專利名稱：蛋氨酸酶在抗蛋氨酸和抗高半胱氨酸的化學治療中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及蛋氨酸酶組合物，蛋氨酸酶的純化方法，把蛋氨酸酶結合到聚合物如 PEG(聚乙二醇)的方法，在抗氨蛋酸和抗高半胱氨酸的化學治療中使用蛋氨酸酶的方法。 更具體的說，本發明的方法包括蛋氨酸酶在癌癥治療，心血管病治療和腫瘤造影和診斷中的使用。本發明還涉及重組DNA技術。本發明特別提供了編碼蛋氨酸酶的表達模型。
背景技術：
以治療藥物為主的癌癥療法是指使用能夠選擇性抑制或殺滅癌細胞，但不對正常組織的功能造成超出可接受的范圍的損傷的藥物。常規療法的難點在于治療藥物對正常組織的毒性。現已發現在各種細胞類型和所評論的腫瘤組織中許多腫瘤都對蛋氨酸有絕對的需求。其中所述的細胞和腫瘤組織包括結腸、乳腺、前列腺、卵巢、腎、喉黑色素瘤、肉瘤、 肺、腦、胃和膀胱中的腫瘤以及白血病和淋巴瘤。現已明確當生長培養基中的蛋氨酸被高半胱氨酸取代時，腫瘤的無生長能力已被定義為對蛋氨酸的依賴性。例如，參見Chello等， Cancer Res. ,33 1898-1904,1973 ；和 Hoffman，Anticancer Res. ,5 :1-30,1985。現已表明去除蛋氨酸(methionine depletion)能夠選擇性地使依賴蛋氨酸的腫瘤細胞同步進入該細胞周期中的S/(}2晚期，Hoffman等，Proc. Natl. Ad. Acad. Sci. USA. 77 7306-7310,1980。聯合使用去除蛋氨酸，接著與暴露于抗有絲分裂劑，即抗蛋氨酸的化學療法，已經把腫瘤細胞從正常和腫瘤細胞的共培養物中選擇性地去除，結果導致正常細胞細胞的培養物強有力地增生。Mern 等，T. Natl. Cancer Inst. ,76 :629-639,1986。但是，為了在體內進行蛋氨酸依賴性化學療法，必需有一種從血清中有效去除循環的蛋氨酸的方法，目前還沒有人描述過這樣一種去除蛋氨酸的方法，即這種方法能夠降低體內循環的蛋氨酸的含量使其足以在抗腫瘤治療中有效。現已從各種細菌源純化出一種能夠降解蛋氨酸的酶即蛋氨酸酶，并且據報道這種酶能夠減緩體外腫瘤細胞增生的速度。Kreis等，Cancer Res. , 33 1862-1865和 1866-1869,1973 ；Tanaka 等，FEBS Letters. 66 307~3111976 ；Ito 等，T. Biochem. ,79 1263-1272，1976 和 Nakayama 等，Agric. Biol. Chem. ,48 :2367-2369,1984。Kreis等，在Cancer Rs. , 33 1866-1869，1973中已經描述了使用從產芽胞梭狀芽胞桿菌(Clostridium sporgenes)中分離出的很不純的蛋氨酸酶制劑，以1150單位/千克 /天的量抑制移入小鼠模型中的癌肉瘤細胞的生長。盡管該酶明顯降低了原發腫瘤細胞的生長，但是從未報道過把腫瘤直徑的T/C率(處理與對照之比)降低到50%以下，并且也從未報道過對轉移瘤有任何作用。作者也指出沒有其他非特異性的干涉不能預測蛋氨酸酶的腫瘤特異性，而且作者也沒有評論不純制劑中內毒素或其他組分對所觀察到的效果起的作用的可能性。所報道的唯一毒理研究是在治療期之后動物體重沒有減輕并且對毒性的一般肉眼檢查呈陰性。另外，作者報道了這種酶具有4小時的血清半衰期。這種酶制劑只有一半純度并且含有顯著量的內毒素，這使得對該結果的解釋復雜化。而且，Kreis不能把血清蛋氨酸的含量降低到對照組的8%以下，這可能歸因于芽胞桿菌(Clostridium)酶的高Km(大約90mM)。據報道蛋氨酸酶制劑不穩定并且在對它的純化中只能獲得2%回收(產率)。Kreis等，在CancerRes. ,33 1866-1869,1973中還報道了一種抗腫瘤的方法即使用不含蛋氨酸的食物作為去除蛋氨酸的方法。但是，作者報道該飲食方法不能象使用不純的蛋氨酸酶制劑一樣有效地減緩細胞的生長，并且會導致動物體重持續下降這種不希望出現的副作用。作者沒有報道聯合使用不含蛋氨酸的食物與蛋氨酸酶治療，并且沒有研究細胞的同步化。本發明的在先的申請提出了有效的腫瘤化學療法，這些化學療法是指使用蛋氨酸酶有效降低蛋氨酸的含量從而提供一種無損傷的抗腫瘤的有益效果。本發明通過提供一種用于生產商業上可行數量的高純度重組蛋氨酸酶來改進這些申請提出了治療和診斷方法以及組合物。

發明內容
現已發現，蛋氨酸酶，不論是PEG化(PEGylated)的形式還是所生產和純化的高純度的不含內毒素的重組形式，都能夠無損害地去除哺乳動物體內的蛋氨酸含量，都能夠有效地用于選擇性抑制腫瘤的生長，并且還能夠選擇性地阻抑腫瘤細胞，使其與抗有絲分裂的化學療法同步化。現在也發現當協同使用好幾種不同的方法來基本有效地降低蛋氨酸的含量時，蛋氨酸去除法是最有效的。這些方法包括使用不含蛋氨酸的飲食的蛋氨酸饑餓法，使用能夠與蛋氨酸競爭蛋氨酸利用酶(methionine-utilizing enzyme)的抑制劑的蛋氨酸競爭性抑制法，利于由蛋氨酸去除法誘發的特定腫瘤選擇性細胞周期阻抑的化學治療劑以及這些方法的組合。所以，本發明描述了一種抑制腫瘤細胞生長的方法，它包括把腫瘤細胞群與治療有效量的本文所定義的蛋氨酸酶接觸一段足以誘發細胞群中細胞的細胞周期停滯的時期， 并形成靜止的腫瘤細胞。“接觸”一詞是指把本發明的治療組合物與靶腫瘤放得非常接近以至于能夠觀察到抑制腫瘤的作用，或者把本發明的治療組合物放在一種培養基如營養培養基或血液中，以至于能使培養基中的蛋氨酸含量降低到能夠抑制培養基中的腫瘤細胞生長的水平。“靜止的”腫瘤細胞是指生長受抑制的腫瘤細胞。這種方法能夠在體外或體內使用。與腫瘤細胞的接觸不需要是直接的，它可以在體外或體內與含有腫瘤細胞的營養培養基接觸來實現。這種接觸也可以把循環血液與蛋氨酸酶接觸來完成。當腫瘤是不能循環的固體腫瘤時這種循環血液可以含有腫瘤細胞或不含腫瘤細胞。“抑制腫瘤細胞的生長”是指服用本發明化合物能夠減少腫瘤的生長，例如以體積來衡量，與未用該化合物治療的腫瘤相比，腫瘤的體積可降低10 %到100 %，更優選為至少34%到79 %，最優選為降低到55 %到 68%。蛋氨酸酶通過去除蛋氨酸被用作減緩或終止細胞分裂的一種抗腫瘤劑。使用蛋氨酸的競爭性抑制劑能夠增強這種作用。另外，把蛋氨酸酶與抗有絲分裂劑和其他細胞周期的特異性細胞毒素劑一起使用能夠通過誘發細胞周期同步化來增加抗有絲分裂劑或其他細胞周期的特異性細胞毒素劑的治療有效性。蛋氨酸酶也能用于去除高半胱氨酸的化學療法中來降低心血管疾病的危險和治療心血管疾病。蛋氨酸酶也用于超高分辯率地探測和診斷腫瘤時，再充足供[11C]蛋氨酸之前去除血液和腫瘤中的[12C]蛋氨酸。在一個技術方案中，首先使腫瘤細胞接受蛋氨酸饑餓步驟來首次降低蛋氨酸的含量。可不受限制地以高半骯氨酸伴隨蛋饑餓法來降低對正常細胞的毒性，從而增加治療的特異性。本發明的其他相關方面的特征是使用本發明的蛋氨酸去除法來將腫瘤細胞阻抑在細胞周期中的S/G2晚期，接著進行同步開始細胞周期的處理并服用一種細胞周期的特異細胞毒素劑如抗有絲分裂劑來選擇性地并有效地殺滅腫瘤細胞。本領域普通技術人員熟知對細胞周期具體階段的細胞具有毒性的細胞周期特異性細胞毒素劑。這種方法包括下列步驟(a)使由上述蛋氨酸去除步驟產生的靜止的腫瘤細胞與可誘發細胞周期的用量的蛋氨酸接觸，以啟動形成靜止腫瘤細胞周期生長的細胞(cycling-cells)的細胞周期，和(b)使周期生長的細胞與一定量的細胞周期的特異性細胞毒素劑接觸。這種周期生長的細胞毒素劑用量要足以抑制有絲分裂細胞的有絲分裂，由此抑制腫瘤細胞的生長。在一個技術方案中，這種方法包括下列步驟(a)使由上述蛋氨酸去除步驟產生的靜止腫瘤細胞與可誘發細胞周期用量的蛋氨酸接觸來啟動形成靜止腫瘤細胞的有絲細胞的有絲分裂，和(b)使有絲分裂細胞與一定量的抗有絲分裂劑接觸，這種抗有絲分裂劑用量要足以抑制有絲分裂細胞的有絲分裂，由此抑制腫瘤細胞的生長。根據本發明的一個方面，提供了一種診斷患者的腫瘤的方法，包括a)通過給患者服用蛋氨酸酶來去除患者體內的1V蛋氨酸；b)通過給患者服用11C蛋氨酸來給患者體內充分供應蛋氨酸；和C)測定患者體內腫瘤細胞中存在的11C蛋氨酸升高的水平。本發明另一個特征是使用蛋氨酸酶以降低患者體內的半胱氨酸水平來降低心血管疾病的危險性并治療心血管疾病。本發明提供了通過給藥蛋氨酸酶以去除蛋氨酸來進行腫瘤診斷和造影的方法。另一個特點是用于蛋氨酸去除治療法的治療組合物，它含有治療有效量的基本分離出的蛋氨酸酶，這種蛋氨酸酶具有的比活性為每毫克(mg)蛋白至少大約10到40個單位的蛋氨酸酶活性且每毫克蛋白少于大約1到IOOng的內毒素，在優選的方案中，該治療組合物包括每毫克蛋白少于IOng的內毒素，與一種藥學上合適的載體。本發明的治療組合物還包括不含內毒素的蛋氨酸酶，在一個技術方案中，蛋氨酸酶是使用一種新的有效的方法從在改良的發酵條件下生長的惡臭假單孢菌(Pseudomonas PUtida)中制得的。在這方面本發明還提供了一種分離改良的高效生產蛋氨酸酶的惡臭假單胞菌菌株的方法。在另一個方案中，蛋氨酸酶是由含有編碼蛋氨酸酶的表達模型的重組宿主產生的。本發明的蛋氨酸酶組合物也可以通過將蛋氨酸酶偶聯到聚合物如聚乙二醇(PEG)而以一種化學修飾的形式提供。本發明使用的PEG修飾的蛋氨酸酶具有高效去除蛋氨酸的活性，延長的半衰期和低免疫原性。本發明的蛋氨酸酶組合物也可以利用一種表達載體如本文所定義的高效表達載體所生產的重組蛋白的形態來提供。采用高效表達體系所生產的蛋氨酸酶能夠很容易地使用本文所描述的方法來純化以獲得不含內毒素并且非常純的蛋氨酸酶組合物，該組合物具有大約10到40個單位/毫克蛋氨酸酶的比活度。本發明還提供了含有能夠表達高得出奇的高含量蛋氨酸酶的核酸的載體。現在已經使用這種載體如那些使用T7 RNA聚合酶啟動子的載體，在適當的溫育條件下生產大約1 到4克蛋氨酸酶/升的蛋氨酸酶，其在粗制的組織勻漿液中比活度為大約2. 6到5，可表示為大約總細胞蛋白的10%到20%。本發明還提供了基因治療方法，即本文所述的使用能夠用來替代含有蛋氨酸酶組合物的克隆的蛋氨酸酶基因的方法。患者體內的細胞可以被改變來表達蛋氨酸酶為患者血清提供治療量的蛋氨酸酶。本發明還涉及分離出的核苷酸分子，含有圖8中所提供的核苷酸序列和一個或多個能夠在蛋氨酸酶的C-或N-端編碼兩個或多個組氨酸殘基的核酸序列。本發明還涉及使用一種表達模型的改良的基因療法。本發明的其他特征、優點和相關方案將以本文所包含的說明書為主進行闡述。附圖簡述

