專利名稱：神經營養因子基因修飾的干細胞移植治療脊髓損傷的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物醫藥技術，特別是一種神經營養因子基因修飾的干細胞移植治療脊髓損傷。
背景技術：
哺乳動物中樞神經系統損傷后，其內源性修復能力是有限的，因為受損的成年中樞神經系統很難產生新的神經元，也不能啟動功能性軸突再生。盡管誘導內源性中樞神經系統干細胞分化為神經元是可能的，但就目前的技術水平而言，移植也許是修復受損中樞神經系統更為可行的途徑。研究者們已嘗試在各種脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)模型中，移植神經或非神經細胞以及應用某些神經保護劑以促進軸突再生和神經功能的恢復。這些移植的組織或細胞有外周神經、胚胎脊髓組織、雪旺氏細胞、嗅神經鞘細胞、激活的巨噬細胞和小膠質細胞、以及最近的神經干細胞。結合細胞治療，脊髓內注射糖皮質激素如甲基強的松龍、神經節苷脂、神經營養因子以及各種能降解或阻斷抑制軸突生長分子的酶或中和性抗體等也都顯示出良好的治療效果。但這些藥物和營養因子在體內會很快降解，因而療效有限。為此，研究者們已經采用直接體內基因治療法(in vivo)，即把攜帶促進脊髓再生的神經營養因子載·體直接注射至損傷部位，使其在局部持續釋放營養因子以改變神經再生的微環境。然而攜帶外源基因的載體很難特異性作用于靶細胞或靶器官，而且載體在體治療的安全性和效率仍值得評估。最近，基因修飾的非神經細胞如成纖維細胞也已用于移植治療中樞神經系統疾病，然而這種治療只局限于移植區，供體細胞不能與宿主細胞相整合，從而難以建立神經環路以調控重要因子的釋放，并且基因修飾的非神經細胞也不易穩定表達外源基因。而神經源性的細胞或組織可以增加基因工程細胞的療效，因此源生于中樞神經系統成熟的或較為年輕的神經元或胚胎組織可能是攜帶外源基因理想的載體細胞。然而原代培養的神經元不能在體外增殖足夠可用于移植的神經元數目。胚胎神經組織存在著來源困難、含有非神經組織和與宿主細胞較少整合等缺陷。相比而言，前已述及的神經干細胞作為載體細胞具有諸多優勢。已經證明，轉基因的神經干細胞移植體內后，其細胞生物學特性未發生明顯改變。目前已有神經營養素-3(NT-3)、神經生長因子(NGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)、酪氨酸化酶(tyrosine hydroxylase, TH)、Bcl_2和⑶NF等基因轉入神經干細胞,并將之移植到脊髓及腦，治療效果良好。因此，GDNF基因修飾的胚胎神經干細胞為脊髓損傷的治療提供了全新的方法。

發明內容
本發明的目的是神經營養因子基因修飾的干細胞移植治療脊髓損傷，具體是將膠質細胞源生神經營養因子基因(GDNF)修飾的胚胎神經干細胞(NSCs)移植于損傷的大鼠的脊髓。脊髓損傷(SCI)模型動物接受干細胞移植4周后，其損傷的脊髓中移植的GDNF-NSCs存活并遷移，空洞面積減小，并使干細胞移植的模型大鼠神經功能得到恢復。這些結果與NSCs移植組比較具有明顯差異。同時⑶NF-NSCs可長期存活、適當整合于中樞神經組織且可分化成神經元、少突膠質細胞和星型膠質細胞能并穩定表達外源基因。此法為運動神經元損傷性疾病如脊髓損傷等提供了一個新的治療途徑。


圖1是干細胞移植4周后，脊髓損傷動物運動狀態與移植前的比較，圖2是實驗動物的斜板實驗，圖3是實驗動物進行的開放平面場地實驗(BBB運動評分法)，圖4是實驗動物干細胞移植4周后，脊髓損傷面積的比較，圖5是移植的干細胞在體內的存活觀察，圖6是移植的干細胞在體內的遷移。
