專利名稱：一種酶轉化生產l-半胱氨酸的方法
一種酶轉化妒L"半胱氨酸的旅
fe^領域本發明屬于氮基酸的生產技術領域，涉及一種惡臭j段單胞菌(/^油mo,戸Mi ) 酶法轉{鵬物^ L-半胱氨酸的方法。
背景技術：
L-半胱氨酸(L-cysteine)是構成蛋白質的20多種氨基酸中具有活性硫(巰基)的 氨基酸，目前已在醫藥、食品添加劑和化妝品中廣泛應用。在醫藥方面，半胱氨,其衍生物可用 于肝臟藥和解毒藥、解熱鎮麟、潰瘍治療藥、疲勞恢復劑、輸艦綜合錢酸制劑，特別是繊 藥。在食品方面，半胱氨酸可用作面包發酵助劑。在化妝品方面主要用于繊精、防曬霜、養發精、 生勤JC。由于在大多,微生物體內，巰基來源于硫酸根離子，M^酸根離子可還原為某種硫化物， 因此柳隹用微生物發離制取L-半胱氨酸。我國對L-半胱氨酸的妒主要依靠毛發M;K解后提取 L-胱氨酸，然后將L-胱氨酸經化學或電解還原制備得到L-半胱氨酸，4發中胱氨酸，含鬆勺為14%， 國內目前毛勤乂角對去的最高收率約為4.5至5.5%。用毛發,制取L-半胱氮酸收率低，倉嫩高,水 解戰呈產婦隹聞氣體及大量廢酸，環境污染嚴重；另外，由于衛生問題，從毛發提取的產品不符合 醫藥的l頓標準。而微生物酶法轉化妒L半胱氨酸具有特異性強，妒工藝簡單，副反應和畐U產 物少，對環境污染的禾號低靴點，將具剤艮好的發展前景。

發明內容本發明目的是解決現有技術中存在的收率低，旨繼高，環境污染嚴重等問題，衝共一 種微生物酶法轉皿物^ L"半胱氮酸的方法。
本發明JK共的一種以惡臭假單胞菌(Amfowomy p"/z'必)TS-1138全細胞為酶源，酶法轉化 DL-2-氮基-A2噻i^lfr4羧酸(DL"2-Amino-A2lhiazoline4"Carboxylic Acid， DL-ATC)合成L-半胱 氨酸的方法，包括
A. 將惡臭假單胞菌TS-1138進行常規擴大培養
(惡臭假單胞菌(尸犯^b柳膨戸ft'必)TS1138曾于2006年11月在《生tJ^術通訊》第17 巻第6期和2007年2月在《河南工業大學對艮》第28巻第1期發表，測繊于天津禾根大學代謝 控制發酵研體，公眾如有需要，可直接與該研究室麟。)
B. 將步驟A中獲得的擴大培養的菌種接入產酶培養基進行培養產酶培養基中碳源含量應為 0. lF3(F。的干^t咅養基重，氮碳比N:C應介于1: 100^50: 100之間，無機鹽含ffl^為0.1~10%， DL-ATC的添加量為0.1 %~0.9%。產酶培養基的初始PH6.0，培^MJt 25。C 33。C，振蕩培養 或發,i歸12 36小時，接種量為O. 01^20% (V/V);在培養過程中流加氨水調節發辭咅養基 的PH6.2 7. 0;
C. 將步驟B培養到2(K24小時，離心分離菌體10min(4000r/min， 4°C)，棄去上清液，用pH7.4 的PBS緩沖液(磷自二鈉-磷酸二氫鈉-氯化鈉緩沖液)反復洗滌菌體三次并 ，在pH 7.4的 PBS緩沖液中添加的濕菌體，帝恪,反/^萬用細脫懸液，細胞濃度為100g/L 500g/L。
D. 將步驟C制備的細胤懸液，加入到底物溶液中，進行艦反應。其中底物溶液的濃度為0.05 % 5.0%，在0^小時加入，反應溫度為3&^42°C，反應時間為2 12小時。8|{￡反應結束后，離 心分離菌體，社清液，采用酸式茚三酮法測定L-半胱氨齡量。
戰B步產酶培養基中的碳源為糖，即葡箭糖，蔗糖，乳糖，麥芽糖，山梨糖；或甘油； 或低W醇，乙醇；碳源含 ^范圍為10%~20%。
戰B步產酶培養基中的氮源為氨或銨鹽，即氯化銨，硫鵬安，碳^L銨，硝,；或有 機氮，即牛肉膏，蛋白胨，酵TO， 5^漿，尿素。
戰B步產,咅養基中的無機鹽為磷,，硫,，硫^M鐵，氯化鈉氨或硫^!孟。
在本發明實例中，采用酸式茚三酮法來測定L"半胱氨酸的含量，具體方法如下精確稱取一定 量L-半胱氨酸標準品，溶于一定量0.05MHC1中，制備終濃度為500mg/l的標準母液，進一步用 蒸餾水將上述母液分別稀釋為10， 20，……，100mg/l的標準溶液。取一定量的標準溶液或待測樣 品溶液的稀釋液0.2mL,加入02mL冰醋酸，再加入0.2 mL酸性茚三酮試劑，于沸水浴中反應IO min，然后立即在冷水中冷卻，最后加入2.4mL酒精，使總體積為3mL。放置10min后，于560nm 下測定其吸皿，以濃度和吸皿纟魏嚇準曲線。S31該標準曲線計算出未知溶液中的半胱氨酸濃 度。