圖1以6個圖形詳細說明在不含蛋氨酸、不含高半胱氨酸、或不含蛋氨酸和高半胱氨酸培養基中腫瘤細胞系的生長。圖2詳細說明蛋氨酸酶在小鼠異種移植中降低人的肺腫瘤(H460)生長水平的有效性。也詳細說明了 5-FU和長春新堿治療的結果。圖3詳細說明蛋氨酸酶、5-FU和長春新堿對移植人肺腫瘤(H460)鼠的體重作用。圖4、5和6示給三名患者服用蛋氨酸酶之后蛋氨酸酶和蛋氨酸的藥物動力學。以蛋氨酸酶活性百分比作為蛋氨酸酶起始制劑活性的相對百分比。以蛋氨酸的百分比作為服用蛋氨酸酶之前蛋氨酸的相對百分比。圖7是對蛋氨酸酶-高半胱氨酸代謝循環的詳細說明。圖8提供了從惡臭假單胞菌分離出來的編碼蛋氨酸酶DNA分子的蛋氨酸酶的核苷酸序列和相應的氨基酸序列。圖9圖解載體中典型的高表達的模型。圖10簡要說明獲得高純度、不含內毒素的蛋氨酸酶的純化步驟簡圖。圖11概述使用本文所述的純化方法時重組蛋氨酸酶(rMETase)的典型純度和回收率。圖12A和12B提供了采用本發明方法純化rMETase產物的例子。圖13提供了不同劑型的rMETase的活性圖。圖14A-14D提供了對PEG-rMETase的HPLC的分析數據。圖15示不同PEG與rMEI^ase的分子時PECT-rMEI^ase的活性。圖16提供了在小鼠體內PEG-rMETase的藥物動力學。圖17示rMETase對KB3-1細胞體外培養中的生長抑制作用。
圖18提供了 rMETase抗裸鼠的KB3-1細胞的有效性。圖19提供了以裸鼠體重示rMETase的毒性。圖20提供了 rMETase對移植了 KB3-1細胞的裸鼠血液細胞的毒性。圖21提供了 rMETase對BALB/C小鼠的毒性。圖22提供了 rMETase對BALB/C小鼠的毒性。圖23提供了對人患者中蛋氨酸酶的毒性評價。圖M提供了對人患者中蛋氨酸酶的藥物動力學評價。圖25提供了證實rMEhse對裸鼠體內的H460和Η ^9的生長抑制的數據。圖沈提供了體外正常細胞和人癌細胞對rMEhse的敏感性的對比。這些附圖不必要按比例繪制，本發明的某些特征可以在比例上放大并且為了清楚和簡要以草圖的形式表示。

發明內容
A.定義“氨基酸殘基”是指在多肽肽鏈上化學消化(水解)多肽所形成的氨基酸。本文所述的氨基酸殘基尤其是指“L”光學異構體形式。但是，只要多肽保留了所需的功能特性，“D” 光學異構體上的殘基能被任何L-氨基酸殘基取代。NH2-是指存在于多肽氨基端的游離氨基。COOH是指存在于多肽羰基端的游離羰基。本t保留了標準的多妝命名法(在T.Biol. Chem. ,243, :3552_59，1969所描述的，并被37C. F. R. 1.822(b) (2))采納，這里引用為參考文件。應當注意本文使用通式所表示的所有氨基酸殘基序列的氨基端向羧基端的一般方向都是從左向右的取向。另外，把詞組“氨基酸殘基”較寬地定義為包括氨基酸表中所列的氨基酸以及改良的和不常用的氨基酸，如列于本文引用為參考文件的37CER 1.822(b) (4)中的那些氨基酸。而且，應當注意在氨基酸殘基序列起始端或末端的短線表示對另一個單個的或多個的氨基酸殘基序列的肽鍵或者對氨基端基團如NH2的或乙酰基或羧基端基團如COOH的共價鍵。“重組DNA(rDNA)分子”指的是通過操作性連接兩個DNA片段所形成的DNA分子。 所以，重組DNA分子是含有在自然中通常發現不在一起的至少兩個核苷酸序列的雜交的 DNA分子。沒有相同生物起源的即進化上不同的rDNA被稱作為“異源的” rDNA。“載體”指的是在細胞中能夠自主復制的rDNA分子和為了使所附著的區段發生復制，能夠可操作地連接DNA區段如基因或多核苷酸的rDNA分子。本文把能夠導向表達編碼一個或多個多肽的基因的載體稱作“表達載體”。特別重要的載體能夠容易地表達本發明的蛋氨酸酶蛋白。B. #用蛋氨,11_作力抗腫瘤齊1丨的方法I.蛋氨酸的去除本文以各種方式使用蛋氨酸酶作為抗腫瘤劑來從腫瘤細胞、腫瘤組織或患有癌癥的哺乳動物的循環系統中基本上去除蛋氨酸或者在如本文下面所詳細描述的認為需要去除蛋氨酸的情況下，去除蛋氨酸。 盡管已有的方法能夠把體內的蛋氨酸含量降低到不低于35 μ m左右，但是目前還沒有一種能夠安全、簡便并迅速把蛋氨酸含量降低到幾乎低于10 μ m左右的方法。基本上是指使用蛋氨酸的常規測定方法至少可測得蛋氨酸含量低于10 μ m，優選少于1 μ m，更優選少于0. 1 μ m，最好是測定不出蛋氨酸的含量。使用一些方法能夠在水溶液，包括體液如血液、血漿和血清中測定出蛋氨酸。一個舉例說明的方法是使用蛋氨酸標準物的反相FPLC 法。在體內，哺乳動物的循環中，在組織培養物或其他生物培養基需要去除蛋氨酸的體外條件下，以及在體外操作生物體液、細胞或組織并接著放回哺乳動物患者的體內的離體方法中都能夠進行去除。從循環、培養基、生物體液或細胞中進行蛋氨酸的去除是為了減少進入要治療物的蛋氨酸的量，因此它包括在去除蛋氨酸的條件下把要去除的物質與去除蛋氨酸量的本發明蛋氨酸酶接觸，來降解被接觸物質中的蛋氨酸。因為腫瘤細胞依賴于它們營養培養基中的蛋氨酸，所以可以去除這些細胞的營養源，而不必去除這些細胞本身。因此，在體內應用本發明，使蛋氨酸酶與腫瘤細胞群的營養介質接觸。在這種方案中，介質可以是血液、淋巴液、腦脊液等需要去除蛋氨酸的體液。去除蛋氨酸的量能夠根據使用的不同而在很寬范圍內變化，并且一般取決于物質中存在的蛋氨酸的量、所需的去除速度和該物質對于暴露于蛋氨酸酶的耐受性。使用本領域所熟知的各種化學和生化方法能夠很容易地監控物質中的蛋氨酸的含量和從該物質中去除蛋氨酸的速度。本文還描述了去除蛋氨酸量的例子，其中在每毫升被處理物質中，蛋氨酸酶的范圍是0. 001到100單位(U)，優選大約為0. 01到10U，更優選為大約0. 1到5U蛋氨酸酶的范圍內變化。去除蛋氨酸的條件是與蛋氨酸酶的生物活性相適應的緩沖液和溫度條件，并且包括與該酶相適應的緩和的溫度、鹽和PH條件。盡管優選生理條件，但條件的例子包括4-40 攝氏度(°C )左右、相對于0. 05到0. 2M NaCl的離子強度和5到9左右的pH。在一個優選的方案中，本發明設想了使用蛋氨酸酶作為抗腫瘤劑的方法，所以它包括把腫瘤細胞群與治療有效量的蛋氨酸酶接觸一段足以誘發群體中的細胞的細胞周期停滯的時期，并形成靜止的腫瘤細胞。如本文所述，由于各種原因，包括但不限于，選擇性地減緩腫瘤的生長、通過把停滯期的細胞保持一段延長的時期以產生細胞死亡的方法殺滅腫瘤細胞和在接著的化學治療之前為細胞周期同步化制備腫瘤細胞群等，都需要使腫瘤細胞處于細胞周期停滯期。通過與蛋氨酸酶接觸誘發細胞周期停滯所需的時間取決于好幾種因素，如與該細胞或含有該細胞的培養基所接觸的蛋氨酸酶的量，蛋氨酸的量，酶的比活度，溫度和其他影響反應速度的反應條件以及由實施者很容易控制的參數等。典型的時期是10分鐘到30天左右，優選1小時到20天左右，更優選1到10天左右。細胞周期的停滯是這樣一種狀態，其中細胞既不分裂也不通過全部周期過程進行循環，各個階段分別稱作(V G1^ G2和S期。正如通過相對于正常靜息細胞DNA的累積所證實，據認為一旦去除蛋氨酸，細胞周期會停止在SAi2晚期停止。通過各種組織學方法進行測定，能夠鑒定細胞周期停滯的方法，并且可以以細胞培養物進行評價，如實施例中所述該方法包括測定細胞群的DNA含量。本治療方法可用于的腫瘤包括任何惡性細胞型如在固體腫瘤或血液腫瘤中發現的惡性細胞。固體腫瘤的例子包括但不限于下列器官的腫瘤胰臟、結腸、盲腸、胃、腦、頭、頸、卵巢、腎、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑素瘤、前列腺和乳房。血液腫瘤的例子包括骨髓腫瘤、T或 B細胞惡性腫瘤、白血病、淋巴瘤、胚細胞瘤、骨髓瘤等。
在一個方案中，通過靜脈內或腹腔內注射給藥患者有效量的一種含有本發明的蛋氨酸酶的生理上可耐受的組合物來完成體內的接觸，由此去除存在于患者體內循環的腫瘤細胞的蛋氨酸源。也能通過把蛋氨酸酶向含有腫瘤細胞的組織給藥來完成蛋氨酸酶的接觸。
蛋氨酸酶的治療有效量是達到所需作用即去除腫瘤組織或患者循環中的蛋氨酸而計算好的預測量，因此使腫瘤細胞停止分裂。
所以，服用本發明蛋氨酸酶的劑量范圍是足以產生所需的作用即減少腫瘤細胞分裂和細胞周期的癥候的劑量范圍。該劑量不能大到引起不利的副作用，如粘滯性過高癥狀， 肺水腫，充血性心力衰竭等。通過劑量將隨著患者的年齡、身體狀況、性別和疾病程度的不同而變化，這是本領域普通技術人員能夠決定的。
如果有并發癥醫生可以調整該劑量。
本發明蛋氨酸酶的治療有效量一般是這樣一種劑量，S卩服用一種生理上可耐受的組合物時足以使血管內(血漿)或局部的蛋氨酸酶濃度達到每毫升大約0.001到100單位 (U)，優選在0. IU以上，更優選每毫升在IU蛋氨酸酶以上。普通的劑量是以體重為準服用， 并且在大約5-1000U/kg/天，優選大約5-100U/kg/天，更優選大約10-50U/kg/天，最優選大約20-40U/kg/天的范圍內。
在優選的方法中，所用的蛋氨酸酶基本上不含內毒素，正如本文進一步討論的。特別優選的是使用重組體所產生的基本上不含內毒素的蛋氨酸酶。
該蛋氨酸酶能夠通過注射或逐漸輸注一段時間經腸道外給藥。蛋氨酸酶也能通過靜脈內、動脈內、腹膜內、經口腔、肌肉內、皮下、腔內、經皮、皮膚給藥，能夠通過蠕動方式運送，或者直接注射到含有腫瘤細胞的組織或通過與內含有潛在的生物傳感器或蛋氨酸的導管相連的泵來給藥。
含有蛋氨酸酶的治療組合物通常靜脈內給藥，如注射單位劑量。術語“單位劑量” 當用于本發明治療組合物的說明書中時是指適于受治療者的單一劑量的物理上分立的單位，每個單位含有能產生所需治療作用的預測量的活性物質與所需稀釋劑即載體或賦形劑 (vehicle)0
該組合物是以與劑型一致的方式和一種治療有效量給藥的。所給的量取決于所治療的對象，該對象系統對使用活性組分的能力和所需治療有效的程度。需要給藥的活性成分的精確量取決于醫師的判斷并且都是每個個體都是獨特的。但是，本文公開了系統使用的適當劑量范圍，它取決于給藥的途徑。也仔細考慮了適當的最初給藥和加強劑量注射的方法，這種方法的特征是最初給藥接著在一或多個小時的間隔又進行注射或給藥重復的劑量。本文描述了多次給藥的例子，它特別優選持續維持血清或組織蛋氨酸酶的高含量并相反持續維持血清或組織蛋氨酸的低含量。另一方面，也仔細考慮了足以把體內的血液中的濃度維持到體內治療的特殊范圍的連續靜脈注射。
II.蛋氨酸的去除法
在實現本發明的方法中，通過能夠把含有蛋氨酸的物質與上文描述的蛋氨酸酶接觸的去除蛋氨酸的同時還可伴有一種或多種附加的蛋氨酸去除步驟。而且，本發明考慮了要去除蛋氨酸的各種治療步驟，本文會進一步描述。
a.蛋氨酸饑餓法
例如，可以使用蛋氨酸饑餓步驟來首次降低周圍的蛋氨酸含量，其中該饑餓步驟包括把腫瘤細胞與不含蛋氨酸的營養物接觸一段時間即蛋氨酸饑餓期，這個步驟可以在與蛋氨酸酶接觸步驟之前或過程中進行。蛋氨酸饑餓步驟可以包括在體外使用缺乏蛋氨酸的培養基即低含量或沒有蛋氨酸的培養基，或者體內使用不含蛋氨酸的飲食。不含蛋氨酸的培養基在組織培養領域中是熟知的。該培養基的一個例子是含有非必需氨基酸的fegle的基本培養基(缺少蛋氨酸和氯化膽堿)，如可從GIBCO得到。缺少蛋氨酸的氨基酸飲食也能夠在以商業途徑得到，包括從Teklad，Inc.得到的TD 92077飲食。
蛋氨酸饑餓步驟的時間可以根據具體應用的不同而大范圍地變化，它是足以使細胞培養物，組織或血管的蛋氨酸濃度下降到較低水平并終止該水平進一步下降的時間。典型的時間可以從大約6小時到2個月，優選大約1天到2周。
