專(zhuān)利名稱(chēng)：一氧化碳分子在皮膚移植后抑制急性排斥反應(yīng)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專(zhuān)利涉及ー氧化碳釋放分子在免疫抑制方面的新用途，具體的說(shuō)，涉及一種早期應(yīng)用ー氧化碳釋放分子治療皮膚移植后抑制急性排斥反應(yīng)的方法。
背景技術(shù)：
同種異基因移植(Allotranspantation)是目前治療器官衰竭終末期的主要途徑。同種異基因皮膚移植作為ー種簡(jiǎn)便的器官移植手段，不僅在抗移植排斥的研究中應(yīng)用廣泛，而且在臨床上，一定程度解決了自體皮膚的缺乏以及異種皮膚移植帶來(lái)的倫理學(xué)問(wèn)題。但是接受了同種異基因組織器官移植的個(gè)體，移植物MHC抗原被自身免疫系統(tǒng)識(shí)別，產(chǎn)生排斥。早在18世紀(jì)，人類(lèi)就開(kāi)始了異體皮膚移植的探索。最初的嘗試都因?yàn)闊o(wú)法邁過(guò)最初的急性排斥反應(yīng)而最終宣告失敗。到了近代，免疫學(xué)有了突破進(jìn)展，伴隨著免疫抑制劑的出現(xiàn)和免疫耐受誘導(dǎo)概念的提出，使突破這些障礙成為可能。目前的免疫抑制劑雖然在療效取得一定的突破，但因?yàn)槿狈μ禺愋远鴰?lái)嚴(yán)重的副作用使之仍然無(wú)法令人滿(mǎn)意，研制高效低毒特異性強(qiáng)的免疫抑制劑仍然是今后艱巨的任務(wù)。由于皮膚的特殊結(jié)構(gòu)，血液循環(huán)的建立較之行血管吻合的實(shí)質(zhì)器官晚，其致敏的發(fā)生場(chǎng)主要在引流淋巴結(jié)，且皮下組織內(nèi)含有大量的郎罕氏巨細(xì)胞(LC)，作為ー種專(zhuān)職APC，使同種異基因皮膚移植發(fā)生的急性排斥反應(yīng)尤其劇烈。正因?yàn)檫@樣的特性，加上皮膚移植的直觀(guān)性便于連續(xù)觀(guān)察排斥狀況，使其成為研究排斥反應(yīng)及相應(yīng)抗排斥手段的最常用模型。目前發(fā)現(xiàn)的具有免疫抑制作用的藥物主要有以下5類(lèi)化學(xué)制劑類(lèi)、激素類(lèi)、真菌代謝產(chǎn)物類(lèi)、中藥及其有效成分、多克隆和單克隆抗淋巴細(xì)胞抗體。環(huán)磷酰胺，是最早用于臨床的烷化劑類(lèi)免疫抑制劑，作用強(qiáng)大，破壞DNA的結(jié)構(gòu)功能，抑制細(xì)胞分裂増殖，從而起到殺傷免疫細(xì)胞的作用，但副作用極大，多用于自身免疫性疾病的研究和治療，對(duì)于在皮膚移植研究中的應(yīng)用尚無(wú)特別報(bào)道。環(huán)孢素A(CsA)，為11個(gè)氨基酸組成的環(huán)狀多肽，最早是從真菌代謝產(chǎn)物中提取，可人工合成，選擇性抑制Th細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，特別是對(duì)IL-2及其受體的表達(dá)，從而一起對(duì)IL-2不能反應(yīng)；對(duì)體液免疫及炎癥反應(yīng)也有一定作用。他克莫司(FK506)，為新一代真菌肽類(lèi)免疫抑制劑，作用機(jī)理類(lèi)似CsA，但效能更強(qiáng)大，主要抑制IL-2、IL-3、IFN-y等致炎因子。AG490，為人工合成的苯亞甲基丙ニ腈的脂類(lèi)衍生物，可以和受體酪氨酸激酶競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位置。雷帕霉素，為大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，1989年經(jīng)證實(shí)有強(qiáng)大的免疫抑制作用，主要是通過(guò)阻止IL-2、IL-4對(duì)T細(xì)胞活化的信號(hào)傳導(dǎo)從而抑制了 T細(xì)胞増殖周期的Gl期向S期分化，并對(duì)體液免疫也有抑制作用，而對(duì)非特異性免疫無(wú)明顯影響。