具體實施例方式(I)轉基因神 經干細胞制備(見發明專利“膠質細胞源生神經營養因子基因修飾的胚胎神經干細胞構建”，申請號:201210016282.5)，簡述之:首先構建目的基因⑶NF與逆轉錄病毒載體PLNCX2的重組體，包裝細胞pT67包裝后上清液感染胚胎神經干細胞，經G418篩選獲得膠質細胞源生神經營養因子基因修飾的胚胎神經干細胞GDNF-NSCs。(2)脊髓損傷模型制作，按照Tator脊髓損傷制作法:200克清潔級雌性SD大鼠，2%的戊巴比妥鈉(60mg/kg)腹腔麻醉動物約15-20分鐘，剃去背部T8附近部位的毛發。75%酒精消毒皮膚，切開皮膚、分離肌肉至椎管完全暴露。用咬骨鉗咬去T8脊突，沿著T8與T9間的脊間孔咬去椎板，直至脊髓充分暴露。用動脈夾夾擊脊髓五秒鐘，生理鹽水沖洗傷口，縫合肌肉皮膚。再用鹽水洗傷口，皮下注射抗菌素(青霉素)3.2萬單位、生理鹽水和10%葡萄糖液各lml。待動物蘇醒(24-28°C動物易蘇醒)后送至清潔級動物房每天注射抗菌素和補液(量同上)并作人工護理。圖1左側顯示制作的動物模型。(3)斜板實驗，動物術后9天，作斜板實驗:將動物置于一斜板，讓其靜止5秒鐘。記下斜板與水平面夾角度數。本實驗測試指標標準定為:斜板實驗不超過33°。圖2顯示:動物手術后第9天進行斜板實驗篩選模型動物，A，斜板實驗圖；B，細胞移植I個月后，vehicle組、NSCs組和NSCs-GDNF組斜板實驗得分比較。三組結果兩兩比較差異顯著(P< 0.05);數據由GLM程序處理，顯著性水平為0.05。(4)開放平面場地實驗(Open field test)，把手術動物置于一開口圓盆(底部為帶條紋的地板)。輕敲盆壁使動物爬行。觀察動物的臀、膝、踝關節，以及行走、軀干運動及其協調情況。應用BBB評分法對實驗動物逐一評分。動物運動評分不超過3分。20只動物經篩選后有15只動物符合該要求。實驗動物術后9天，進行開放平面場地實驗。應用BBB運動評分法(圖3A)對動物運動狀態評分以挑選符合要求的模型動物。本實驗系統規定BBB評分不超過3分。vehicle組、NSCs組和NSCs-GDNF組得分分別為:4.2±0.62,6.4±0.80、8.8±0.65。數據經GLM程序處理顯示:三組間兩兩比較差異顯著(P < 0.05)，更重要的是轉基因神經干細胞組平均得分非常顯著地高于Vehicle組(P < 0.01)(圖3B)。(5)工程細胞的標記，轉基因神經干細胞傳代后Pl及野生型的P2吹吸成單個細胞懸液，加入Hochest原液(5μ l/ml),37°C>5% CO2孵育箱孵育I小時。用神經干細胞基礎培養液清洗細胞三次。DMEM/F12培養液重懸細胞后在熒光顯微鏡下觀察細胞核標記情況，相差顯微鏡下計數活細胞數。將活細胞濃度調整為lX104/ml，放入冰中待移植。圖5和圖6顯示:轉基因神經干細胞在體內的遷移，Hoechst33342核標記NSCs或NSCs-GDNF移植脊髓損傷動物，4周后收集脊髓標本，組織切片在熒光顯微鏡下觀察發現:H0echst33342核標記細胞或其分化細胞向損傷的頭側和尾側遷移，遷移的細胞大部分集中在損傷的頭尾之間IOmm處。我們發現，Hoechst33342 (+)NSCs或NSCs-GDNF在脊髓損傷處的遷移的距離和細胞數沒有明顯差異。(6)細胞移植，符合模型動物標準的動物分為三組:對照組(vehicle)注射DMEM/F12培養液；NSCs組移植野生型干細胞；NSCs-GDNF組移植NSCs-GDNF。首先用手術刀片割去覆蓋在脊髓損傷部位成纖維細胞增生所形成的結締組織，使受損部位充分暴露。將微玻璃管固定于立體定位儀，吸取混勻后的4μ1(干細胞含量:lX107/ml)干細胞液。