因為蛋氨酸是一種必需的氨基酸，應當清楚在許多本發明方法的使用中都在某種程度上對正常細胞具有毒性。但是，如本文所描述的，正常細胞和腫瘤細胞能夠不同地代謝蛋氨酸的前體高半胱氨酸，這樣高半胱氨酸能夠補充正常細胞中蛋氨酸的缺乏，同時又不挽救腫瘤細胞對蛋氨酸的依賴性。
所以，在一個相關的方案中，本發明考慮了一種使用缺乏蛋氨酸的營養物(培養基或飲食)的方法，它可以添加正常細胞所用的蛋氨酸的前體如高半胱氨酸或其類似物， 來提供必需的營養補充。以大約5到200 μ M優選大約10到100 μ M的濃度向營養培養基中加入高半胱氨酸。
用于該方案的優選蛋氨酸的前體包括L-高半胱氨酸-硫內酯，高半胱氨酸和 4-甲基硫-2-氧丁酸。
所以，在一個方案中，本發明包括用蛋氨酸缺乏的飲食喂養哺乳動物一段時間的步驟來去除血管內蛋氨酸。這種飲食可以任選包括蛋氨酸前體作為蛋氨酸的補充物。另一方面，這種蛋氨酸前體也可以通過注射或其他熟知的途徑來服用。作為飲食補充物的高半胱氨酸優選的每日劑量是每天每千克體重大約5到約IOOOmg高半胱氨酸。
高半胱氨酸的給藥途徑一般和加入蛋氨酸酶的途徑一樣，它取決于運送該補充物到達的靶組織。
b.蛋氨酸酯的競爭性抑制劑
按照實施例中所述的觀察，我們進一步發現使用蛋氨酸酶的競爭性抑制劑可用來協同性增強本文所述的蛋氨酸去除法的作用。所以本發明考慮到使用蛋氨酸饑餓步驟還包括把腫瘤細胞與一定量的蛋氨酸的競爭性抑制劑接觸一段足以能用蛋氨酸利用酶抑制蛋氨酸代謝的時間。用于指導競爭性抑制劑的蛋氨酸酶包括S-腺苷蛋氨酸脫羧酶，蛋氨酸 t-RNA合成酶和蛋氨酸腺苷轉移酶。
抑制蛋氨酸酶所需的時間優選在蛋氨酸饑餓期本身。
蛋氨酸的競爭性抑制劑與蛋氨酸競爭作蛋氨酸利用酶的底物，并通過直接競爭內源蛋氨酸可能產生的正常代謝的作用，也就是說抑制蛋氨酸的代謝。在細胞需要蛋氨酸和蛋氨酸輔助代謝的地方，該競爭性抑制劑起著降低蛋氨酸代謝的作用，因而需要更高的蛋氨酸濃度以產生與不存在抑制劑時觀察到的效果相同的效果。
蛋氨酸的競爭性抑制劑可以是任何具有典型競爭性抑制劑功能的蛋氨酸衍生物。 一般競爭性抑制劑包括蛋氨酸的烷基衍生物(即烷基硫堇)，其中甲硫氨酸(即蛋氨酸)的甲基可以被乙基取代(乙硫氨酸)，被丙基取代(丙硫氨酸)，被丁基取代(丁硫氨酸)，或者被戊基取代(戊硫氨酸)。
也考慮到把環亮氨酸和鹵代蛋氨酸用作可利用的蛋氨酸競爭性抑制劑。一般鹵代蛋氨酸選自于氟代蛋氨酸、氯代蛋氨酸、溴代蛋氨酸和碘代蛋氨酸。所以，所考慮到的蛋氨酸競爭性抑制劑選自于包括烷基硫堇、環亮氨酸和鹵代蛋氨酸在內的一些物質，其中所說的烷基硫堇不是甲硫氨酸。
對競爭性抑制蛋氨酸有效的蛋氨酸競爭性抑制劑的量是在蛋氨酸的有效濃度內能夠產生降低的作用的量。這種量相對于存在的蛋氨酸來說一般是超過一摩爾，這正如實施例中所顯示的。抑制劑量的范圍一般是相對于存在有被競爭的蛋氨酸的培養基中蛋氨酸濃度，超過10到1000倍摩爾的，優選超過至少20倍摩爾，更優選超過至少50倍摩爾。如本文所示，在體內使用抑制劑時，劑量一般是每千克動物體重大約5-30mg，優選大約25mg/kg ο
有效時所需的抑制劑的量可以取決于服用該抑制劑時存在的內源蛋氨酸的量。通過在實施例中所顯示的劑量滴定結果可以證實蛋氨酸濃度和抑制劑的有效濃度之間的關系，并可以通過競爭性抑制劑的典型反應速度理論進行限定。抑制劑的典型用量是從大約 10 μ M到大約ImM。
而且，通過本文所描述的體外組織培養方法能夠預測抑制劑的有效用量，這種方法包括首先采用本文所描述的任何方法在去除蛋氨酸的特殊腫瘤組織中建立有效的條件， 接著測定抑制劑的有效濃度。
使用各種指示劑包括實施例中所描述的指示劑能夠監控使用蛋氨酸競爭性抑制劑抑制蛋氨酸的代謝。這些指示劑包括在喂過不含蛋氨酸飲食的小鼠中，測定組織培養物的DNA含量，作為細胞周期停止和增強抑制腫瘤組織生長的指示劑。其他指示劑對本領域普通技術人員來說也是很清楚的。[Gin] c. Wmm^umitmi-抗番氨,11仆^tt去的協同作用
在一個方案中，為了利用在使用兩種或多種不同的蛋氨酸去除法時發生的協同作用，本發明考慮到使用常稱作抗蛋氨酸化療法的多種蛋氨酸去除法。
本文所描述的蛋氨酸去除法包括(1)使用不含蛋氨酸的培養基(體外)或飲食 (體內)的蛋氨酸饑餓法，( 暴露給蛋氨酸酶以采用酶的方法去除內源性蛋氨酸，(3)以蛋氨酸競爭性抑制劑來降低內源蛋氨酸的有效濃度，特別是與上述⑴和⑵方法的結合， 其中蛋氨酸的含量已經降低，以及(4)使用蛋氨酸的前體和本文所描述的高半胱氨酸來增加其他三種蛋氨酸去除法中的任何一種對腫瘤細胞的選擇性。
所以，對蛋氨酸的去除來說，能夠使用上述所定義的方法的任何一種組合，包括 (1) + (2)，(1) + (3)，(2)+ (3)，(1) + (2) + (3)和這四種組合的任何一種加(4)來進行本文所描述的抗蛋氨酸的化學療法。
對最大限度地去除蛋氨酸和其代謝產物來說，特別優選使用不含蛋氨酸但含有蛋氨酸前體并同時使用蛋氨酸的競爭性抑制劑和蛋氨酸酶。
III.增強抗有絲分裂劑的腫瘤治療作用在另一個方案中，本發明考慮到在方法中使用本文所述的蛋氨酸去除法來增加(增強)常規化療法的效力和選擇性，特別是癌癥治療所用的抗有絲分裂藥的選擇性。
把蛋氨酸去除步驟和常規的抗有絲分裂療法結合使用的主要目的是利用這樣一種情況即在有絲分裂之前蛋氨酸去除法能夠選擇性地并特異性地終止腫瘤細胞的增生，這樣一旦用再充分供應蛋氨酸給細胞、組織、培養基或脈管系統，靜止的細胞能夠同步開始細胞周期，使得細胞群一致增生并且容易受到對細胞周期特異性化學療法的作用。為了使腫瘤細胞進入細胞停滯期，可以使用任何細胞周期的細胞毒素劑。這種藥劑對本領域普通技術人員來說是熟知的。在一個優選的方案中，該細胞周期的細胞毒素劑是一種抗有絲分裂劑。
所以，在一個優選的方案中，本發明考慮到一種抗腫瘤化療法，它包括用本文所述的蛋氨酸去除步驟形成靜止的腫瘤細胞，接著以另外的步驟
(a)把靜止的腫瘤細胞與誘發細胞周期用量的蛋氨酸接觸來啟動靜止的腫瘤細胞的有絲分裂，形成有絲分裂細胞，和
(b)把有絲分裂細胞與一定量的抗有絲分裂劑接觸，這種用量足以抑制有絲分裂細胞的有絲分裂，由此抑制腫瘤細胞的生長。
把具有啟動靜止細胞的細胞周期功能的蛋氨酸、蛋氨酸鹽及其功能等同物稱作細胞周期誘發劑，并能夠一起使用或另一方面在去除了蛋氨酸的腫瘤細胞群中作為啟動一個或多個靜止細胞中的細胞周期和有絲分裂的試劑。
細胞周期誘發劑的誘發細胞周期的量是能夠在去除了蛋氨酸的腫瘤細胞群中至少啟動一些(10%)，優選大多數，更優選至少90%的靜止細胞中的細胞周期的用量。使用組織學的或代謝的標記物能夠很容易地測定細胞周期的啟動和程度。對蛋氨酸來說，誘發細胞周期的用量一般在大約1微摩爾(μΜ)到大約2. 5毫摩爾(mM)的范圍，優選大約10 到250 μ Μ。當充分供應蛋氨酸時，同樣地能把S期的特異性藥物用于攻擊仍在S期的任何腫瘤細胞。
把細胞周期誘發劑與靜止的腫瘤細胞接觸(使用)的途徑能夠變化，但一般與本文所描述的服用蛋氨酸酶或競爭性抑制劑所用的途徑相同。
使靜止的腫瘤細胞和細胞周期誘發劑接觸的時間安排和時期可以根據腫瘤和其他考慮的不同而變化，這種考慮是能夠根據經驗通過如本文所描述的組織培養方法來決定的。周期誘發劑能夠在抗有絲分裂劑之前或與抗有絲分離劑幾乎同時加入。當已經測定到具體抗有絲分離劑迅速起作用并且細胞周期的誘發是緩慢的時候，在抗有絲分裂劑之前加入誘發劑是有利的。這些參數取決于腫瘤的具體類型、組織的部位、抗有絲分裂劑的選擇等。而且，在使用治療方法在體內給藥之前，通過各種方法能夠很容易地測定最優化的變量如時間的選擇、劑量和藥物的選擇。優選的最優化方法是使用本文所描述的組織培養測定系統的例子。
接觸一種抗有絲分裂劑的時間安排的選擇取決于對靜止的腫瘤細胞的細胞周期的誘發。在周期的任何時候一般都能把抗有絲分裂劑與有絲分裂的細胞接觸，并馬上使細胞成為有絲分裂細胞。對有些腫瘤細胞群來說，在加入誘發劑之后這種情況可以迅速發生， 使得可以向靜止的腫瘤細胞中同時或近乎同時加入誘發劑和抗有絲分裂劑。另一方面，在加入誘發劑大約1小時到30天后可以加入抗有絲分裂劑，但是優選在誘發的一天或兩天之內。
本文所用的抗有絲分裂劑和其他細胞周期特異制劑能夠是針對細胞增生、有絲分離或細胞周期具有細胞毒性基礎的機理的任何試劑。所以，抗有絲分裂劑能夠包括各種化合物即抗代謝劑，或其他對分裂(有絲分裂的)細胞具有毒性的化合物中的任意一種。用于本發明方法中的抗有絲分裂劑的優選臨床藥理學是對細胞有絲分離活性的抑制，對核酸合成、烷化劑、抗菌素、生物堿等抗腫瘤劑的抑制。就藥理領域來說是不斷提高的，應當清楚本發明是不限于目前已知的抗有絲分裂劑和其他細胞周期特異性制劑，而是包括使用已知的等同物、新發現或開發的化合物和其他具有必要活性的試劑。
烷化劑的例子包括環磷酰胺(CTX ；癌得星)、苯丁酸氮芥(CHL ；痛可寧)、順氯氨鉬(CisP ；氯氨鉬)、二甲磺酸丁二醇二酯(馬利蘭)、左旋苯丙氨酸氮芥、卡氮芥(BCNU)、鏈脲菌素、三亞乙基密胺(TEM)、絲裂霉素C和其他烷化劑。
抗代謝產物的例子包括氨甲喋呤(MTX)、足葉乙甙(VP16 ；鬼臼乙叉甙)、6_巰嘌呤 (6MP)、6-thiocquanine(6GT)、阿糖胞甙(Ara-C)、5_氟尿嘧啶(5FU)、氮烯唑氨(DTIC)和其他抗代謝劑。
抗菌素的例子包括放線線菌素D、阿霉素(DEX ；亞德里亞霉素)、多諾霉素(柔紅霉素)、爭光霉素、光輝霉素和其他抗菌素。
生物堿的例子包括長春生物堿如長春新堿(VCR)、長春堿等。
其他抗腫瘤劑包括紫杉酚及其衍生物，抑制細胞生長劑糖皮質激素如地塞米松 (DEX ；氟美松)和皮質留類如強的松，核苷酶抑制劑如羥基脲，氨基酸去除酶如天冬酰胺酶和其他形形色色的抗腫瘤劑。
上述抗有絲分裂劑(細胞毒性劑)的合成和制備都是人們所熟知的，在各種原始資料中都有描述，所以這里就不再重復。合成和制備上述試劑的原始資料例子包括“內禾斗醫生桌面參考” (Physicians Desk Reference), Barnhart, eds.，Medical Econom ics Company, Inc.，Oradel 1, N. J.，1992 ；禾口 “Merck 索弓| ” (Merck Index)，第 11 版，Merck & Co. ，1989。
在化療方法中使用上述細胞毒素劑一般是癌癥治療領域的明顯特征，在這里使用它們，還涉及監控耐受性和有效性以及控制給藥途徑和劑量。例如，該細胞毒素劑的實際劑量可以根據使用現有的組織培養方法所測定的所培養的患者的細胞反應來變化。一般該劑量比缺乏同步的細胞周期所使用的量要降低，這正如本發明說明書中所示。
有效細胞毒素劑的典型劑量能夠在制造商所推薦的范圍內，并且由體外反應或動物模型反應所表示的劑量可降低到至多大約一個量級的濃度或用量。所以，該實際的劑量將取決于醫師的判斷，患者的身體狀況和治療方法的有效性，這種有效性以最初培養的惡性細胞或組織培養的組織樣品的體外應答性或在適當的動物模型中所觀察到的反應為準。