但是，由于非特異性抗免疫排斥的局限，在長(zhǎng)期服用傳統(tǒng)免疫抑制劑的情況下會(huì)出現(xiàn)諸多致命的并發(fā)癥，如腫瘤、全身免疫力低下、中樞及肝腎功能損害等等。因此，研究高效、低毒、特異性免疫抑制劑成為當(dāng)今移植領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。一氧化碳(CO)常溫常壓下是ー種雙原子、小分子的氣態(tài)物質(zhì)，由于ー氧化碳可與機(jī)體內(nèi)血紅蛋白結(jié)合生成碳氧血紅蛋白(HbCO)，使得血液運(yùn)輸氧的能力發(fā)生障礙，高濃度時(shí)還可與還原性細(xì)胞色素氧化酶的兩價(jià)鐵結(jié)合，抑制組織呼吸，故CO在以往被認(rèn)為是有毒氣體，對(duì)CO的研究?jī)H局限于它的生物學(xué)毒性。近年來(lái)，大量的研究證實(shí)ー氧化碳(CO)與一氧化氮(NO)相類(lèi)似，也是ー種重要的氣體細(xì)胞信使分子，在細(xì)胞功能和通訊的調(diào)節(jié)カー面發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要作用。到1990年代初，Snyder等[6]提出至少在ー種類(lèi)型的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，CO將不僅僅是副產(chǎn)物且作為cGMP的調(diào)節(jié)分子，它將和NO —樣激活生物信號(hào)。Snyder等研究證明，cGMP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嗅覺(jué)信號(hào)傳導(dǎo)中起了重要的作用，而這種作用可被HO的抑制劑阻斷，從而提出了 CO的分子信號(hào)作用。
外源性一氧化碳釋放分子(Carbonmonoxide-releasing molecules, CORMs)是近年來(lái)新合成的一種ー氧化碳復(fù)合物，該ー氧化碳復(fù)合物的制備方法和理化性能參數(shù)，在Motterlini R等所著文獻(xiàn)(Curr. Pharm. 2003 ；9 :2525-39)中有詳細(xì)的報(bào)道,該一氧化碳復(fù)合物通常可用于制備緩釋的一氧化碳。上世紀(jì)九十年代初,Mahin Maines等提出Heme在大腦內(nèi)由H0-1降解產(chǎn)生的CO激活了 3’，5’-cGMP。CO將不僅僅是副產(chǎn)物，而且是作為cGMP的調(diào)節(jié)分子。H0-1作為體內(nèi)唯一一種催化血紅素(heme)分解代謝的限速酶，對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用最早在急性肺損傷和內(nèi)毒素休克動(dòng)物模型上被證實(shí)當(dāng)H0-1被抑制劑鋅原卟啉所抑制或不被誘導(dǎo)，移植的心臟很快被排斥；而利用一定濃度的外源性CO處理移植的心臟后，即使H0-1的活性被抑制的情況下，也可防止急性排斥的發(fā)生，并達(dá)到與H0-1表達(dá)ー樣的效果。H0-1或外源性CO可抑制心血管系統(tǒng)白細(xì)胞浸潤(rùn)及平滑肌細(xì)胞的増殖，從而抑制了移植物微血管新生內(nèi)膜的形成。此作用是通過(guò)順序激活cGMP、p38MARK途徑，從而表達(dá)細(xì)胞周期抑制因子p21，使平滑肌細(xì)胞周期停留在G1/S階段。根據(jù)我們的前期研究已經(jīng)證實(shí)，外源性CO對(duì)膿毒癥早期的炎癥反應(yīng)有抑制作用。如能夠?qū)⑺龅末`氧化碳釋放分子用于抑制同種異體移植排斥反應(yīng)中，將為研究開(kāi)發(fā)新型低毒、高效的免疫抑制劑開(kāi)辟新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー氧化碳釋放分子在皮膚移植后抑制急性排斥反應(yīng)中的應(yīng)用，以滿(mǎn)足臨床應(yīng)用的需要。