使微玻璃管進入脊髓損傷組織Imm深。以I μ 1/1分鐘的速度將細胞液推進損傷脊髓中心。緩緩退出微玻管以免細胞滲出。沖洗傷口，縫合肌肉和皮膚，注射抗菌素、補液。待動物蘇醒后送至清潔級動物房護理。圖1顯示:細胞移植4周后，動物運動狀態與移植前的比較，Α，細胞移植前的動物模型；Β，C，D分別是營養液移植組、野生型神經干細胞移植組和轉基因神經干細胞移植組。照片顯示=NSCs組動物后肢可部分運動，NSCs-GDNF組動物后肢已能部分支撐身體，vehicle組與模型組無明顯差異。圖2A顯示:細胞移植I個月后斜扳試驗結果如下:vehicle 組，33.2±0.82 (度);NSCs 組，36.0±0.80 (度);NSCs_GDNF組，39.2±0.84(度)。數據經GLM(general line model, SAS軟件包)程序分析,三組間兩兩比較差異顯著(p< 0.05)，而且NSCs-GDNF組平均斜板度數非常顯著地高于vehicle組(p < 0.01)。(7)組織樣本的獲取，過度麻醉動物并作心臟灌注:用37°C預溫的生理鹽水從左心房注入直至右心房流出白色液體。再用4°C預冷的4% PFA/PBS灌流直至動物四肢肌肉及胡須不動為止。取出損傷脊髓約IOmm(注意避光保存，以后操作均如此)，放入4% PFA/PBS中浸泡24小時。用30%多糖/PBS浸泡數小時。將標本置于冷凍盤(注意背側朝上)，_20°C冷凍30分鐘。對脊髓作30 μ m厚的水平切片(_70°C保存備用)，并黏貼于鉻礬明膠液包被的玻片(配方:明膠(gelatin) 0.3g，雙蒸餾水50ml，于37°C或55°C水浴溶解，稱加入鉻礬(硫酸鉻鉀)0.lg，補雙蒸餾水至100ml，濾紙過濾，浸泡清潔干燥的玻片十分鐘或數小時均可，37°C溫箱烘干備用)。 (8)脊髓損傷面積觀察，使用免疫酶法染色，用洗滌液
沖洗(3 X 10分鐘)待染色的組織，3% H2O2去除內源性過氧化物，PBS洗滌后加封閉液[10% NGS-0.3% Triton X-100-0.0lM PBS (pH7.4)] 150 μ 1(以去除可能與二抗反應的成分)，置濕盒內37°C封閉I小時。加抗體稀釋液[1% BSA-0.3% Triton X-100-0.0lMPBS (ρΗ7.4)]稀釋的小鼠抗大鼠GFAP單抗(I: 50)，置濕盒內4°C過夜。第二天用加抗體稀釋液(同上)稀釋的HRP標記的山羊抗小鼠IgG多抗(I: 50) 150μ 1，置濕盒內37°C避光孵育I小時。洗滌后加稀釋液稀釋的二氧基聯苯胺(DAB)顯色，酒精梯度脫水，75^^85%、95%U00% 1,100% II各3-5分鐘，二甲苯透明兩次，中性樹脂封片。圖4顯示:實驗動物細胞移植4周后，損傷脊髓標本染色后在普通光鏡下可見vehicle組、NSCs組和NSCs-GDNF組脊髓損傷空洞有顯著差異(圖4A)。在1.2X 10的放大倍數下，目鏡上16個小方格相當于1mm2，每只動物選取三張脊髓切片即中央管一張，離開中央管向背及腹側各一張并計算各組脊髓損傷面積。vehicle組、NSCs組和NSCs-GDNF組損傷面積分別為:2.56±0.48mm2,
