專利名稱：狼毒大戟有效成分提取方法及由該成分制備的二萜類藥物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種狼毒大戟有效成分提取方法，本發明還涉及一種由該有效成分制備的二萜類藥物，該藥物主要用于乳腺腫瘤的治療。
背景技術：
惡性腫瘤是嚴重危害人類生命健康的常見病和多發病，也是危害人類生命健康的重要殺手，目前約有90%的惡性腫瘤患者死于腫瘤轉移，控制轉移是決定惡性腫瘤患者預后的關鍵因素。臨床治療惡性腫瘤主要是采用手術切除、放射性治療和化學藥物治療等方法，但這些療法對腫瘤的轉移行為控制效果不佳，大約30%新診斷的實體瘤患者已有臨床可見的轉移灶，而目前發現的抗腫瘤轉移劑如維甲酰胺、紫杉醇、阿拉伯半乳糖和肝素等均由化學合成方法得到，毒性比較大，效果不明顯。因此，迫切需要一種療效顯著而毒副作用低的抗腫瘤轉移天然藥物。中藥狼毒大戟(Euphorbia fischeriana Steud.)為大戟科植物狼毒大戟的干燥根，多年生草本；高達40cm，有白色乳液；根肥厚肉質，圓柱形，外皮土褐色，含黃色汁液。分布于黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、等省區。春、秋季采挖，除去殘莖，洗凈泥土，曬干切片。全株有毒，根毒性大。可外用治頭癬，殺鼠。全草含刺激性乳汁，皮膚接觸后，能引起水泡，誤食引起口腔咽喉的刺激、惡心、嘔吐、出血性下痢、腹痛、出冷汗、面色蒼白、血壓下降、煩躁， 嚴重時精神失常，眩暈、站立不穩、抽搐、痙攣，有時引起死亡。狼毒大戟得到的有毒成分為 12-異丁酰基-13-乙酰基-20-當歸酰基佛波醇酯(12-isobutyryl-13-acetyl-20-angel yphorbol)，毒性不強，小鼠耳殼試驗半數有效量為2. 5 μ g/ear，持續時間也較短。此外，尚含O-乙酰基-N- (N'-苯酰-L-苯丙氨酰)-L-苯丙氨醇(O-acetyl-N-W -benzoyl- L -phenylalanyl) -L-phenylalaninoI)及樹月旨等成分。研究表明，大戟科植物(特別是狼毒大戟)具有抗癌癥作用，參見專利CNl500504 ； 王莉平，王義善，張國營等.狼毒對惡性黑色素瘤細胞生長的影響及其分子作用機制的研究[J]，時珍國醫國藥，2011，22 (5) : 1133-1135。這些試驗選用狼毒大戟藥粉或粗提取物進行觀察，對其有效部位并未詳細闡述。專利CN1500504采用了傳統水煎煮提取狼毒大戟有效成份。潘勤等采用了乙醇回流提取狼毒大戟有效成份，參見潘勤，施敏鋒，閔知大，狼毒大戟中4種Jolkinolide型二萜的二維核磁共振研究，中國藥科大學學報，2004年第35卷第I期第16-19頁。這些方法二萜類成份提取率低，難以提高治療效果。

發明內容
本發明要解決的技術問題在于提供一種狼毒大戟有效成分的提取方法，本發明的要解決的另外一個技術問題還在于提供一種由該有效成分制備的二萜類藥物，該方法及所制得的藥物具有高效、安全、成本很低的優點。本發明狼毒大戟有效成分的提取方法的技術方案如下該方法取狼毒大戟的根部，采用超臨界二氧化碳萃取方法、以無水乙醇為夾帶劑進行提取，得到的提取物再以大孔吸附樹脂分離，獲得具有醫用療效的二萜類活性物質。本發明狼毒大戟有效成分的提取方法的具體步驟包括
I.超臨界二氧化碳萃取
取狼毒大戟的根部，陰干后粉碎至14-24目，置超臨界二氧化碳萃取釜中萃取，條件為壓力25-35MPa、溫度40_60°C、以超臨界二氧化碳流量100:5-15v/v的比例加入夾帶劑乙醇。然后進入分離釜分離40-50°C、5. 5-8MPa。按以上條件萃取4h，超臨界二氧化碳流體萃取體積不低于萃取釜體積的8倍，收集分離萃取液。2.大孔樹脂分離
萃取液減壓回收乙醇至無餾出液、得到的白色粘稠物。用體積比為75:25的石油醚、乙酸乙酯溶液將該白色粘稠物制成混懸液，以lBV/h的流速流過預處理好的大孔吸附樹脂柱至有色層約1/3柱體積。再用該石油醚、乙酸乙酯溶液以3BV/h流速洗脫3倍柱體積，得到包括 jolkinolide B> 17-hydroxyjolkinolide B 和 17-hydroxyjolkinolide A 等 14 個化合物。3.本發明藥物原料的提取
順次使用體積比分別為70:30、45:55、40:60的石油醚乙酸乙酯溶液以3BV/h 流速梯度洗脫約3倍柱體積，在薄層層析檢測下依次收集含有化合物jolkinolide B 組分的洗脫液、含有化合物17-hydroxyjolkinolide B組分的洗脫液和含有化合物 17-hydroxyjolkinolide A組分的洗脫液。將得到的三種洗脫液分別減壓回收石油醚、 乙酸乙酯，放冷，分別得至Ij jolkinolide B富集物，17-hydroxyjolkinolide B富集物和 17-hydroxyjolkinolide A 富集物。本發明由上述狼毒大戟有效成分制備的二萜類藥物