將所述ー氧化碳釋放分子溶解在溶劑中，然后將其置于細(xì)胞培養(yǎng)液或生物體內(nèi)，中可以持續(xù)性釋放CO，作為ー種外源性CO供體，動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，可用于抑制皮膚移植后急性排斥反應(yīng)，可作為ー種抑制皮膚移植后急性排斥反應(yīng)的藥物，所述的急性排斥反應(yīng)，包括同種異基因小鼠皮膚移植后，脾臟淋巴細(xì)胞分泌功能的增強(qiáng)，或者是同種異基因小鼠皮膚移植后脾臟淋巴細(xì)胞體外增值能力的增強(qiáng)。因此，所述的ー氧化碳釋放分子C0RM-2，可以用于制備抑制皮膚移植后急性排斥反應(yīng)的藥物；本發(fā)明以ICR小鼠和BALB/C小鼠皮膚作為供體和受體建立同種異基因急性排斥反應(yīng)模型，小鼠尾靜脈注射外源性CO，將所述的ー氧化碳釋放分子作為ー種抑制皮膚移植后急性排斥反應(yīng)的藥物，施加于皮膚移植后的動(dòng)物，劑量一般7 8mg/kg體重/天，具體可根據(jù)患者的具體情況，由醫(yī)師決定，進(jìn)行早期干預(yù)，進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ー氧化碳釋放分子對(duì)皮膚移植后急性排斥反應(yīng)有抑制作用。采用所述的ー氧化碳釋放分子抑制皮膚移植后急性排斥反應(yīng)，其濃度控制相對(duì)容易且正確，長(zhǎng)期使用時(shí)追加方便，可以作為ー種特異性強(qiáng)、低毒、高效的免疫抑制劑，能夠滿(mǎn)足臨床應(yīng)用的需要。


圖I為移植皮片HE染色光鏡下視野(400倍)。圖2為移植皮片真皮層IL-2免疫組織化學(xué)切片光鏡觀(guān)察(400倍)。圖3為移植皮片真皮層IL-4免疫組織化學(xué)切片光鏡觀(guān)察(400倍)。圖4為移植皮片真皮層IL-10免疫組織化學(xué)切片光鏡觀(guān)察(400倍)。圖5為移植皮片真皮層IFN- Y免疫組織化學(xué)切片光鏡觀(guān)察(400倍)。圖6為移植皮片真皮層FAS免疫組織化學(xué)切片光鏡觀(guān)察(400倍)。圖7為移植皮片真皮層FasL免疫組織化學(xué)切片光鏡觀(guān)察(400倍)。圖8為各組小鼠外周血淋巴細(xì)胞增值指數(shù)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I外源性ー氧化碳釋放分子C0RM-2對(duì)同種異基因小鼠皮膚移植后移植物的實(shí)驗(yàn)觀(guān)察試驗(yàn)方法(I)動(dòng)物及同種異基因小鼠皮膚移植模型以清潔級(jí)ICR小鼠、BALB/C小鼠分別作為供體和受體建立異體皮膚移植模型，共分5組1組假手術(shù)組，2組同種異基因皮膚移植組，3組同種異基因皮膚移植+C0RM-2組，4組異體皮膚移+iC0RM-2組，5組異體皮膚移植+CsA組；術(shù)后分別依據(jù)每組要求給藥，觀(guān)察移植皮片排斥程度，觀(guān)察期為7天。于觀(guān)察期結(jié)束時(shí)，分別取下移植皮片以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，常規(guī)病理HE染色、免疫組化檢測(cè)。(2)檢測(cè)指標(biāo)a外源性ー氧化碳釋放分子(CORM) 2對(duì)同種異基因小鼠皮膚移植后移植物存活時(shí)間的觀(guān)察I組、2組自模型建立后僅單籠飼養(yǎng)，正常喂食；3組以DMSO溶解C0RM-2，給藥濃度8mg/kg，按25g體重即每只小鼠注射40M母液8ul，配以152ul生理鹽水，尾靜脈注射160ulC0RM-2稀釋液；4組按照3組的方法配制稀釋液，在室溫下將稀釋液敞開(kāi)放置24小時(shí)后用氮?dú)怛?qū)趕掉稀釋液內(nèi)的殘余CO后則配成失活的C0RM(iC0RM-2)作為陰性對(duì)照，每只小鼠尾靜脈注射160ul ；5組小鼠按照20mg/kg的劑量腹腔注射Csk作為陽(yáng)性對(duì)照，160ul/只。