1.54±0.1mm2,0.93 ±0.3mm2 (圖 4B)。(9)轉基因神經干細胞在體內的存活觀察，用免疫組織熒光染色法，一抗為小鼠抗大鼠nestin單抗(1: 50), 二抗是Rhodamine標記的羊抗小鼠(1: 50) IgG多抗，Gel/mount +Hoechst封片，標本注意避光保存于_20°C。圖5顯示:于移植前一小時，用細胞核染料Hoechst 33342對移植細胞作標記。這種核標記不影響干細胞或其可能分化的細胞進行特異性表面標記免疫組化染色。細胞移植四周后收集脊髓標本并進行抗nestin染色。結果顯示:細胞移植四周后，轉基因神經干細胞在所有損傷動物體內存活，并分布在空洞中或其周圍；一些移植的轉基因神經干細胞顯示nest in免疫反應性。(10)轉基因神經干細胞在體內的遷移，Hoechst33342核標記NSCs或NSCs-GDNF移植脊髓損傷動物，4周后收集脊髓標本，組織切片在熒光顯微鏡下觀察發現:Hoechst33342核標記細胞或其分化細胞向損傷的頭側和尾側遷移，遷移的細胞大部分集中在損傷的頭尾之間IOmm處，Hoechst33342 (+)NSCs或NSCs-GDNF在脊髓損傷處的遷移的距離和細胞數沒有明顯差異(見 圖6)。
權利要求
1.神經營養因子基因修飾的干細胞移植治療脊髓損傷，其特征是，它按如下步序進行 (1)轉基因神經干細胞制備，將構建的重組逆轉錄病毒載體PLNCX2-GDNF的質粒包裝并感染神經干細胞，制備轉基因干細胞⑶NF-NSCs。
(2)脊髓損傷模型制作，按照Tator脊髓損傷制作法，將大鼠椎管打開夾擊并縫合護理，制作脊髓損傷動物模型。
(3)斜板實驗，術后動物置于一斜板讓其靜止，記下斜板與水平面夾角度數。
(4)開放平面場地實驗，手術動物置于一開口圓盆，讓動物爬行于其中，觀察動物的運動及其協調情況并打分。
(5)工程細胞的標記，轉基因神經干細胞加入Hochest原液，經孵育、清洗，并于冰中待移植。
(6)細胞移植，轉基因神經干細胞NSCs-GDNF移植大鼠損傷的脊髓并縫合肌肉、皮膚和護理。
(7)組織樣本的獲取，過度麻醉動物并作心臟灌注，取出損傷的脊髓經固定行冷凍水平切片，黏貼于經鉻礬明膠包被的玻片備用。
(8)脊髓損傷面積觀察，使用免疫酶染色法，將做好的組織片經GFAP單抗染色顯示脊髓損傷空洞面積。
(9)轉基因神經干細胞在體內的存活觀察，用免疫組織熒光染色法，把經細胞核染料標記的脊髓標本行神經干細胞標記分子染色，觀察移植細胞的存活。
(10)轉基因神經干細胞在體內的遷移，細胞核染料標記的干細胞在移植大鼠損傷的脊髓4周后的遷移情況。
2.根據權利要求I所述的神經營養因子基因修飾的干細胞移植治療脊髓損傷，其特征是所述步序(I)轉基因神經干細胞制備(見發明專利“膠質細胞源生神經營養因子基因修飾的胚胎神經干細胞構建”，申請號201210016282. 5)，首先構建目的基因膠質細胞源生神經營養因子⑶NF與逆轉錄病毒載體PLNCX2的重組體，用包裝細胞pT67包裝，G418篩選陽性克隆。用ΝΙΗ3Τ3測定病毒滴度并選取病毒滴度最高的細胞克隆上清液感染胚胎神經干細胞(取自14. 5天懷孕清潔級SD大鼠大腦皮質)，經G418篩選獲得膠質細胞源生神經營養因子基因修飾的胚胎神經干細胞⑶NF-NSCs。
3.根據權利要求I所述的神經營養因子基因修飾的干細胞移植治療脊髓損傷，其特征是所述步序(2)脊髓損傷模型制作，按照Tator脊髓損傷制作法，取200克清潔級雌性SD大鼠，2%的戊巴比妥鈉(60mg/kg)腹腔麻醉動物約15-20分鐘，于背部T8處去毛發、消毒、切開皮膚、分離肌肉、暴露椎管、咬去T8脊突直至脊髓充分暴露，用動脈夾夾擊脊髓五秒鐘后，生理鹽水洗傷口，補抗菌素、生理鹽水和10%葡萄糖液各1ml，并作人工護理。
4.根據權利要求I所述的神經營養因子基因修飾的干細胞移植治療脊髓損傷，其特征是所述步序(3)斜板實驗，動物術后9天或細胞移植一個月后，將動物置于一斜板使其靜止5秒鐘，并記下斜板與水平面夾角度數。
5.根據權利要求I所述的神經營養因子基因修飾的干細胞移植治療脊髓損傷，其特征是所述步序(4)開放平面場地實驗，把手術動物置于一開口圓盆(底部為帶條紋的地板)，輕敲盆壁使其爬行，觀察動物的臀、膝、踝關節，以及行走、軀干運動及其協調情況。