IV.基因療法
在另一個方案中，根據本發明的蛋氨酸酶的接觸法，本發明考慮到在組織或被治療組織周圍的淋巴細胞中使用rDNA來表達蛋氨酸酶。為得到這一結果，可以想到通過可控制的蛋氨酸酶表達基因的表達和由此，產生的蛋氨酸酶基因產物而用于接觸步驟提供蛋氨酸酶。
如前面所描述的，目前已知有大量的適當表達載體可用來表達能夠使用的蛋氨酸酶。在一個方案中，蛋氨酸酶基因的表達是可控制的。所以，一個表達載體具有能夠可操作地連接到編碼蛋氨酸酶的第一條序列的第二條核苷酸序列，這也定義了調節蛋氨酸酶基因表達的手段。這種調節手段的一個例子是可誘導的啟動子，最優選的啟動子是腫瘤特異性的。用一種腫瘤特異性的啟動子控制蛋氨酸酶基因表達的表達模型，這些表達模型對本文所述的基因療法是特別有用的。
一類可誘發的啟動子對可加入培養基中的組分有反應，或很容易地滲透到含有基因的宿主細胞中來表達蛋氨酸酶基因。其它類的啟動子是如上所述的腫瘤特異性啟動子， 例如癌胚抗原(CEA)啟動子。
所以，本發明也考慮到一種把蛋氨酸酶與腫瘤細胞群接觸的蛋氨酸的去除法，它包括下列步驟
(i)在活體內或活體外，把一種表達載體導入腫瘤細胞或導入浸潤腫瘤的淋巴細胞或其骨髓前體細胞來形成蛋氨酸酶基因轉染的細胞，其中該表達載體具有編碼蛋氨酸酶并能夠調節蛋氨酸酶的表達的核苷酸序列，并且具有能夠提供調節蛋氨酸酶表達的手段的核苷酸序列；
(ii)把體內的腫瘤細胞與蛋氨酸酶基因轉染的細胞接觸；和
(iii)在轉染的細胞中表達編碼蛋氨酸酶的核苷酸序列，由此在該轉染的細胞中產生蛋氨酸酶并把所產生的蛋氨酸酶與腫瘤細胞接觸。對本領域普通技術人員來說“導入” 是指任何已知的以一種方式把表達載體插入靶細胞的方法，其中該靶細胞可以表達該表達載體中所攜帶的基因。這種插入能夠在體內或活體外進行。通過例如轉染、轉化或病毒感染的方法可以完成這種“導入”。
使用各種已知的轉染方法能夠實現腫瘤細胞，無論是粘附細胞或是懸浮液內或體內的細胞的傳染。此后，把轉染的細胞(如果使用活體外的轉染方法)再導入宿主并使該轉染細胞定位在天然的、相關的、附近的要治療的組織，由此把轉染的細胞與要治療的腫瘤細胞接觸。使用各種手段能夠實現把蛋氨酸酶導入轉染的細胞，但是一般需要有選擇性標記存在。
在一個方案中，調節基因表達的工具是對能夠加入培養基中的試劑應答的可誘發的啟動子。如金屬硫蛋白的啟動子。另一方面，可誘發的啟動子可以是腫瘤特異性啟動子。 這種啟動子對腫瘤細胞的靶蛋氨酸酶的表達起作用。
要轉染的細胞能夠是腫瘤細胞樣品或正常免疫細胞如浸潤腫瘤的細胞，如浸潤腫瘤的淋巴細胞或骨髓的骨髓前體細胞如造血的干細胞或原始細胞。這些細胞能夠在體內或體外。
實施例9描述了編碼蛋氨酸酶的核苷酸分子的分離。該實施例還描述了用于分批酵解生產蛋氨酸酶的表達載體的產生。熟練的本領域技術人員能夠很容易地使用克隆的蛋氨酸酶基因，如在PAC-I中所提供的，來制成適用于上述基因療法的表達盒。
C.治療組合物
在另一個方案中，本發明考慮到治療組合物，它含有治療有效量的基本上分離出的、優選以重組體方法產生的蛋氨酸酶和藥物可接受的載體。
L-蛋氨酸酶(L-蛋氨酸-α-脫氨基-Y-巰基甲烷-裂合酶或蛋氨酸酶)是通過脫氨基作用和脫硫代甲基作用來降解蛋氨酸的一種酶。蛋氨酸酶的活性至少能夠通過測定在蛋氨酸裂解時所形成的α-丁酮酸鹽的量來測得。一個單位(U)的蛋氨酸酶定義為在標準測定條件下從蛋氨酸中每分鐘產生1毫摩爾α - 丁酮酸鹽的酶的量，如Ito等，“生化雜志” (Τ. Biochem.) ,79 :1263-1272,1976 ；和 ％da，“生化分析” (Analyt. Biochem.) ,25 228-235，1968中所描述的。
蛋氨酸酶可以由許多來源制備，包括直接由細菌培養基分離，或者由編碼蛋白酸酶蛋白的重組DNA分子表達，例如描述于例9和例12。
蛋氨酸酶的細菌源包括惡臭假單胞菌(Pseudomona Dutida)，卵狀假單胞菌 (Pseudomonas ovalis)和氣單胞菌菌屬(Aeromonas)和任何其他蛋氨酸酶的潛在來源。惡臭假單孢菌菌株可以商業途徑從ATCC中得到，它的入藏號分別是ATCC 8209和ATCC 7955。 其他細菌一般也能夠從學術研究團體得到。現已描述了使用各種方法純化蛋氨酸酶。例如， 參見 Kreis 等,“癌癥研究”(Cancer Res.), 33 :1862-1865,1973 ；Tanaka 等，“歐洲生物化學學會聯合會通訊” (FEBS Letters) ,66 :307-311,1976 ；Ito 等，“生化雜志” (T. Biochem.), 79 :1263-1272,1976 ；Nakayama 等，“農業生物化學” (Agric. Biol. Chem.) ,48 :2367-2369, 1984 和 Soda，“生化分析” (Analyt. Biochem.), 25 =228-235,1968。但是，這些方法都沒有得到高純度的不含內毒素的蛋氨酸酶。本發明提供了已經用于純化蛋氨酸酶的兩種方法， 這樣該蛋氨酸酶幾乎不含內毒素。
一種優選的蛋氨酸酶具有每毫克蛋白大約10到50個單位(U)的比活度。本文描述了純化蛋氨酸酶的典型制劑，該制劑具有大約10到大約50U/mg的比活度，在實施例12 中，使用表達載體pAC-Ι所制備的蛋氨酸酶具有大約20. lU/mg的比活度。
一種優選的蛋氨酸酶最好是大體上分離的。大體上分離是指該酶按重量計有至少 50%的純度，優選至少90%的純度，更優選至少99%的純度或基本上是均勻的。當在電泳介質如聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)中分析時，優選的蛋白基本是均勻的。在PAGE上的均勻是指只有單一的測定帶。
由于當通過靜脈注射或腹腔內給藥而與哺乳動物生理接觸時不希望有與內毒素有關的副作用，所以，優選的蛋氨酸酶是基本上不含內毒素如細菌性脂多糖。這里的基本上不含是指每毫克(mg)蛋氨酸酶蛋白至少于大約IOng內毒素，優選少于Ing內毒素/mg蛋氨酸酶，更優選的少于0. Ing內毒素/mg蛋氨酸酶。在治療領域內內毒素的測定是熟知的， 使用各種方法能夠進行內毒素的測定。在實施例中描述了優選的方法。
優選的蛋氨酸酶是熱穩定的，這樣當在如動物體內升高溫度的條件下使用時能夠增加它的存儲期和有效性。熱穩定是指該酶能夠在60°C下暴露10分鐘并保持其比活度達 80%優選保留90%的比活度，更優選保留95%的比活度。
優選的蛋氨酸酶具有至少5小時的血清半衰期，優選6小時，更優選至少7小時。
特別優選的蛋氨酸酶是從惡臭假單胞菌制備的或使用從惡臭假單胞菌中分離出來的含有編碼蛋氨酸酶的DNA分子的表達載體制備的。惡臭假單胞菌蛋氨酸酶在變性條件下PAGE-SDS分析時具有大約43千道爾頓的表觀分子量。在實施例中描述了純化蛋氨酸酶的優選方法。
所以，治療組合物含有一種生理上可耐受的載體和溶于或分散在其中的作為活性成分的大體上分離的蛋氨酸酶。在一個優選的方案中，當為治療目的給病人服用時，該治療組合物是非免疫原性的。
本發明的一個方案的特征是化學修飾的蛋氨酸酶，它包括結合到聚合物上的蛋氨酸酶。優選該蛋氨酸酶是大體上分離的并幾乎不含內毒素。“化學修飾”是指被改變形成與從自然中純化的蛋氨酸酶不同的任何形式的蛋氨酸酶。優選的是通過把該蛋氨酸酶連接到聚合物如聚乙二醇上的方法來化學修飾蛋氨酸酶的。
如本文中所使用的，用來指組分、載體、稀釋劑和試劑的術語“藥學可接受的”、“生理可耐受的”和它們在語法上的變化都可以交換使用，并且它們都表示能把該物質給藥哺乳動物或人類服用或在給哺乳動物或人類服用時不會產生不希望的生理作用如惡心、眩暈和胃不適等。
在本領域中對包括溶于或分散在其中的活性成分的藥物組合物的制備是非常清楚的。一般可以把這種組合物制成可注射的無菌的液體溶液如懸浮液、含水或不含水的溶液，或者在使用前也能夠配成液體的適用于溶液和懸浮液的固體形式。該制劑也可以是乳劑形式的。如本文所述的特別優選的是磷脂和脂質體組合物。另外，在油膏或分散性蓋片如繃帶上也可以含有治療量的蛋氨酸酶以提供該試劑的局部釋放。
該活性成分能夠與藥物可接受的并與活性成分可配伍的賦形劑混合，其用量應適合于本文所述的治療方法。適當的賦形劑例如有水、鹽水、葡萄糖、甘油等及其組合物。另外，如果需要，該組合物可以含有微量的能夠提高該活性成分的效果的輔助物質如濕潤劑、 乳化劑、PH緩沖劑等。
本發明的治療組合物能夠包括組分的藥物可接受的鹽。藥物可接受的鹽包括與如鹽酸或磷酸的無機酸或者象乙酸、酒石酸、苯乙醇酸等有機酸形成的酸加成鹽(與多肽的游離氨基所形成的)。與游離羰基所形成的鹽也能由無機堿例如鈉、鉀、氨、鈣或鐵的氫氧化物和有機堿如異丙胺、三甲氨、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等衍生。
在本領域對生理可耐受的載體是熟知的。液體載體的例子有除活性成分和水外不含其他物質的無菌水溶液，或含有緩沖液如生理PH值的磷酸鈉、生理鹽水或二者如磷酸鹽-緩沖的鹽水。此外含水載體還包括一種以上的緩沖鹽以及象鈉和鉀的氯化物、葡萄糖、 丙二醇、聚乙二醇和其他溶質。
如本文所述液體組合物也能夠包括與水相溶的液相和與水不溶的液相。這種附加的液相例子是甘油、植物油如棉籽油、有機酯如油酸乙酯和水包油的乳濁液，尤其是前面所述的脂質體組合物。
該治療組合物含有有效量的蛋氨酸酶，一般有效量是每治療組合物總重至少0. 1 重量百分比的活性蛋白，并優選至少大約25重量百分比。重量百分比是蛋氨酸酶與總組合物的重量比。所以，例如0. 1重量百分比是每100克總組合物0. 1克的蛋氨酸酶。
為了使蛋氨酸酶組合物能夠通過血管在體內使用，我們考慮到配制一種控制釋放蛋氨酸酶的治療組合物的方案，并任選使蛋氨酸酶蛋白不受降解和會降低治療給藥的蛋氨酸酶的血清半衰期的其他現象的影響。
所以，在一個方案中，本發明考慮到包括運送載體的治療組合物，該運送載體包括聚合物、聚合物載體、顆粒狀物、乳狀液、團聚體、離子交換樹脂、脂質體、腸包衣、介質、生物膠粘劑、微膠囊、水凝膠等載體。包括脂質體的藥物釋放載體的例子至少由Tarcha在“控制藥物釋放的聚合物”(“Polymers For Controlled Drug Delivery”)，CRC 出版社，Boca Raton, 1990中描述過。
本發明還提供了純化蛋氨酸酶的詳細方法，把該方法與其他已知的方法相比較， 它能夠提供優越的產率和純度。純化重組蛋氨酸酶，特別純化是使用含有編碼蛋氨酸酶的高效表達模塊的轉化宿主產生的蛋氨酸酶的優選方法，包括下列步驟
a)在緩沖水溶液中把含有蛋氨酸酶的轉化細胞的提取物于約40-60°C下加熱約 1-10分鐘，優選在50°C加熱1分鐘。
b)在一個GS-3轉子(Sorval 1，Du Pont)中以大約IOk到20k rpm轉速把加熱后的提取物離心分離大約15分鐘到1小時，優選在4°C大約13k rpm離心分離30分鐘；