所有給藥均為7天，每天一次，自造模成功后即開(kāi)始。b外源性ー氧化碳釋放分子C0RM-2對(duì)同種異基因小鼠皮膚移植物病理學(xué)、免疫組織化學(xué)觀(guān)察移植皮片樣本石蠟切片HE染色步驟1.取材組織塊，經(jīng)固定后，常規(guī)石蠟包埋，4μπι切片。2.切片常規(guī)用ニ甲苯脫蠟，梯度濃度こ醇脫水ニ甲苯(I)作用5分鐘，100%こ醇脫水2分鐘，95%的こ醇脫水I分鐘，80%こ醇脫水I分鐘，75%こ醇脫水I分鐘，最后蒸餾水洗滌2分鐘。
3.蘇木素染色5min，自來(lái)水沖洗。4.鹽酸こ醇分化30s (提插數(shù)下)。5.自來(lái)水浸泡15min或溫水(約50°C ) 5min。
6.置伊紅液2min。移植皮片樣本石蠟切片免疫組織化學(xué)檢測(cè)步驟I質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛常規(guī)灌注固定，取材井置20%蔗糖溶液(4°C)中過(guò)夜。蠟塊制作。切片，貼片。0.0謹(jǐn)1^3清洗51^11;2加入配好的O. 3%的過(guò)氧化氫甲醇溶液(甲醇80ml+0. OIMKPBS IOOml+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%過(guò)氧化氫)30min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的影響，O. OlMPBS清洗5min ；3 加入配好的O. 3% Triton XlOO (30% Triton X100+0. OIMKPBS 100ml) 30min，以增加細(xì)胞的通透性，0. OIMKPBS清洗5min ；4加入用血清稀釋液(牛血清白蛋白I. 00g+0. OlMPBS IOOml+疊氮納O. 08g)稀釋的ー抗，4°C存放24-48h ;吸去抗體，O. 01MKPBS洗5min ;5加入O. 01MKPBS稀釋的的ニ抗，室溫孵育2h。O. OIMKPBS洗5min ；6加入ABC復(fù)合物之類(lèi)的抗體，室溫孵育2h，0. OIMKPBS洗5min ;蒸懼水迅速?zèng)_三次；7加入顯色液，進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色，時(shí)間一般不超過(guò)30min，可不時(shí)在顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察，待細(xì)胞著色而背底顏色較淡時(shí)馬上吸去顯色液，用蒸餾水迅速?zèng)_三次后加入O. OIMKPBS終止反應(yīng)；8梯度酒精脫水之后，封片，拍照。局部移植物免疫組化檢測(cè)指標(biāo)本實(shí)驗(yàn)選擇了白細(xì)胞介素2、4、10、IFN-Y及凋亡相關(guān)蛋白FAS及其配體FasL共5項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。結(jié)果如下a外源性ー氧化碳釋放分子(CORM) 2對(duì)同種異基因小鼠皮膚移植后移植物存活時(shí)間的觀(guān)察表I示50%皮片平均存活時(shí)間(median survival time,MST)的觀(guān)察在同種異基因小鼠皮膚移植模型中，經(jīng)外源性ー氧化碳釋放分子C0RM-2注射7天的小鼠，其皮片生存時(shí)間接近經(jīng)環(huán)孢素A(CsA)腹腔注射7天的小鼠，與對(duì)照組相比，皮片生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)。