其開發(fā)利用受到一定限制。因此，如何有效利用菜籽蛋白成為亟需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目在于提供一種菜籽活性多肽的制備方法，從而進(jìn)一步實現(xiàn)提高菜籽粕的附加值。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人通過大量試驗研究，最終獲得了如下技術(shù)方案 一種菜籽活性多肽的制備方法，包括如下步驟
(1)取脫殼脫脂干燥菜籽粕，粉碎過60目篩后置于提取罐中，加入8-12倍量蒸餾水， 40士2°C下攪拌浸提0. 8-1. 5h，5500-6500rpm、4°C離心20min，過濾上清液得到沉淀，按上述步驟再進(jìn)行相同的浸提操作2-3次，合并所得的上清液，用lmol/L鹽酸沉淀上清液，調(diào)pH 至4. 0后5500-6500rpm、4°C離心IOmin獲得沉淀，將沉淀置于蒸餾水中透析16_48h，并每隔他分別更換蒸餾水，然后真空冷凍干燥后得菜籽清蛋白；
(2)將菜籽清蛋白加蒸餾水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-8%的蛋白溶液，按每克菜籽清蛋白添加4000U的Flavourzyme蛋白酶，維持溫度55士2°C、pH7. 0，水解2. 5_汕，再按每克菜籽清蛋白添加^OOU的Alcalase蛋白酶，維持溫度52士2°C、pH8. 0，水解3. 5_4h，水解結(jié)束后快速升溫至95°C，保持10 15min，水解液冷卻到常溫后，12000rpm離心15min，取上清液， 得粗制多肽液；
(3)在粗制多肽液中按菜籽清蛋白質(zhì)量的2.5%加入活性炭，在55飛0°C下攪拌反應(yīng) 60min，15000rpm離心15min，取上清液，得粗制脫色多肽液；
(4)將粗制脫色多肽液先后經(jīng)濾紙過濾，IOOnm微濾膜過濾，500Da納濾膜過濾，納濾液在_45°C真空冷凍干燥，得菜籽活性多肽。通過動物試驗研究發(fā)現(xiàn)，利用上述方法制備的菜籽活性多肽在提高衰老小鼠模型的學(xué)習(xí)和記憶能力方面具有顯著的作用。因此，本發(fā)明的第二個目的在于提供一種產(chǎn)品新用途，即利用上述方法獲得的菜籽活性多肽在制備提高記憶力的保健品、食品或藥品中的應(yīng)用。本發(fā)明制備的菜籽活性多肽是菜籽蛋白經(jīng)蛋白酶作用，再經(jīng)特殊處理后得到的蛋白質(zhì)水解物，由許多分子鏈長度不等的低分子小肽混合物組成，還含有少量游離氨基酸、糖類和無機(jī)鹽等成分。本發(fā)明涉及的菜籽活性多肽的制備方法具有如下優(yōu)點和顯著的進(jìn)步(1)篩選得到了理想的復(fù)合蛋白酶及其用量，獲得了風(fēng)味較好的活性多肽，實現(xiàn)了對廢料的綜合利用， 進(jìn)一步提高了菜籽粕的附加值。(2)生產(chǎn)工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，對生產(chǎn)設(shè)備的要求低，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。(3)利用該方法制備的菜籽活性多肽能顯著提高老年人的學(xué)習(xí)和記憶能力。(4)利用該方法制備的菜籽活性多肽不僅具有良好的酸溶性、低勃度、抗凝膠形成性，在體內(nèi)消化吸收快，蛋白利用率高等特點，而且具有低抗原性，不會產(chǎn)生過敏反應(yīng)，還具有良好的理化性質(zhì)及生理活性，可作為運(yùn)動營養(yǎng)劑、減肥食品、老年食品的添加劑。
具體實施例方式以下是本發(fā)明制備菜籽活性多肽的具體制備例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步作描述，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于這些實施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。實施例1菜籽活性多肽的制備
(1)取脫殼脫脂干燥菜籽粕(粗蛋白含量38.5%)，粉碎過60目篩后置于提取罐中，加入 10倍量蒸餾水，40士2°C下攪拌浸提lh，6000rpm、4°C離心20min，過濾上清液得到沉淀，按上述步驟再進(jìn)行相同的浸提操作3次，合并所得的上清液，用lmol/L鹽酸沉淀上清液，調(diào)pH 至4. 0后6000rpm、4°C離心IOmin獲得沉淀，將沉淀置于蒸餾水中透析Mh，并每隔他分別更換蒸餾水，然后真空冷凍干燥后得菜籽清蛋白；
(2)將菜籽清蛋白加蒸餾水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的蛋白溶液，按每克菜籽清蛋白添加 4000U的Flavourzyme蛋白酶，維持溫度55士2°C、pH7. 0，水解2. 5h，再按每克菜籽清蛋白添加的^OOU Alcalase蛋白酶，維持溫度52士2°C、pH8. 0，水解3.證，水解結(jié)束后快速升溫至95°C，保持lOmin，水解液冷卻到常溫后，12000rpm離心15min，取上清液，得粗制多肽液；