C)使用IOmM磷酸鉀緩沖液(pH8. 3)，使用大約50k到IOOk孔徑的過濾器超濾上清液，優選為 Millipore Pre/Scale =TFF PLHK 100K 2. 5ft2 的過濾器芯子；
d)在低離子強度(大約10-50mM) KCl并在10_20mM磷酸鉀緩沖液大約pH7. 0-7. 6 的條件下進行DEAE離子交換柱層析，并收集用40-200mM的KCl梯度溶液洗脫的含有蛋氨酸酶的級分，優選使用DEAE-kpharoseFF柱；
e)在中等離子強度(大約50-100mM) KCl并在10_20mM磷酸鉀緩沖液大約 PH8. 0-8. 6的條件下進行第二次DEAE離子交換色譜層析，并收集用100_200mM的KCl洗脫的和用磷酸鹽緩沖液(PH8. 3)洗脫的含有蛋氨酸酶的級分，優選使用DEAE-瓊脂糖FF柱； 和
f)把在步驟(e)中收集的級分與能夠吸附內毒素的柱層析介質接觸，并收集洗脫液，由此從該洗脫液中除去內毒素形成不含內毒素的蛋氨酸酶，該蛋氨酸酶具有每毫克蛋白至少20個單位的蛋氨酸酶活性并且每毫克蛋白具有大約I-IOOng的內毒素，優選使用 Acticlean Etox 柱 °
該細胞提取物最好是從已被改變的能夠表達高含量的重組蛋氨酸酶(大約 5-75%總細胞蛋白)的宿主細胞制得的。另一方面，也能把天然表達蛋氨酸酶的有機物用作起始物。對細菌細胞提取物來說，制備提取物一般是首先收獲并再洗滌細菌細胞培養物來形成細胞糊/丸，并取決于是否通過離心分離方法還是空心纖維管過濾方法收獲，這些方法一般是大家所熟知的。
然后，使用常規工具把細胞碎裂。優選使用勻漿器如空化型勻漿器(例如 Microfluidics Corp. ModelifflC 8000 碎裂細胞。
把所得到的懸浮液加熱以沉淀選擇的蛋白和其他不溶物。加熱條件一般是大約 45-60 0C T 1-10分鐘。優選50 0C 1分鐘的加熱步驟。
把加熱后的提取物離心分離除去碎片，并過濾上清液再用于上述兩個步驟中的 DEAE離子交換柱層析介質。在實施例中描述了優選的吸收和洗脫條件。在這些步驟中可以使用各種DEAE離子交換柱層析介質的任何一種，并對介質的選擇不作限定。商業來源包括 Pharmacia Fine Chemicals，BioRad 禾口 Sigma0
之后，除去內毒素生產具有如前面所述的可接受含量的內毒素的蛋白。以熟知的各種工具中的任何一種都能夠進行內毒素的去除步驟，該去除步驟一般包括把溶液中的蛋白與能夠吸附內毒素的一種柱層析介質接觸，得到含有不含內毒素蛋白的柱層析介質洗脫物。用于除去內毒素的優選商業試劑是Aetielean Etox。
P.化學改良的蛋氨酸酶
為了延長蛋氨酸酶的半衰期并降低它的免疫原性或抗原性，可以把蛋氨酸酶與一種聚合物結合。
在過分敏感的個體中存在變態反應的可能性。另一方面，抗蛋氨酸酶的抗體可以縮短蛋氨酸酶的半衰期。
現已嘗試了各種途徑來解決多肽和蛋白的抗原性問題。把聚合物如聚乙二醇偶聯到蛋白上是降低蛋白抗原性的途徑之一。本發明涉及使用一種新型有效的方法生產的蛋氨酸酶的化學修飾，它包括把在保持酶活性的條件下把純化蛋氨酸酶與聚乙二醇(PEG)偶聯。本發明的PEG-蛋氨酸酶具有延長的半衰期并沒有表觀免疫原性。
新的與聚乙二醇結合的蛋氨酸酶(“PEG-蛋氨酸酶”或“PEG化的蛋氨酸酶”)具有高的蛋氨酸去除活性、延長的半衰期和低免疫原性。因此PEG-蛋氨酸酶提供了一種保持穩定性，延長血清半衰期，降低免疫原性和降低毒性的抑制腫瘤生長的新工具。
本發明穩定的、蛋氨酸去除有效的、具有長半衰期且是非免疫原性的PEG-蛋氨酸酶可以用作安全有效的多劑量抗腫瘤劑。PEG-蛋氨酸酶可以在-70°C、4°C和室溫下保存在 IOmM磷酸鈉(pH 7.2)中的0. 12M氯化鈉的液體制劑中，而不喪失活性。
重要的是，本發明PEG-蛋氨酸酶是非免疫原性的，這使得它特別適于治療對蛋氨酸酶敏感且需要重復給藥的癌癥患者。本領域普通熟練技術人員懂得，和用蛋氨酸酶一樣， PEG-蛋氨酸酶可以以多種劑型提供。
純化的沒有內毒素的蛋氨酸酶的優選制劑是以在0. 06M和0. 2M之間的濃度溶于 IOmM磷酸鈉緩沖液(pH7. 2)中的0. 12M氯化鈉溶液中。活性是大約10個單位/mg。
PEG化的蛋氨酸酶可以通過本領域普通熟練技術人員已知的方法測試。例如可以用體內試驗來測定本發明方法制備的PEG-蛋氨酸酶的藥理學、安全性和功能特征。
這些試驗可以包括測定PEG-蛋氨酸酶的急性毒性、藥物動力學、蛋氨酸在血清中的去除，以及評定PEG-蛋氨酸酶的免疫原性。
將純化的無內毒素的PEG-蛋氨酸酶注射入鼠的尾靜脈中，并每兩小時采集血樣。 通過活性測定測量蛋氨酸酶的水平。蛋氨酸衍生作用后用HPLC測定蛋氨酸酶的水平。
可以在任何合適的實驗動物體內進行急性毒性研究，如實施例5和15所說明的。 在小鼠體內將10-100單位/I-IOmg PEG-蛋氨酸酶注入其尾靜脈。記錄活體信號和目測觀察。在注射前采集血樣，并在注射后每兩小時采集血樣。測定蛋氨酸酶活性和蛋氨酸水平。 也測定腎和肝功能兩者的功能。用標準技術測定對組織如肺、腎、肝和腦有無毒性作用。也分析血樣和骨髓。
在另一實施例中，蛋氨酸酶與一聚合物結合，產生了一種基本上無免疫原性的組合物，且也導致體內蛋氨酸酶活性半衰期的增加。
在一實例中，蛋氨酸酶通過與一聚合物結合而進行了化學修飾。
在另一實例中，蛋氨酸酶通過與聚環氧烷(polyalkylene oxide)的結合作用而被化學修飾，聚環氧烷的例子包括但不限于聚環氧乙烷、聚環氧丙烷、環氧乙烷共聚物和環氧丙烷共聚物。
在優選實例中，蛋氨酸酶通過與聚乙二醇結合而被化學修飾。
在另一優選實例中，結合聚乙二醇的蛋氨酸酶基本上不含內毒素。
本發明也提供了一種藥物組合物，其含有治療有效量的與聚合物結合的蛋氨酸酶。該聚合物可以是聚環氧烷，例如但不限于聚環氧乙烷、聚環氧丙烷、環氧乙烷共聚物和環氧丙烷的共聚物。
在一優選實例中提供了一種藥物組合物，其含有治療有效量的與聚乙二醇結合的蛋氨酸酶。在另一優選實例中，藥物組合物含有治療有效量的基本上不含內毒素的且與聚乙二醇結合的蛋氨酸酶。這種組合物可以從天然生產蛋氨酸酶的生物體中分離的物質中制備，或者優選從已被改變來表達蛋氨酸酶的宿主制備。
也提供了一種制備無內毒素蛋氨酸酶的方法，所述方法是通過無內毒素蛋氨酸酶與聚合物偶聯，而生成基本上無免疫原性化學修飾的無內毒素的蛋氨酸酶。
在一優選實例中，該方法包括將蛋氨酸酶與聚乙二醇偶聯。
在另一優選的實例中，通過無內毒素蛋氨酸酶與琥珀酰亞胺碳酸甲氧聚乙二醇酯反應而進行偶聯。
也提供了一種治療腫瘤患者的方法，包括施用治療有效量的蛋氨酸酶。
在一優選實例中，蛋氨酸酶基本上無內毒素。
在另一優選實例中，蛋氨酸酶與聚合物結合。
在另一實驗中，聚合物是一種聚環氧烷。
在另一優選實例中，蛋氨酸酶與聚乙二醇結合。
E.重組蛋氨酸酶制劑
本發明進一步提供了凍干或結晶狀的蛋氨酸酶。詳細地說，已發現用本領域已知方法，蛋氨酸酶能容易地凍干或結晶。發現所得結晶或凍干形式的蛋氨酸酶制劑具有高的穩定性，易水合化，且再水化后保持高活性。
能用各種本領域公知方法來獲得結晶或凍干形式的蛋氨酸酶。在實施例中使用 Verdis,凍干裝置對，在100毫巴，-80°C，72小時，進行蛋氨酸酶的凍干和結晶，本領域熟練技術人員能容易地采用其它本領域已知的方法用于制備凍干或結晶形式的蛋氨酸酶。
F. DNA片段和載體
I.編碼蛋氨酸酶的DNA分子
已經發現當導入合適的宿主細胞中時通過可操作地連接編碼蛋氨酸酶的分離DNA 分子與啟動子，特別是RNA聚合酶啟動子如T7 RNA聚合啟動子的操作連接，重組蛋氨酸酶可以以大約總細胞蛋白質的5 75%的水平被表達。因此本發明提供了當導入合適條件下的宿主中時表達高水平重組蛋氨酸酶的高水平表達模型。
這里所使用的高水平表達模型，或本發明的表達模型是指包含一個或多個指導編碼蛋氨酸酶的可操作地連接的核苷酸序列的轉錄和翻譯的表達調控元件的核酸分子。表達模型可以是分離的核酸分子或者可以存在于載體中(下文說明)。
本發明表達模型包含指導重組蛋氨酸酶生產的調控元件，使得生產的重組蛋氨酸酶相當于大約總細胞蛋白質的5-75%，優選多于總細胞蛋白質的10%。優選的表達控制元件RNA聚合酶啟動子，更優選T7 RNA聚合酶啟動子。RNA聚合酶啟動子的另外的實施例包括但不限于Tac和Trc啟動子。
啟動子是由允許RNA聚合酶結合以及發生轉錄的DNA序列構成的表達調控元件。 與特定宿主系統相容的啟動子序列是本領域公知的，并且一般以在包含一個或幾個合適的限制酶切位點的質粒載體中提供。有代表性的這樣的質粒載體是包含T7 RNA聚合酶啟動子，PT7和PET的質粒載體，其可以從多種渠道獲得，如由商家和the American TypeCulture Collection 獲得。
本發明表達模型進一步包括編碼蛋氨酸酶的核酸序列。正如這里所使用的，當含有該序列的核酸分子的轉錄和翻譯導致具有蛋氨酸酶活性的蛋白質的產生時，就認為該核酸序列編碼蛋氨酸酶。
L-蛋氨酸酶(L-蛋氨酸-α-去氨基-Y巰基甲烷-裂合酶或蛋氨酸酶)是一種通過去氨基和去硫甲基作用而降解蛋氨酸的酶。蛋氨酸酶活性至少可以通過測定蛋氨酸裂解生成的α-丁酮酸的量而測得。一個單位(U)蛋氨酸酶被定義為在標準測定條件下每分鐘從蛋氨酸產生1微摩爾α-酮基丁酸根的酶的量，該標準條件描述于Ito等，J. Bio chem., 79 1263-1272，1976 ；和 Soda，“生化分析” (Anayt. Bio chem)。25 :228-235,1968。
編碼蛋氨酸酶核酸序列可以包括由天然生產重組蛋氨酸酶的生物體獲得的未改變的序列，也可以包括由天然生產蛋氨酸酶的生物體獲得的已被改變包括一個或多個核酸或氨基酸取代基，缺失或增加的序列。
編碼蛋氨酸酶的核酸分子，不管其改變或未改變都能由天然產生蛋白酸酶的任何有機體中制得，優選編碼蛋氨酸酶核酸分子的來源是惡臭假單胞菌O^eudomonas putida)。實施例9公開了來自惡臭假單胞菌的，編碼蛋氨酸酶核酸分子的分離與序列測定。另外優選的編碼蛋氨酸酶核酸分子的來源包括但不限于陰道毛滴蟲 (Trichomonas vaginalis)，巴西曰本圓線蟲 Nippostrongylus brasiliensis，禾口梭桿菌屬 (Fusobacterium SP.)。
蛋氨酸酶完整編碼序列可以使用各種方法由各種來源獲得，特別是上文引述的那些來源。圖8提供的蛋氨酸酶和核酸序列大大方便于從不是惡臭假單胞菌的生物體內分離編碼蛋氨酸酶核酸分子。
具體地，本領域熟練技術人員能容易地使用圖8提供的核酸序列制備寡核苷酸引物以用于從蛋氨酸表達生物中選擇性擴增編碼蛋氨酸酶的核酸分子的聚合酶鏈反應(PCR) 中。優選的以圖8提供的序列為基礎的PCR引物對是5 ‘ -GCCGGTCTGTGGAATAAGCT-3 ‘(有義)
5' -CCAGGGTCGACTCCAGCGCC-3‘(反義)