b外源性ー氧化碳釋放分子C0RM-2對(duì)同種異基因小鼠皮膚移植物病理學(xué)、免疫組織化學(xué)觀(guān)察圖I示5組移植皮片HE染色光鏡下視野(400倍)除了炎性滲出，可見(jiàn)呈藍(lán)紫色深染的細(xì)胞核分布于皮膚全層，包括皮膚固有的角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，炎癥細(xì)胞包括單核細(xì)胞，中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。假手術(shù)組組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度最低，同種異基因皮膚移植組、異體皮膚移+iC0RM-2組明顯増加，特別是在炎性滲出強(qiáng)烈的區(qū)域，同種異基因皮膚移植+C0RM-2組、異體皮膚移植+CsA組比較假手術(shù)組也明顯增加，但相對(duì)同種異基因皮膚移植組、異體皮膚移+iC0RM-2組，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)減弱。圖1-1，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度最低，圖1-2、圖1-4明顯增加，特別是在炎性滲出強(qiáng)烈的區(qū)域，圖1-3、圖1-5組比較圖1-1組也明顯增加，但相對(duì)圖1-2、圖1-4，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)減弱。
圖2示5組移植皮片真皮層IL-2免疫組織化學(xué)切片光鏡觀(guān)察(400倍)圖2_1真皮層呈棕黃色染色的IL-2陽(yáng)性細(xì)胞非常稀疏，圖2-1、圖2-4顯示真皮層出現(xiàn)大片深染陽(yáng)性細(xì)胞，胞漿染色均勻，圖2-3、圖2-5組顯示也有不同程度的深染細(xì)胞，主要在近皮下部分的真皮層，但明顯少于圖2-2、圖2-4組，說(shuō)明IL-2在圖2-3、圖2-5組移植物內(nèi)的表達(dá)比較圖2-2、圖2-4組有所減弱。圖3示5組移植皮片真皮層IL-4免疫組織化學(xué)切片光鏡觀(guān)察(400倍)圖3_1顯示真皮層呈棕黃色染色的IL-4陽(yáng)性細(xì)胞非常稀疏，圖3-2、圖3-4組顯示，真皮層出現(xiàn)大片深染陽(yáng)性細(xì)胞，胞漿染色均勻，圖3-3、圖3-5顯示，也有不同程度的深染細(xì)胞，主要在近皮下部分的真皮層，但明顯少于圖3-2、圖3-4組，說(shuō)明IL-4在圖3-3、圖3-5組移植物內(nèi)的表達(dá)比較圖3-2、圖3-4組有所減少。
圖4示5組移植皮片真皮層IL-10免疫組織化學(xué)切片光鏡觀(guān)察(400倍)圖4_1顯示真皮層呈棕黃色染色的IL-10陽(yáng)性細(xì)胞胞漿染色均勻，分布廣泛，圖4-2、圖4-4組顯示真皮層也有部分深染陽(yáng)性細(xì)胞，但明顯數(shù)量較少，圖4-3、圖4-5組顯示，也有不同程度的深染細(xì)胞，主要在近皮下部分的真皮層，但明顯多于圖4-2、圖4-4，說(shuō)明IL-10在3、5組移植物內(nèi)的表達(dá)比較圖4-2、圖4-4組有所增加。圖5示5組移植皮片真皮層IFN- Y免疫組織化學(xué)切片光鏡觀(guān)察(400倍)圖5_1顯示真皮層呈棕黃色染色的IFN-Y陽(yáng)性細(xì)胞非常稀疏，圖5-2、圖5-4組顯示真皮層出現(xiàn)大片深染陽(yáng)性細(xì)胞，胞漿染色均勻，圖5-3、圖5-5顯示組也有不同程度的深染細(xì)胞，主要在近皮下部分的真皮層，但明顯少于圖5-2、圖5-4組，說(shuō)明IFN-Y在圖5-3、圖5-5組移植物內(nèi)的表達(dá)比較圖5-2、圖5-4組有所減少。