6.根據權利要求I所述的神經營養因子基因修飾的干細胞移植治療脊髓損傷，其特征是所述步序(5)工程細胞的標記，轉基因神經干細胞⑶NF-NSCs加入Hochest原液(5 μ I/ml),37°C,5% CO2孵育箱飽和濕度孵育I小時，神經干細胞基礎培養液清洗細胞三次后計數備用。
7.根據權利要求I所述的神經營養因子基因修飾的干細胞移植治療脊髓損傷，其特征是所述步序(6)細胞移植，脊髓損傷大鼠成模型后，打開椎管并使受損的脊髓充分暴露，將微玻璃管固定于立體定位儀并吸取混勻后的4μ I (干細胞含量=IxioVml)干細胞液，使微玻璃管進入脊髓損傷組織Imm深，以I μ 1/1分鐘的速度將細胞液推進損傷脊髓中心。緩緩退出微玻管以免細胞滲出。
8.根據權利要求I所述的神經營養因子基因修飾的干細胞移植治療脊髓損傷，其特征是所述步序(7)組織樣本的獲取，過度麻醉動物并用37°C預溫的生理鹽水從左心房注入直至右心房流出白色液體，再用4°C預冷的4% PFA/PBS灌流直至動物四肢肌肉及胡須不動為止。取出損傷脊髓約IOmm(注意避光保存，以后操作均如此)，經4% PFA/PBS、30%多糖/PBS浸泡數小時固定，行冷凍脊髓30 μ m厚的水平切片，并貼于鉻礬明膠包被的清潔干燥玻片。
9.根據權利要求I所述的神經營養因子基因修飾的干細胞移植治療脊髓損傷，其特征是所述步序(8)脊髓損傷面積觀察，使用免疫酶法染色用3% H2O2去除內源性過氧化物，PBS洗滌后加封閉液[10%NGS-0. 3% Triton Χ-ΙΟΟ-Ο. OlM PBS (pH7. 4)] 150 μ I (以去除可能與二抗反應的成分)，一抗是小鼠抗大鼠GFAP單抗(I 50)，二抗是HRP標記的山羊抗小鼠IgG多抗(I 50) 150 μ L·洗滌后加稀釋液稀釋的二氧基聯苯胺(DAB)顯色，酒精梯度脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片鏡下觀察。
10.根據權利要求I所述的神經營養因子基因修飾的干細胞移植治療脊髓損傷，其特征是所述步序(9)轉基因神經干細胞在體內的存活觀察，用免疫組織熒光染色法，一抗為小鼠抗大鼠nestin單抗(I 50), 二抗是Rhodamine標記的羊抗小鼠(I 50) IgG多抗，Gel/mount +Hoechst封片，標本注意避光保存于_20°C。
11.根據權利要求I所述的神經營養因子基因修飾的干細胞移植治療脊髓損傷，其特征是所述步序(10)轉基因神經干細胞在體內的遷移，Hoechst33342核標記NSCs或NSCs-GDNF移植脊髓損傷動物，4周后收集脊髓標本，組織切片在熒光顯微鏡下觀察核標記細胞或其分化細胞的遷移情況。
全文摘要
本發明專利涉及一種生物醫藥技術，具體是神經營養因子基因修飾的干細胞移植治療脊髓損傷，它是按如下步序進行(1)轉基因干細胞構建；(2)脊髓損傷模型制作；(3)斜板實驗；(4)開放平面場地實驗；(5)工程細胞的標記；(6)細胞移植；(7)組織樣本的獲取；(8)脊髓損傷面積觀察；(9)干細胞在體內的存活觀察；(10)干細胞在體內的遷移。本發明移植至成年脊髓損傷大鼠的轉基因干細胞不僅存活、遷移，還可減小脊髓損傷面積，促進脊髓損傷大鼠神經功能的恢復。因此，轉基因干細胞為運動神經元損傷性疾病如脊髓損傷等提供了一個新的治療途徑。
文檔編號A61K35/30GK103251957SQ20121003530
公開日2013年8月21日 申請日期2012年2月16日 優先權日2012年2月16日
發明者孫勇 申請人:孫勇