將上述三種富集產物按下述重量比例組合成本發明的二萜類藥物
25 35:30 35:30 45。對于這三種化合物有過報道，但其提取方法僅局限于實驗室研究用，不適合于工業化。參見王金蘭，王玉起，李濤等.新鮮狼毒大戟根化學成分研究[J]，中藥材，2010， 33(9):1406-1409。本發明采用的超臨界二氧化碳萃取具有萃取效率高、處理容量大、通過萃取參數的設定可獲得一定的選擇性、二氧化碳可循環使用、不污染環境以及條件溫和、有利于保留產物的天然活性等特點。大孔吸附樹脂分離具有處理量大、主要以水和乙醇作溶劑、經濟簡便、易于工業化等特點。通過體外抗腫瘤活性實驗發現，ETD516 (1)、ETD516 (2)、 ETD516 (3)對乳腺腫瘤細胞Bcap-37的增殖均具有抑制作用，IC5tl分別為3. 07±0. 25 (ug/ ml)、4.35±0.32(ug/ml)和6. 59 ±0. 54(ug/ml)。其作用是通過抑制蛋白激酶B活性調控PI3K / Akt信號轉導通路，進而抑制Bcap-37細胞增殖。體內研究發現，ETD516 (I)、 ETD516 (2)、ETD516 (3)對荷Bcap-37裸鼠移植瘤增殖的抑制率分別為49. 46%,38. 24%和 35. 85%。
具體實施例方式實施例I取狼毒大戟的根部，陰干后，打成14-24目的粉狀，投入超臨界二氧化碳萃取釜中，萃取條件25 MPa，55°C，超臨界二氧化碳流體流量100:10%(v/v)的比例加入夾帶劑無水乙醇。分離釜分離8 MPa、40°C。按以上條件萃取4 h，收集分離釜分離出的萃取液。萃取液減壓回收乙醇至無餾出液、得到的白色粘稠物。該白色粘稠物用石油醚 乙酸乙酯(75:25)制成混懸液，該液以lBV/h的流速流過預處理好并以水平衡的大孔吸附樹脂柱(直徑5cm、長100cm)，至有色層約1/3柱體積。首先用石油醚乙酸乙酯(75:25) 以3BV/h流速洗脫3倍柱體積；然后用石油醚乙酸乙酯(70:30)溶液以3Bv/h流速梯度洗脫約3倍柱體積、在薄層層析檢測下收集含有化合物jolkinolide B組分的洗脫液；用石油醚乙酸乙酯(45:55)溶液以3BV/h流速梯度洗脫約3倍柱體積、在薄層層析檢測下收集含有化合物17-hydroxyjolkinolide B組分的洗脫液。用石油醚乙酸乙酯(40:60)溶液以3BV/h流速梯度洗脫約3倍柱體積、在薄層層析檢測下收集含有化合物17-hydroxyjolkinolide A組分的洗脫液。將含有化合物jolkinolide B組分的洗脫液減壓回收石油醚、乙酸乙酯至幾乎無懼出，放冷，得到形態為白色固體的jolkinolide B富集物。將含有化合物17-hydroxyjolkinolide B組分的洗脫液減壓回收石油醚、乙酸乙酯至幾乎無餾出，放冷，得到形態為無色針晶的17-hydroxyjolkinolide B富集物。將含有化合物17-hydroxyjolkinolide A組份的洗脫液減壓回收石油醚、乙酸乙酯至幾乎無餾出，放冷，得到形態為無色針晶的17-hydroxyjolkinolide A富集物。實施例2
取狼毒大戟的根部，陰干，粉碎成14-24目的藥粉。取等量藥粉分別投入超臨界二氧化碳萃取釜中，按表I中列出的超臨界二氧化碳萃取條件進行萃取，超臨界二氧化碳流體萃取體積為萃取釜體積的8倍。然后進行大孔樹脂分離，得到的產物中含有化合物 jolkinolide B組分的洗脫液,將其命名為化合物I,含有化合物17-hydroxyjolkinolide B組分的洗脫液,將其命名為化合物2,含有化合物17-hydroxyjolkinolide A組份的洗脫液，將其命名為化合物3相對于藥粉的含量列入表I中。表I
誦壓力m乙 IffctW藥粉中含量(|Ag>MPaV(ν ν)化合物I化含物2化合》3I3040100.01210.29430.18592355050.0128030210J89232560150.01450.31540.1877
實施例3
本發明藥物的制備
將例I中三種富集產物按下述比例組合成二萜類藥物ETD516 (I)。
jolkinolide B 富集物17_hydroxy jo Ikino I i de B 富集物 17-hydroxyjolkinolide A 富集物==25:30:45
實施例4
本發明藥物的制備