本發明的優點和積極效果通常在由謝崔化法進行的反應中，^S對酶作用有兩個方面一 方面，反應溫度升高，,反，率加快；另一方面，隨著溫度升高，酶蛋白熱變性1加快， 酶易失活， 一般不能重復使用；而固定化的方法步驟比較繁雜，而且或多或少對酶活力有一定影 響。而本發明方法以惡臭假單胞菌TS-1138細胞為酶源，酶法轉tt^物DLATC得到L-半胱氨酸 7K溶液。該方法直接利用細胞為酶源直接催化底物，取締了固定化酶的方法，并艦斷氐,反 應驢，提高酶的穩定性，在,反應過程中流加底物DL"ATC，使酶可重復{頓，提高了酶源 細胞的利用效率和L"半胱氨酸的產量。
具條驗式
實施例l:惡臭假單胞菌TS1138菌懸液的帝恪
從親賴羊斜面上挑取一環惡臭假單胞菌TS-1138的菌苔接A^有30mL種子培養基(葡萄糖 30g/L， DL-ATO3H205g/L，酵娜15g/L，蛋白胨10g/L，尿素3g/L， MnS04-H20 lg/L， K2HP04-3H20 3g/L， MgSQr7H2O0.5g/L， FeSOr7H2O0.01g^， NaC11.5g/L， pH7.5， 0.1MPal5min)的500mL 三角瓶中，8層紗布封口，于旋轉式搖床190r/min， 29。C振蕩培養14h后，以10%接種量將種子培 養物接A^"30mL產,咅養基(葡萄糖30g/L， DLATC .3恥4g/L，就漿3g/L，尿素3g/L， MnSQrH20 lg/L， K2HP04'3H20 3.0g/L， MgS04.7H20 0.5g/L， FeS04.7H20 0.01g/L， NaC13 g/L， pH7.5, 0.1MPal5min)的500mL三角瓶中，8層紗布封口，于旋轉式搖床170r/min， 29。C振蕩培 養22h后，離心分離菌體10min(4000r/min， 4°C)，棄去上清液，用pH 7.4的PBS緩沖液反復洗滌 菌體三次并塞懸，在pH 7.4的PBS緩沖液中添加的濕菌體，制備謝足反艦用細胤懸液，細胞濃 度為350g/L。
實施例2:以惡臭假單胞^TS1138搖瓶培養，在42。C進行,反應^I^半胱氨酸 在100ml三角瓶中加入0.6。/。的DL-ATC溶液(含有0.6%DLATC 0.6%K2HPO4， pH7.5至8.0) 20ml，再加AJ^實施例l的TS-1138細脫懸液10ml，混勻。42。C恒溫，反您.5小時后，用酸式茚 三酮法測定半胱氨酸的含量為1.6 5g/t。
實施例3:以惡臭假單胞菌TS1138搖瓶培養，在38。C進行謝足反應生產L半胱氨酸 在100ml三角瓶中加入0.6。/。的DL-ATC溶液(含有0.6。/。DL-ATC， 0.6%K2HPO4， pH7.5至 8.0) 20ml，再加入i^實施例l的TS墨1138細脫懸液10ml，混勻。38。C恒溫，反應3小時后，用 酸式茚三酮法測定半胱氨酸的含量為1.60g/l。
實施例4:以惡臭假單胞菌TS1138搖瓶培養，在38。C流加底物進行,反應生產L半胱氨酸 在100 ml三角瓶中加入0.6%的DLATC溶液(含有0.6% DL~ATC， 0.6% K2HP04， pH 7.5至 8.0) 20ml,再加Ai^實施例l的TS-1138細胞懸液20ml，混勻。38。C恒溫，分別于,反應3h 和6h時加入10ml含DL"ATC0.18g與0.24g的底物溶液，使底物溶液中ATC的量基本維持在0.6% 左右，隨反應9小時后，用麟茚三酮法測定半胱氨酸的含量為5.70g/1。
實施例5:以惡臭假單胞菌TS1138在5L罐培養，在42。C進行,反應生產L半胱氨酸 從飾羊斜面上挑取一環惡臭環假單胞菌TS-1138的菌苔接入種子培養基中，種子培養基及種子 培養斜牛均同實施例1，以10%的接種量(種子培養液300mL)，將斜蟲滅好的產酶培養基(葡萄糖 50g/L， DL-ATC -3H20 5g/L，就漿3g/L，尿素3g/L， MnS04.H20 lg/L， K2HP04-3H20 3g/L， MgSO4.7H2O0.5g/L， FeS04.7H20 0.01g/L， NaC13g/L， pH7.0' O.lMPa 15min)火焰接種方式接 入5L自動控制發,中，5L發,中裝液量3L，離控制29。C，自動流加氨水控制pH在6.7左 右，通風量200L/h，初始攪拌織200r/min，艦流加泡敵消泡。當賺低于5g/L時流加濃度為 60g/L的葡萄糖液。