應用上述PCR引物的優選PCR變性/復性/延伸反應周期如下在95°C第一次在 95°C變性10分鐘，然后在94°C 30秒變性，在60°C退火30秒，在72°C延伸反應2小時進行 5個循環，在94°C 30秒，60°C 30秒變性25個周期，然后在72°C延伸1. 5分鐘；然后在72°C 延伸反應10分鐘，進行25個循環。PCR擴增產物是兩個區帶，收集其中的1365bp區帶，純化成插入的ONCase-lDNA。
或者，圖8核苷酸序列片段能用作探針使用現有技術由除由惡臭假單孢菌以外的有機體分離編碼蛋氨酸酶的DNA。用本領域公知方法制備和使用含大約18-20個核苷酸 (編碼大約6-7個氨基酸的一段序列)寡聚體，并用于探查在足夠嚴格以減少假陽性條件下獲得雜交的基因組DNA庫。(參見Sambrook等，“分子克隆” (Molecular Cloing)，Cold Spring Harbor Pressl989)。
用作探針或聚合物酶鏈反應(PCR)的特異性引物的DNA片段(即合成的寡核苷酸)以及編碼蛋氨酸酶的基因序列可容易地通過化學技術而合成，例如，Matteucci等(“美國化學學會雜志” J. Am. Chem. Soc. 103 :3185-3191,1981)的磷酸三酯的方法或使用自動合成方法。另外，較大DNA片段可容易地通過公知方法制備，例如合成限定DNA片段的一組寡核苷酸，然后進行雜交作用并連接寡核苷酸構成完整的片段。
除了以PCR和DNA探針為基礎的方法外，用預計為免疫原的圖8的肽片段激發的多克隆抗血清或單克隆抗體能分離編碼蛋氨酸酶的DNA分子。這樣的抗體可以用來探測由特定生物產生的表達文庫，如λ gtll庫，以從除非惡臭假單胞菌以外的生物體獲得編碼蛋氨酸酶的DNA分子。
一旦獲得自然發生的編碼蛋氨酸酶的核酸分子，本領域熟練技術人員能容易地使用隨機或位點特異性誘變方法來改變蛋氨酸酶編碼序列，以來提高表達水平，或者從已編碼的蛋氨酸酶取代，增加或缺失一個或多個氨基酸。
在一個實例中，在給定宿主細胞中改變了蛋氨酸酶編碼序列以提高重組蛋氨酸酶的表達水平，而不改變被編碼的蛋氨酸酶的氨基酸順序。特定宿主中重組蛋氨酸酶提高的表達可以通過改變存在于核酸分子中的一個或幾個密碼子而獲得，結果是得到的密碼子是經常被宿主生物用來編碼特定蛋氨酸的密碼子。改變核苷酸序列使其包含優選密碼子可以用本領域公知方法來實現，如定點誘變或者合成包含優選密碼子的核酸分子。
除影響表達的改變外，也能改變編碼蛋氨酸酶的核酸分子以便于所得蛋白質的純化。例如，如實施例中所公開的，通過改變重組蛋氨酸酶的氨基或羧基末端，以增加一段聚組氨酸序列，可以用M++瓊脂糖凝膠純化所得的融合蛋白質。
也可以改變蛋氨酸酶編碼序列使在被編碼蛋氨酸酶的氨基酸順序中引起變化，如增加，取代，或缺失一個或幾個氨基酸殘基。所得重組蛋氨酸酶優選具有導致重組蛋氨酸酶具有更好生物或生理特性的變化，如提高的活性，降低的Km，降低的免疫原性，或延長的血清半衰期。這樣被改變的類型可以合理設計或隨機發生。
當變化是以起始和產物蛋白質的氨基酸順序以及期望的生理特性為基礎的特定選擇時，所說的改變是合理設計。例如一種類型的合理設計改變是用較小疏水性殘基取代疏水性氨基酸以提高溶解性。產生合理設計改變的優選方法是應用錯配序列PCR引物延伸方法的定點誘變。
當改變不是合理選擇的時候，改變就是隨機發生的。隨機誘變技術，如化學誘變， PCR改組和接頭分區誘變，在給定蛋白質編碼序列中產生大量各種隨機的和非特定的變化。 這樣的方法可以用來從根本上改變編碼蛋氨酸酶的核酸分子。
然后按這種方式產生的重組蛋氨酸酶改變的形式用于根據本領域已知各種方法篩選期望性質。選擇使用的挑選方法取決于宿主、載體和使用的誘變方法以及待選擇的性質。
本發明進一步提供了包含一個或幾個本發明表達模型的載體。載體是能在宿主中自主復制的DNA分子。載體可以包含由自然存在質粒衍生的附加型復制起點，基因組復制起點，或者能從病毒基因組衍生。本發明表達模型插入的載體的選擇如本領域公知的，直接取決于期望的功能特性，例如蛋白質表達，和要轉化的宿主細胞。
在一實施方案中，載體包括一原核復制子。原核復制子如ColEl復制子是本領域公知的且容易地用在與本發明表達組件的結合中。另外，載體可以包括編碼可選擇標記如抗藥性的基因。
真核表達載體也可以用在與本發明表達組件的結合中。真核細胞表達載體是本領域公知的并可從一些商業機構獲得。有代表性的這樣的載體是PSVL和 pKSV-10(Pharmacia) , pBPV_l/pML2d(International Biotechnologies, Inc.), pTDTl (ATCC，#31255)，本文說明的載體pCDM8，和類似的真核表達載體。高水平表達載體能進一步用昆蟲細胞表達體系產生，如以桿狀病毒為基礎的表達體系。
一般情況下，編碼蛋氨酸酶高表達組件的產生典型地包括以下內容
首先獲得編碼蛋氨酸酶的DNA。如果期望的來自細菌源的序列沒有被內含子間斷， 則其適合于在任何宿主中表達。該序列可以通過在蛋氨酸酶編碼序列旁側區插入包含一個或幾個限制性內切酶位點的序列而改變成易于切割和回收的形式。
然后，被切割或回收編碼序列與具有高表達控制元件的可操作連接，優選置于可復制表達載體中。然后用表達組件或載體轉化合適的宿主，并且被轉化宿主在實現重組蛋氨酸酶生產的條件下培養。任意地將重組蛋氨酸酶從培養基中或從細胞中分離出來。在一些例子中蛋白質的回收和純化不一定是必須的，其中可以允許一些雜質存在。
上面步驟中的每一步可以以各種方式進行。例如可以從基因組片段獲得所期望的編碼序列并直接用于合適的宿主。各種宿主中可操作的表達載體的構建是使用兩個或多個合適的復制子和控制元件進行的。如果通常可得的，合適的限制酶切位點可以被加到編碼序列的終端，這樣提供一個插入到這些載體中的可切割基因。
II. ■鹿糊胞廉汰高終翻
本發明進一步提供用本發明表達組件或載體轉化的宿主細胞，從而生產大約總細胞蛋白質的5-75%重組蛋氨酸酶，優選占總細胞蛋白質量的大約10%以上。宿主細胞可以是原核或真核宿主。
任何原核宿主可以用來表達本發明高水平蛋氨酸酶編碼組件。優選的原核宿主是大腸桿菌(E.coli)。在下面的實施例中，使用了大腸桿菌的DH5 α和BL21(DE 3)菌株。
優選真核宿主細胞包括昆蟲細胞，酵母細胞和哺乳動物細胞，優選昆蟲細胞如SP6 和脊椎動物細胞，如那些來自小鼠、大鼠、猴、或人成纖維細胞系的細胞。其它優選真核宿主細胞包括從ATCC獲得的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞CCL61，從ATCC獲得的NIH瑞士鼠胚胎細胞NIH/3T3(CRL 1658)，幼倉鼠腎細胞(BHK)及類似的真核組織培養細胞系。
通過通常有賴于所使用宿主和載體類型的已知方法實現用本發明高水平表達重組組件對合適宿主的轉化。對于原核宿主細胞的轉化，優選對宿主細胞進行電穿孔或鹽處理方法，例如參見 Cohen 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 :2110,1972 ；和 Maniatis 等， “分子克隆，實驗指南” (Molecular Cloning, Alaboratory Mammal), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor，NY (1982)。
關于真核細胞的轉化，優選電穿孔或使用陽離子脂質，例如參見Graham等， Virol. 52 =456,1973 ；和 Wigler 等，“美國國家科學院院刊” (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 76 1373-76，1979。
成功轉化的細胞，即包含本發明表達組件的細胞可以用已知技術鑒別。例如由本發明表達組件的導入而產生的細胞可以被克隆制備單菌落。可以收獲、溶解來自這些菌落的細胞并用已知方法檢查它們DNA中rDNA的存在，所述方法由Southern，“分子生物雜志” (J. Mol. Biol) ,98 :503，1975，或 Berent 等，“生物技術” (Biotech.) 3 :208,1985 描述。 然而正如下文所說明的，本發明進一步提供了鑒別表達高水平重組蛋氨酸酶的轉化子的快速篩選方法。
III.鑒定表汰高水平重的宿t
本發明進一步提供鑒定能以5-75%總細胞蛋白質的水平生產重組蛋氨酸酶的轉化宿主細胞。具體地，發現將大約5-75%的總細胞蛋白質表達成重組蛋氨酸酶的轉化宿主細胞具有明顯的可觀察到的粉紅色。當用大腸桿菌作為宿主時特別明顯。
為鑒定表達高水平重組蛋氨酸酶的轉化宿主細胞，讓轉化細胞在培養基上或培養基中在重組蛋白質被表達的條件下生長，并目測檢查生長的細胞。基于粉紅色的顯示來檢測和選擇和生長細胞或菌落。
為使用本發明方法選擇，使生長轉化宿主細胞生長，可使用許多培養/生長條件。 生長培養基的成分決定于所用的宿主/載體的營養需要以及用于鑒定與重組蛋氨酸酶高水平表達有關的粉紅色的檢測系統并從而可以分離高水平表達克隆。優選的培養基是轉化宿主細胞在其上可以平鋪，以單獨的菌落生長的固體培養基，每一個單菌落都來自單個宿主中。檢定高水平表達克隆的優選方法是目測生長菌落。
IV. _▲鴨汰鵬爐翻
本發明進一步提供生產重組蛋氨酸酶的方法。具體地，應用用一個或幾個本發明高水平表達組件轉化的宿主能以工業化大量生產重組蛋氨酸酶。這種被轉化宿主以大約 5-75%總細胞蛋白質的水平表達重組蛋氨酸酶。使用本發明宿主，本領域熟練技術人員能容易地用本領域已知方法生產用于各種診斷和治療方法中的重組蛋氨酸酶。
純化用包含編碼蛋氨酸酶的高水平表達模型的轉化宿主生產的重組蛋氨酸酶，或純化自然生產蛋氨酸酶的宿主生產的重組蛋氨酸酶的優選方法包括下面步驟
a)將含有蛋氨酸酶的轉化細胞提取物的含水緩沖液，在大約40-60°C加熱大約 1-10分鐘，優選50°C加熱1分鐘；
b)在GS-3離心機轉子(Sorval 1, Dvpont)上以大約IOk至20k rpm將加熱的提取物離心大約15分鐘至1小時，優選在4°C以大約13k rpm離心大約30分鐘；
c)使用大約50k至IOOk孔徑的過濾器將上清液超濾，優選用IOmM磷酸鉀緩沖液 (pH8. 3)的 Millipore Pre/Scale :TFF PLHK 100K 2. 5ft2 柱體；
d)進行DEAE離子交換柱層析，用大約pH7. 0-7. 610_20mM磷酸鉀緩沖液中的低離子強度(大約10-50mM)KCl，收集含有40-200mM KCl梯度洗脫的蛋氨酸酶的級分，優選使用 DEAE-瓊脂糖FF柱；
e)在大約pH8. 0-8. 6 10_20mM磷酸鉀緩沖液中的中等離子強度(50_100mM)KCl中進行第二次DEAE離子交換柱層析，并收集含有用磷酸鹽緩沖液(pH 8.3)、100-200mM KCl 洗脫的蛋氨酸酶的級分。優選使用DEAE-瓊脂糖FF柱；
f)將步驟(e)中收集的所述級分與能吸附內毒素的柱層析基質接觸，并收集洗脫液，從而從e)步驟所述洗出液中除去了內毒素，生成了每毫克蛋白質具有至少20 單位蛋氨酸酶活性和每mg蛋白質只含I-IOOng內毒素的無內毒素蛋氨酸酶，優選使用 Acticlean Etox 柱 °