將例I中三種富集產物按下述比例組合成二萜類藥物ETD516 (2)。 jolkinolide B 富集物17-hydroxyjolkinolide B 富集物17-hydroxyjolkinolide A 富集物=30:30:40 實施例5
本發明藥物的制備
將例I中三種富集產物按下述比例組合成二萜類藥物ETD516 (3)。jolkinolide B 富集物17_hydroxy jolkinol ide B 富集物 17-hydroxyjolkinolide A 富集物富=35:35:30。實施例6
本發明藥物的療效分析通過動物體外抗腫瘤活性實驗發現，ETD516 (1)、ETD516 (2)、 ETD516 (3)對乳腺腫瘤細胞Bcap-37的增殖均具有抑制作用，IC5tl分別為3. 07±0. 25 (ug/ ml)、4.35±0. 32 (ug/ml)和6. 59 ±0. 54 (ug/ml)。其作用是通過抑制蛋白激酶B活性調控PI3K / Akt信號轉導通路，進而抑制Bcap-37細胞增殖。體內研究發現，ETD516 (I)、 ETD516 (2)、ETD516 (3)對荷Bcap-37裸鼠移植瘤增殖的抑制率分別為49. 46%,38. 24%和 35. 85%。其中，ETD516 (I)在劑量 I. 55mg/kg、0. 78mg/kg 和 0. 39mg/kg 腹腔注射應用 14 天，腫瘤抑制率分別為78. 70%,64. 72%和59. 35%。
權利要求
1.一種狼毒大戟有效成分提取方法，其特征是該方法取狼毒大戟的根部，采用超臨界二氧化碳萃取方法、以無水乙醇為夾帶劑進行提取，得到的提取物再以大孔吸附樹脂分離，獲得具有醫用療效的二萜類活性物質。
2.根據權利要求I所述狼毒大戟有效成分提取方法，其特征是該方法的具體步驟包括A.超臨界二氧化碳萃取取狼毒大戟的根部，陰干后粉碎至14-24目，置超臨界二氧化碳萃取釜中萃取，條件為壓力25-35MPa、溫度40_60°C、以超臨界二氧化碳流量100:5-15v/v的比例加入夾帶劑乙醇；然后進入分離釜分離40-50°C、5. 5-8MPa ;按以上條件萃取4h，超臨界二氧化碳流體萃取體積不低于萃取釜體積的8倍，收集分離萃取液；B.大孔樹脂分離萃取液減壓回收乙醇至無餾出液、得到的白色粘稠物；用體積比為75:25的石油醚、乙酸乙酯溶液將該白色粘稠物制成混懸液，以lBV/h的流速流過預處理好的大孔吸附樹脂柱至有色層約1/3柱體積；再用該石油醚、乙酸乙酯溶液以3BV/h流速洗脫3倍柱體積，得到包括 jolkinolide B> 17-hydroxyjolkinolide B 和 17_hydroxyjolkinolide A 等 14 個化合物。
3.根據權利要求2所述狼毒大戟有效成分提取方法，其特征是該方法的具體步驟包括根據權利要求I所述狼毒大戟有效成分的提取方法，其特征是該方法還包括C.部分.藥物原料的提取順次使用體積比分別為70:30、45:55、40:60的石油醚乙酸乙酯溶液以3BV/h 流速梯度洗脫約3倍柱體積，在薄層層析檢測下依次收集含有化合物jolkinolide B 組分的洗脫液、含有化合物17-hydroxyjolkinolide B組分的洗脫液和含有化合物 17-hydroxyjolkinolide A組分的洗脫液；將得到的三種洗脫液分別減壓回收石油醚、 乙酸乙酯，放冷，分別得至Ij jolkinolide B富集物，17-hydroxyjolkinolide B富集物和 17-hydroxyjolkinolide A 富集物。
4.一種利用權利要求3所述狼毒大戟有效成分提取方法中獲取的有效成分制備的二萜類藥物，其中各種原料組分的重量配比是jolkinolide B 富集物17-hydroxyjolkinolide B 富集物17-hydroxyjolkinolide A富集物=25 35:30 35:30 45。
全文摘要
本發明公開了一種狼毒大戟有效成分提取方法及利用該成分制備的二萜類藥物，該方法取狼毒大戟的根部，采用超臨界二氧化碳萃取方法、以無水乙醇為夾帶劑進行提取，得到的提取物再以大孔吸附樹脂分離，獲得具有醫用療效的二萜類活性物質。本發明采用的超臨界二氧化碳萃取具有萃取效率高、處理容量大、通過萃取參數的設定可獲得一定的選擇性、二氧化碳可循環使用、不污染環境以及條件溫和、有利于保留產物的天然活性等特點。大孔吸附樹脂分離具有處理量大、主要以水和乙醇作溶劑、經濟簡便、易于工業化等特點。
文檔編號A61P35/00GK102603765SQ20121002278
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月2日 優先權日2012年2月2日
發明者劉吉成, 崔紅霞, 李曉明, 牛英才, 王曉麗 申請人:齊齊哈爾醫學院