(3)在粗制多肽液中按菜籽清蛋白質(zhì)量的2.5%加入活性炭，在58°C下攪拌反應(yīng)60min， 15000rpm離心15min，取上清液，得粗制脫色多肽液；
(4)將粗制脫色多肽液先后經(jīng)濾紙過濾，IOOnm微濾膜過濾，500Da納濾膜過濾，納濾液在-45°C真空冷凍干燥，得無苦味、風(fēng)味好的菜籽活性多肽。實施例2菜籽活性多肽促進(jìn)小鼠記憶試驗研究
六周齡健康小鼠(體重22g-25g，雌雄各半)，將試驗小鼠隨機(jī)分成3組，每組15只，即青年對照組、衰老模型組、活性肽處理組。其中，衰老模型組、活性肽處理組小鼠的頸背部皮下注射生理鹽水稀釋的0. 8% D-半乳糖溶液0. 5ml/20g(200mg/kg)，l次/d，連續(xù)6周，造成衰老模型，青年對照組皮下注射等量生理鹽水，活性肽處理組在造模的同時每日上午九點灌胃一次本發(fā)明實施例1制備的菜籽活性多肽，劑量為0. 8g/kg體重，活性多肽以生理鹽水稀釋，連續(xù)6周，青年對照組和衰老模型組灌胃給予等體積生理鹽水。各組小鼠處理6周后，進(jìn)行水迷宮試驗，迷宮是80CmX50CmX20Cm雙層不透明有機(jī)玻璃箱，內(nèi)設(shè)起始點、終點平臺和四個盲端，平臺附近為安全區(qū)。試驗時迷宮水深12cm， 水溫保持(25士 1)°C，迷宮周圍一切空間標(biāo)志在整個試驗過程中保持不變。正式試驗前一天，幫助每只小鼠在迷宮中熟悉水環(huán)境15min，如小鼠在60s內(nèi)未到達(dá)平臺，可幫助式地將小鼠趕至平臺，并使小鼠在平臺上停留20s。第2天開始正式試驗。小鼠面向壁在起始點放入水中，記錄小鼠放入水中到達(dá)終點平臺時間(游全程時間)和進(jìn)入盲端的次數(shù)(錯誤次數(shù))，統(tǒng)計結(jié)果見表1。根據(jù)試驗結(jié)果可以看出，模型組與青年組相比，水迷宮試驗游全程時間明顯延長 、P < 0. 01)，錯誤次數(shù)顯著增加Gd <0.01)；而活性肽處理組小鼠雖未達(dá)到青年組的水平， 但較模型組這兩項成績均有顯著改善0° < 0. 05)，這說明本發(fā)明制備的菜籽活性多肽能夠提高衰老小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。
表1菜籽活性多肽對小鼠水迷宮試驗成績的影響(n=15，X士 S)
權(quán)利要求
1.一種菜籽活性多肽的制備方法，包括如下步驟(1)取脫殼脫脂干燥菜籽粕，粉碎過60目篩后置于提取罐中，加入8-12倍量蒸餾水， 40士2°C下攪拌浸提0. 8-1. 5h，5500-6500rpm、4°C離心20min，過濾上清液得到沉淀，按上述步驟再進(jìn)行相同的浸提操作2-3次，合并所得的上清液，用lmol/L鹽酸沉淀上清液，調(diào)pH 至4. 0后5500-6500rpm、4°C離心IOmin獲得沉淀，將沉淀置于蒸餾水中透析16_48h，并每隔他分別更換蒸餾水，然后真空冷凍干燥后得菜籽清蛋白；(2)將菜籽清蛋白加蒸餾水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-8%的蛋白溶液，按每克菜籽清蛋白添加4000U的Flavourzyme蛋白酶，維持溫度55士2°C、pH7. 0，水解2. 5_汕，再按每克菜籽清蛋白添加^OOU的Alcalase蛋白酶，維持溫度52士2°C、pH8. 0，水解3. 5_4h，水解結(jié)束后快速升溫至95°C，保持10 15min，水解液冷卻到常溫后，12000rpm離心15min，取上清液， 得粗制多肽液；(3)在粗制多肽液中按菜籽清蛋白質(zhì)量的2.5%加入活性炭，在55飛0°C下攪拌反應(yīng) 60min, 15000rpm離心15min，取上清液，得粗制脫色多肽液；(4)將粗制脫色多肽液先后經(jīng)濾紙過濾，IOOnm微濾膜過濾，500Da納濾膜過濾，納濾液在_45°C真空冷凍干燥，得菜籽活性多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制備的菜籽活性多肽在制備提高記憶力的保健品、食品或藥品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種菜籽活性多肽的制備方法，該方法包括將脫殼脫脂干燥菜籽粕粉碎后用水浸提、離心，所得上清液用酸沉淀、并置于水中透析，所得菜籽清蛋白經(jīng)雙酶水解后脫色除雜，得菜籽活性多肽。本發(fā)明的生產(chǎn)工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，對生產(chǎn)設(shè)備的要求低，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。
文檔編號A61P25/00GK102533918SQ20121001565
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者吳雷, 張麗琍, 張超, 祁斌 申請人:安徽燕之坊食品有限公司