細胞提取物優選從已被改變來表達高水平重組蛋氨酸酶(大約5-75%總細胞蛋白質)的宿主細胞制備。對于細菌性細胞提取物，提取物一般通過首先收獲并沖洗細菌細胞培養物生成細胞團/丸粒(取決于收獲是用離心作用或者是用中空纖維過濾，兩種方法一般是已知的)來制備。
然后用常規方法破碎細胞，優選使用勻漿器破碎細胞，如空腔型勻漿器，例如 Microfluidics Corp. ModelifflC 8000。
加熱所得懸浮液，以沉淀選擇的蛋白質和其它不溶性物質。典型的加熱條件是在大約45-60°C加熱1-10分鐘，優選步驟是在50°C加熱1分鐘。
離心加熱的提取物，去除碎屑，濾出上清液，并如上文所述以兩步驟加樣到DEAE 離子交換層析基質上。優選的吸附和洗脫條件見實施例。在這些步驟中可以使用各種DEAE 離子交換柱層析基質，基質的選擇不認為是限定條件。商業上的來源包括Wiarmacia Fine Chemicals，BioRadJfI Sigma0
此后，去除內毒素，生產上文提出的具有可接受水平內毒素的蛋白質。內毒素去除步驟可以用各種已知方法進行，一般包括使溶液中的蛋白質與能吸附內毒素的柱層析基質接觸，得到含有無內毒素蛋白質的柱層析基質洗脫液。用于除去內毒素的優選商售試劑是 Acticlean Etox。
G.帖鮮胱白句心血辦良
本發明的另一方面是蛋氨酸酶用于除去高半胱氨酸治療。
高半胱氨酸過高與各種類型心血管病相關。這些疾病與高半胱氨酸的關系是 McCully在1969年首次發現的(McCulIy，KS，“美國病理學雜志” (Am. J. Pathol.) 56 111- ，1969)。McCully發現了升高的血漿高半胱氨酸濃度和動脈硬化疾病之間的關系。最近由Framingham Heart Study對1041人進行的研究發現升高的高半胱氨酸血漿水平引起動脈硬化增加的危險(Selbub，J.等，“英國藥學雜志” (N. Engl. J. )Med. 32 :286-91,1995)。 其它研究甚至將中等的高半胱氨酸血過高與外周血管，腦血管和冠狀心臟病疾病聯系起來 (Kang，S.等，“營養學進展年刊” (Annu. Rev. Nutr.) 12 =279-98,1992)。例如血管疾病患者空腹高半胱氨酸濃度比正常人高31%。血漿高半胱氨酸濃度超過正常值上限12%既與患心肌梗塞形成危險增加3. 4倍相關(Stampfer，Μ.等，“美國醫學協會會刊”(JAMA) 268 877-81，1992)。高半胱氨酸代謝作用機理的研究發現，對2000多名受試者中，20例對照和跨地域研究表明，患中風或其它心血管血液病的患者具有比沒有心血管疾病受試驗者更高的高光胱氨酸的血液水平。這與大多數心肌梗塞患者具有正常膽固醇水平的事實相反。在 “內科健康研究” (Wiysicians Health Study)發現了令人矚目的結果，預期表明，自后來被診斷患心肌梗塞的271名男性身上在患心肌梗塞之前取出的血樣中具有明顯高于未患心肌梗塞相當的對照組中的高半胱氨酸平均基礎線水平。(Ueland，P.等，“心血管疾病止血和內皮功能，，Cardiovascular Disease Hemostasis and Endothelial Function, New York Marcel Dekler ； 183-236，1992)。盡管有多種條件能引起高半胱氨酸水平的升高，但不管代謝原因是什么，存在高水平高半胱氨酸與血管疾病之間的關系。在一定向研究中，在狒狒體內誘發血管損傷，并用高半胱氨酸對狒狒輸注三個月(Ueland，P.等，上文)。通過口服蛋氨酸后測定患者體內高半胱氨酸水平來診斷高半胱氨酸過高。口服蛋氨酸激發后在動脈硬化患者體內不正常的高半胱氨酸血漿濃度是正常者的12倍(Ueland，等，上文)。用HPLC測定能方便快捷地測定血漿高半胱氨酸水平。研究表明40%的人口可能有升高的高半胱氨酸水平，有患心血管病的危險(Stampfer，M.和Malinow，M.，“新英格蘭醫學雜志” (New Engl. J. Med.) 332 :326-3291995)。高半胱氨酸血過高在誘發動脈硬化疾病方面具有急性作用，使個體有患心肌梗塞和腦血管病的危險。急救醫療介入表明上述個體的大部分有患心血管疾病的危險。本發明蛋氨酸酶可以作為急救醫療中一個可選擇的治療方法，可馬上降低有患病危險的人的高半胱氨酸水平。蛋氨酸酶催化兩種反應，不只在蛋氨酸中而且也在高半胱氨酸中酶解N-C鍵和γ C-S鍵(Hoffman，“生物技術和生物物理學”(Bioch. et Biophys.) Acta, “癌癥研究回顧”(Reviews on Cancer)，738 =49-87,1984)。圖7說明高半胱氨酸和蛋氨酸代謝的代謝循環。維生素B-12，B-6，和葉酸鹽影響圖中說明的循環的左側，對用蛋氨酸酶治療后保持一些人的正常高半胱氨酸水平是有幫助的。而循環的右側不取決于這些維生素的水平。在循環的右側，蛋氨酸的存在通過升高的甲基轉移反應導致過量高半胱氨酸水平，其可以導致癌癥以及動脈硬化疾病。對于循環右側不正常的患者，保持和短期使用蛋氨酸酶是必要的，可保持高半胱氨酸的正常水平。對于心血管疾病，蛋氨酸酶對蛋氨酸和高半胱氨酸兩者的底物特異性是重要的。蛋氨酸酶可降低高半胱氨酸前體蛋氨酸的水平，也可以直接降低高半胱氨酸水平。本領域現有研究只建議使用維生素B-12，B-6和葉酸鹽作為治療劑來降低過高的高半胱氨酸血。如圖7所示，只表明這些維生素沒有矯正任何該循環右側中的不正常癥狀，也沒有降低該循環右側不正常的患者體內的高半胱氨酸水平。本發明包括用蛋氨酸酶治療患心血管疾病患者的方法。
一方面，提供了治療患心血管疾病患者的方法，包括給患者施用治療有效量的蛋氨酸酶。
用于高半胱氨酸去除的蛋氨酸酶的治療有效量是預測量，計算達到所期高半胱氨酸去除的水平，從而，例如，降低患動脈硬化的危險性。
因此，本發明蛋氨酸酶給藥的劑量范圍是足以產生所期效果的量，所期效果例如是降低患動脈硬化的危險或水平。劑量不應大至引起副作用，如粘滯性過高，綜合癥，肺水腫，充血性心力衰竭等等。一般情況下劑量根據患者的年齡，癥狀，性別和疾病發展程度而不同，這是本領域熟練技術人員能夠決定的。
劑量可以在任何復雜的情況下由醫生確定。
本發明蛋氨酸酶的治療有效量一般是當以生理相容組合物給藥時足以使血管內 (血漿)或局部蛋氨酸酶的濃度是大約0. 001至大約100U/ml，優選高于大約0. lU/ml，更優選高于lU/ml的量。給藥的一般劑量決定于體重，并且是在大約5-1000U/kg/天，優選大約 10-50U/kg/天，更優選大約20-40Ukg/天的范圍內。
在優選方法中，所用蛋氨酸酶基本上無內毒素，如上文詳細討論的。特別優選的是使用本發明生產的蛋氨酸酶，其來自重組源且基本上不含內毒素。
可以使用本領域普通熟練技術人員已知的方法給藥，且在本說明書中進行了說明。
本發明的另一方面是通過施用治療有效量的基本上不含內毒素且與聚合物結合的蛋氨酸酶來治療患心血管疾病的患者。在一優選方面，該聚合物是聚乙二醇。本發明另一優選方面是所述心血管疾病是動脈硬化。本發明的另一方面是給顱外頸動脈狹窄，外周血管，腦血管，冠狀心臟病和閉塞性血管疾病患者給藥蛋氨酸酶。
本發明的另一方面是提供了一種通過對患者給藥治療有效量的蛋氨酸酶來治療高半胱氨酸血過高患者的方法。所述蛋氨酸酶基本上不含內毒素且與聚合物如聚乙二醇結I=I O
本發明也提供了降低患者體內高半胱氨酸水平的方法，包括對患者給藥治療有效量的蛋氨酸酶的步驟，其中所述蛋氨酸酶基本上不含內毒素。本發明另一方面是提供了一種預防患者發生心血管疾病的方法，包括對患者給藥治療有效量的蛋氨酸酶的步驟。在一優選方面，給與患者的蛋氨酸酶基本上無內毒素。另一優選方面，所述蛋氨酸酶與一聚合物結合。再一方面提供預防患者發生心血管疾病的方法，包括對患者給藥治療有效量的蛋氨酸酶的步驟，所述蛋氨酸酶基本上無內毒素，并且還和聚乙二醇結合。實施例7提供了體內高半胱氨酸去除的例子。
H.蛋氨酸酶應用于腫瘤顯像
本發明另一方面提供了診斷患者體內腫瘤的方法，包括通過對患者給藥蛋氨酸酶，去除患者體內1V蛋氨酸，然后通過給與患者11C蛋氨酸來充實患者體內的蛋氨酸，最后測定患者腫瘤細胞中存在的11C蛋氨酸，11C甲基化作用可以通過例如但不限于正電子發射斷層顯象(PET)掃描的方法來檢測。本領域普通熟練技術人員熟悉其它檢測癌細胞攝入的 11C的方法。這些方法描述在，例如，Lapela等，“核醫學雜志” (J. Nucl. Med.) 35 =1618-23, 1994 ；Miyazawa 等，“核醫學雜志” (J. Nucl. Med.) 34 :1886-91,1993 ；Leskinen-Kallio 等，“核醫學雜志” CJ. Nucl. Med.) 33 :691-95,1992 ； Shields 等，“核醫學雜志” (J. Nucl. Med.) 33 :581-84,1992 ；Huovinen 等；“英國癌癥雜志” (Brit J. Cancer) 67 :787-91,1993 ； Dethy 等，“核醫學雜志” (J. Nucl. Med.) 35 1162-66，1994 ；Lindholm 等，“核醫學雜志” (J. Nucl. Med.) 34 :1711-16,1993 ；Leskinen-Kallio 等，“核醫學雜志” CJ. Nucl. Med.) 32 1211-18，1991 ；禾口 Mineura 等，“核醫學雜志” (J. Nucl. Med.) 32 :726-28,1991，這里一起引作參考。
本發明優選方面，所提供的蛋氨酸酶基本上無內毒素。
本發明另一優選方面是，所述蛋氨酸酶是與聚合物，如聚乙二醇結合的。實施例
下面涉及本發明的實施例是詳細說明而不作為對本發明的特別限制。而且，在本領域熟練技術人員可預見范圍內的現在已知的或者以后可發展的本發明的這些變化被認為在下文所要求的本發明的范圍內。
實施例1
擴大生產蛋氨酸酶
惡臭假單孢菌株，被改良并如下挑選卡那霉素抗性，和高水平表達蛋氨酸酶的菌株