發,養22小時后，取5L罐培養的細fcL，濃縮五倍至400ml，加入到含有0.6。/。的DL-ATC溶 液(含有0.6。/。DL"ATC, 0.6%K2HPO4， pH7.5至8.0) 800ml的5L自動控制發,中，混勻。42°C 恒溫，反^15小時后，用酸式茚三酮法測定半胱氨酸的含量為1.81g/L
實施例6:以以惡臭假單胞^TS1138在5L罐培養，在38t:流加底物進行,反應^L"半胱氨
酸
在5L自動控制發,中力口入0.6%的DLATC溶液(含有0.6%DL-ATC， 0.6% K2HP04， pH7.5 至8.0) 800 ml，再加入上述實施例5的TS-1138細脫懸液400ml，混勻。38。C恒溫，在,反應 3h時加入30ml含DL"ATC4.8g的底物溶液，i醜物溶液中ATC的量基本維持在0.6%左右，■ 反應6小時后，用酸式茚三酮法測定半胱氨酸的含量為2.95g/l。
權利要求
1、本發明提供的一種利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)TS-1138酶法轉化DL-2-氨基-Δ2噻唑啉-4羧酸(DL-2-Amino-Δ2thiazoline-4-Carboxylic Acid，DL-ATC)合成L-半胱氨酸的生產工藝，包括A.將惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)TS-1138進行常規擴大培養B.將步驟A中獲得的擴大培養的菌種接入產酶培養基進行培養產酶培養基中碳源含量應為0.1％～30％的干基培養基重，氮碳比N∶C應介于1∶100～50∶100之間，無機鹽含量應為0.1～10％，DL-ATC的添加量為0.1％～0.9％。產酶培養基的初始PH6.0～9.0，培養溫度25℃～33℃，振蕩培養或發酵罐培養12～36小時，接種量為0.01％～20％(V/V)；在培養過程中流加氨水調節發酵培養基的PH6.2～7.0；C.將步驟B培養到20～24小時，離心分離菌體10min(4000r/min，4℃)，棄去上清液，用pH 7.4的PBS緩沖液(磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉-氯化鈉緩沖液)反復洗滌菌體三次并重懸，在pH 7.4的PBS緩沖液中添加的濕菌體，制備酶促反應所用細胞懸液，細胞濃度為100g/L～500g/L。D.將步驟C制備的細胞懸液，加入到底物(DL-ATC)溶液中，進行酶促反應。其中底物溶液的濃度為0.05％～5.0％，在0～9小時加入，反應溫度為36～42℃，反應時間為2～12小時。酶促反應結束后，離心分離菌體，取上清液，采用酸式茚三酮法測定L-半胱氨酸含量。
2、 根據權利要求1所述的生產工藝,其特征在于B步產酶培養基中的碳源為糖， 即葡萄糖，蔗糖，乳糖，麥芽糖，山梨糖；或甘油；或低分子醇，乙醇；碳源含量最適 范圍為10%~20%。
3、 根據權利要求1所述的生產工藝,其特征在于B步產酶培養基中的氮源為氨或 銨鹽，即氯化銨，硫酸銨，碳酸氫銨，硝酸銨；或有機氮，即牛肉膏，蛋白胨，酵母粉, 玉米漿，尿素。
4、 根據權利要求1所述的生產工藝，其特征在于B步產酶培養基中的無機鹽為磷 酸鉀，硫酸鎂，硫酸亞鐵，氯化鈉氨或硫酸錳。
全文摘要
本發明公開了一種微生物酶法轉化生產L-半胱氨酸的工藝。以惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)TS-1138為供試菌種，經擴大培養和產酶培養后，以全細胞為酶源，酶法轉化DL-2-氨基-Δ2噻唑啉-4羧酸(簡稱DL-ATC)，其中底物溶液的濃度為0.05％～5.0％，在0～9小時加入，反應溫度為36～42℃，反應時間為2～12小時。本發明工藝簡單，生產原料成本低，耗能少，無污染。
文檔編號C12P13/12GK101348809SQ20071005819
公開日2009年1月21日 申請日期2007年7月18日 優先權日2007年7月18日
發明者劉淑云, 徐慶陽, 懷麗華, 寧 陳, 雷 馬 申請人:天津科技大學