于1993 年 10 月從 ATCC 購得 ATCC 8209 惡臭假單孢菌(Pseudomonas putida)和 ATCC 77100大腸桿菌。ATCC 77100在含有50 μ g/ml卡那霉素的LB (Sambrook等，“分子克隆，實驗指南”(Molecular Cloning =ALaboratory manual) A. 1，1989)中生長。從 ATCC 77100中分離質粒pCN 51，一種包含能在惡臭假單孢菌(P. putida)和大腸桿菌(E. coli) 兩者中復制的卡那霉素抗性基因的穿梭質粒(Nieco等，Gene 87 145-149，1990，這里引作參考)，并用Triton-溶菌酶方法(Sambrook等，“分子克隆，實驗指南”(Molecular Cloning :A laboratory manual) 1. 29-1. 30,1989)純化。ATCC 8209 在 LB 培養基中生長， 并用標準轉化方法用PCN 51轉化，所述標準轉化方法如描述在例如Sambrook等，“分子克隆，實驗指南” (Molecular Cloning :a laboratory manual.) 1. 74-1. 84，1989 中的那些方法。卡那霉素抗性菌株在LB培養基中用卡那霉素(100yg/ml)挑選，并進一步在LB板 (Sambrook 等，“分子克隆，實驗指南”(Molecular Cloning =Alaboratory manual) Α. 1_Α· 4， 1989)上在100 μ g/ml卡那霉素中生長。單一菌落在含有100 μ g/ml卡那霉素的LB中生長過夜，然后置于高蛋氨酸酶表達條件下10^1^,0.1%磷酸鉀緩沖液(pH 7. ，0.1%尿素，0. 025%酵母提取物，0. 01%硫酸鎂和有50 μ g/ml卡那霉素的0. 25%蛋氨酸，培養M小時。用本說明書說明的標準蛋氨酸酶測定方法測定蛋氨酸酶的表達。挑選過量生產蛋氨酸酶的惡臭假單孢菌菌株(Pseudomanas putida)并命名為AC_1。
然后應用AC-I惡臭假單孢菌菌株(I^eudomonas putida)進行擴大生產的發酵過程。AC-I單一菌落在含有50 μ g/ml卡那霉素的LB板上生長。以250rpm/min振搖速度在將挑選的菌落在5ml含50 μ g/ml卡那霉素的LB中溫育18小時。以200rpm/min 震搖速度在26°C將2ml細菌在600ml含50 μ g/ml卡那霉素的LB中擴增6小時。然后以 100rpm/min搖蕩在將50ml細菌在2升含50 μ g/ml卡那霉素的LB中溫育過夜(18小時)。然后讓2升細菌(OD600L 2-1. 6)在40升罐中在含有10%LB,0. 磷酸鉀緩沖液(pH 7. 2)，0. 甘油，0. 尿素，0. 025%酵母提取物，0. 01%硫酸鎂和0. 25%蛋氨酸的特定培養基中，在高通氣條件下，在26°C生長M小時。0D_達到1. 2-1. 8且活性達到20-30單位 /升。收獲的細胞最佳密度是1. 5-1. 80D_，具有2-;3mg/l蛋氨酸酶，這相當于Ikg濕細胞 /400升。優選地，使用大約產率Ikg濕細胞/10-20升的裝備完善的發酵罐。保持溫度4°C， 用 AGT 柱(UFP-500-E-55 型柱體，A/G Technology Corporation)收集細胞，然后在 4°C，以 9krpm，用自動冷凍離心機(Sorvall Superspeed RC2-B)離心10分鐘。然后收集細胞片狀沉淀物。
然后將細胞懸浮于提取溶液QOmM磷酸鉀，pH 9.0)中，密度為500克濕細胞/升， 三次用空腔勻漿器(Microfluidics Corp. ModelifflC 8000)破碎細胞。細胞破碎后立即將勻漿物在-800°C下保存。勻漿物中蛋氨酸酶的比活度是0. 08 0. 1單位/mg蛋白。
將AC-I勻漿物懸浮于提取緩沖液(IOmM磷酸鉀，pH 7. 2，10 μ M磷酸吡哆醛， 0.01% β-巰基乙醇，ImM EDTA和20%乙醇)，并在50°C加熱2分鐘。加熱步驟可以進行任何長的時間，足以沉淀熱敏感雜質蛋白而保持蛋氨酸酶活性。懸浮液在4°C以12krpm離心30分鐘。收集上清液并用MiIliporePr印/Scale-TFF PLHK 100k 2. 5ft2柱體超濾。然后將PH調至7. 2。
大約25-35g總蛋白質的10L提取緩沖液(IOmM磷酸鉀緩沖液pH 7. 2，IOym磷酸吡哆醛和 0. 01% J-巰基乙醇)樣品施加到 10cmX50cmToyopear(DEAE-650M柱(Toso Haas Japan)上，該柱用IOmM磷酸鉀緩沖液(pH7. 2)預平衡。該柱先用含有IOym磷酸吡哆醛和0. 01 % β -巰基乙醇的40mM氯化鉀的IOmM磷酸鉀緩沖液(pH7. 2) 20-30L預沖洗，直至 OD280降低至0. 1以下。然后將氯化鉀在提取緩沖液自初始濃度40mM提高至300mM，對柱子進行線性梯度洗脫。收集了 400ml洗出級分。用本說明書說明的蛋氨酸酶活性測定來測定含蛋氨酸酶的級分并集中。用含有相同濃度磷酸吡哆醛和β-巰基乙醇的IOmM磷酸鉀緩沖液，ρΗ8. 3，和150mM氯化鉀將集中的級分預平衡比。
將從DEAE-650M(5CmX20Cm)柱的蛋氨酸酶峰得到的大約l_2g總蛋白質的緩沖液樣品施加到DEAE-S印hadex A 50柱上，所述緩沖液含有IOmM磷酸鉀pH8. 3，150mM氯化鉀，10 μ M磷酸吡哆醛和0.01% J-巰基乙醇。用含10 μ M磷酸吡哆醛和0.01% β-巰基乙醇的IOmM磷酸鉀緩沖液(ρΗ8. 3)中的150_500mM KCl線性梯度洗脫該柱，收集150ml洗出級分。集中用本文說明的活性測試測定的含蛋氨酸酶的級分。然后進一步純化集中的蛋氨酸酶以去除內毒素。通過在0. 12M氯化鈉和pH7. 1的IOmM磷酸鈉緩沖液中透析將樣品預平衡。將樣品力口至Ij 5cmX 15cm Acticlean Etox 樹月旨柱(Sterogen Bioseparations, Arcadia, CA)上。然后用相同緩沖液從柱上洗脫酶，收集具有蛋氨酸酶活性的洗出級分，然后測定洗出級分中內毒素含量。表1給出該純化方法的結果。
表1擴大生產蛋氨酸酶的方法
權利要求
1.一種化學修飾的蛋氨酸酶，它含有結合到聚合物上的蛋氨酸酶。
2.權利要求1的化學修飾的蛋氨酸酶，其中的聚合物是聚亞烷基氧化物。
3.權利要求2的化學修飾的蛋氨酸酶，其中的聚亞烷基氧化物是聚乙二醇。
4.權利要求1的化學修飾的蛋氨酸酶，其中的蛋氨酸酶基本上不含內毒素。
5.分離出的結晶型蛋氨酸酶。
6.分離出的凍干型蛋氨酸酶。
7.分離出的蛋氨酸酶，具有至少大約20個單位/mg的比活度和用HPLC分析所測定的純度至少大約95%。
8.一種治療組合物，它含有治療有效量的權利要求1-7中任一項的蛋氨酸酶。
9.一種治療腫瘤患者的方法，它包括將治療有效量的權利要求8的蛋氨酸酶組合物給患者服用的步驟。
10.一種診斷患者腫瘤的方法，它包括下列步驟a)通過給患者服用蛋氨酸酶來去除患者體內的1V蛋氨酸；b)通過給患者服用11C蛋氨酸來給患者體內充分供應蛋氨酸；和c)測定患者體內腫瘤細胞中存在的11C蛋氨酸升高的水平。
11.權利要求10的方法，其中的蛋氨酸酶是權利要求8的組合物。
12.一種給患者治療或預防心血管疾病的方法，它包括給該患者服用治療有效量的蛋氨酸酶的步驟，其中的蛋氨酸酶基本上不含內毒素。
13.權利要求12的方法，其中的蛋氨酸酶是權利要求8的組合物。
14.權利要求12的方法，其中的心血管疾病是動脈硬化。
15.一種降低患者高半胱氨酸含量的方法，它包括給該患者服用治療有效量的蛋氨酸酶的步驟，其中的蛋氨酸酶基本上不含內毒素。
16.權利要求15的方法，其中的蛋氨酸酶是權利要求8的組合物。
17.—種編碼蛋氨酸酶的高效表達模型，該模型含有操作性連接啟動子序列的編碼蛋氨酸酶的核苷酸序列，其中該啟動子序列能夠引導宿主細胞中蛋氨酸酶的表達，使得蛋氨酸酶的表達是該宿主細胞所生產的總蛋白的5-75%左右。
18.權利要求17的表達模型，其中該啟動子是一種RNA聚合酶的啟動子。
19.權利要求18的表達模型，其中該啟動子是T7RNA聚合酶的啟動子。
20.權利要求17的表達模型，其中該編碼蛋氨酸酶的核苷酸序列是從選自于惡臭假單孢菌(Pseudomonas putida),陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis),巴西日圓線蟲(Nippostrongylus brasiliensis)禾口梭形桿菌屬(Fusobacteriumsp.)中的有機體中分離的。
21.權利要求20的表達模型，其中的核苷酸序列是圖8中提供的和其簡并形式。
22.權利要求21的表達模型，其中圖8的簡并形式的核苷酸序列包括已被改變的圖8中所提供的序列，該序列包括在大腸桿菌(E.coli.)中較常用的一個或多個密碼子。
23.一種用權利要求17的表達模型轉化的宿主細胞。
24.權利要求23的宿主，其中的宿主是大腸桿菌。
25.權利要求M的宿主，其中的宿主是大腸桿菌(E.coli.)BL21(DE3)。
26.—種載體，它含有權利要求17的表達模型。
27.一種分離出的核酸分子，它含有圖8中所提供的核苷酸序列和一個或多個在蛋氨酸酶的C-或N-端編碼兩個或多個組氨酸殘基的核酸序列。
28.一種鑒別高效表達蛋氨酸酶的轉化宿主細胞的方法，該方法包括下列步驟在表達蛋氨酸酶的條件下培養轉染的宿主細胞；和選擇粉紅色的轉化宿主細胞。
29.權利要求觀的方法，其中的宿主細胞是大腸桿菌(E.coli)。
30.權利要求四的方法，其中的宿主是在固體培養基上培養的。
31.權利要求觀的方法，其中所述的選擇性宿主產生大約為總細胞蛋白的5到75%的蛋氨酸酶。
32.一種改良的基因療法，其中的改良包括使用權利要求17的表達模式。
33.權利要求32的方法，其中由腫瘤特異性啟動子控制該表達模型的表達。
34.一種純化蛋氨酸酶的方法，該方法包括下列步驟a)在表達蛋氨酸酶的條件下培養表達蛋氨酸酶的宿主；b)在大約40-60°C下加熱含蛋氨酸酶的轉化細胞的提取物的含水緩沖液大約1-10分鐘；c)在GS-3轉子(Sorval，DuPont)中以大約IOk到20k rpm把加熱后的提取物離心分離大約15分鐘到1小時；d)使用大約50k到IOOk孔徑的過濾器超濾上清液；e)在低離子強度(大約10-50mM)KCl大約pH7.0-7. 6的條件下進行DEAE離子交換柱層析，并收集用大約40-200mM的KCl梯度溶液洗脫的含有蛋氨酸酶的級分；f)在中等離子強度(大約100-200mM)KCl大約pH8.0-8. 6的條件下進行第二次DEAE離子交換柱層析，并收集用0. 1-0. 2M KCl的磷酸鹽緩沖液洗脫的含有蛋氨酸酶的級分；g)把在步驟(e)中收集的級分與能夠吸附內毒素的柱層析介質接觸；和h)收集含有蛋氨酸酶的洗脫液。
35.權利要求34的方法，其中所收集的蛋氨酸酶具有每毫克蛋白至少10個單位的活性并且每毫克蛋白具有大約I-IOOng的內毒素。
36.權利要求34的方法，其中在步驟(g)中使用Aeticlean Etox柱。
全文摘要
本發明的蛋氨酸酶在抗蛋氨酸和抗高半胱氨酸的化學治療中的應用。本發明提供了重組宿主細胞，包含編碼蛋氨酸酶的表達模型，該表達模型包含編碼操作連接到啟動子序列上的蛋氨酸酶的核苷酸序列，其中所述啟動子序列能夠引導在宿主細胞中蛋氨酸酶的表達，使得蛋氨酸酶的表達是該宿主細胞所產生的總蛋白的5-75％。本發明進一步提供了生產蛋氨酸酶的方法和鑒別表達高含量的蛋氨酸酶的重組宿主細胞的方法。
文檔編號A61PGK102552933SQ201210029688
公開日2012年7月11日 申請日期1996年6月7日 優先權日1995年6月7日
發明者瓦萊利.里什科, 譚玉英 申請人:抗癌公司