圖6示5組移植皮片真皮層FAS免疫組織化學(xué)切片光鏡觀(guān)察(400倍)圖6_1顯示組真皮層呈棕黃色染色的FAS陽(yáng)性細(xì)胞非常稀疏，圖6-2、圖6-4組顯示真皮層出現(xiàn)大片深染陽(yáng)性細(xì)胞，胞漿染色均勻，圖6-3、圖6-5組顯示也有不同程度的深染細(xì)胞，主要在近皮下部分的真皮層，但明顯少于圖6-2、圖6-4組,說(shuō)明FAS在圖6-3、圖6_5組移植物內(nèi)的表達(dá)比較圖6-2、圖6-4組有所減少。圖7示5組移植皮片真皮層FasL免疫組織化學(xué)切片光鏡觀(guān)察(400倍)圖7_1組顯示真皮層呈棕黃色染色的FasL陽(yáng)性細(xì)胞非常稀疏，圖7-2、圖7-4組顯示真皮層出現(xiàn)大片深染陽(yáng)性細(xì)胞，胞漿染色均勻，圖7-3、圖7-5組顯示也有不同程度的深染細(xì)胞，主要在近皮下部分的真皮層，但明顯少于圖7-2、圖7-4組，說(shuō)明FasL在圖7 -3、圖7_5組移植物內(nèi)的表達(dá)比較圖7-2、圖7-4組有所減少。實(shí)施例2外源性ー氧化碳釋放分子(C0RM)2對(duì)同種異基因小鼠皮膚移植后脾臟淋巴細(xì)胞功能的影響小鼠同種異基因皮膚移植后的急性排斥反應(yīng)，主要以單核細(xì)胞介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫為主要特點(diǎn)。其中，T淋巴細(xì)胞的2個(gè)亞群之比(⑶47⑶8+)在反映移植免疫排斥的程度上已經(jīng)得到一定的認(rèn)識(shí)。CD4+T細(xì)胞屬于是輔助性T淋巴細(xì)胞，是移植免疫應(yīng)答過(guò)程中的主要細(xì)胞，而CD8+T為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，在移植免疫應(yīng)答過(guò)程中為效應(yīng)細(xì)胞，起到一定調(diào)控免疫細(xì)胞的作用。CD4+/CD8+比值的升高與急性排斥的程度密切相關(guān)，因而可以作為衡量排斥程度的ー項(xiàng)重要指標(biāo)。
另外，移植后，淋巴細(xì)胞増殖能力，以及淋巴細(xì)胞分泌功能均反映了脾臟淋巴細(xì)胞的功能，最終反映了受體對(duì)移植物的排斥能力。同種異基因急性免疫排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)免疫細(xì)胞向外周血釋放重要炎癥因子，如TNF-α、IL-2等，可以加劇受體對(duì)移植物的損害。試驗(yàn)方法 (I)動(dòng)物及同種異基因小鼠皮膚移植模型以清潔級(jí)ICR小鼠、BALB/C小鼠分別作為供體和受體建立異體皮膚移植模型，共分5組1組假手術(shù)組，2組同種異基因皮膚移植組，3組同種異基因皮膚移植+C0RM-2組，4組異體皮膚移+iC0RM-2組，5組異體皮膚移植+CsA組，術(shù)后分別依據(jù)每組要求經(jīng)尾靜脈給藥，共給藥7天，每天I次。于觀(guān)察期結(jié)束時(shí)，在無(wú)菌條件下，分別取每只受體小鼠的外周全血、血清。(2)檢測(cè)指標(biāo)I.外源性ー氧化碳釋放分子(C0RM)2對(duì)同種異基因小鼠皮膚移后脾臟T淋巴細(xì)胞亞群比例的影響心臟采集小鼠外周全血，取lOOulEDTA抗凝血加20ul熒光單克隆抗體，同時(shí)做陰性對(duì)照。避光室溫作用20min，以紅細(xì)胞裂解液溶去紅細(xì)胞后，固定劑固定。流式細(xì)胞儀測(cè)定，以陰性對(duì)照測(cè)出本底參數(shù)，設(shè)定陽(yáng)性參數(shù)值，計(jì)算機(jī)將讀出陽(yáng)性值。2、外源性ー氧化碳釋放分子(C0RM)2對(duì)同種異基因小鼠皮膚移植后脾臟淋巴細(xì)胞體外增值能力的影響每個(gè)樣本設(shè)4個(gè)板孔，I為增殖本底，3個(gè)為實(shí)驗(yàn)孔，小鼠脾臟淋巴細(xì)胞懸液按
IX 106濃度IOOul接種于包括增埴本地在內(nèi)的姆個(gè)孔板中，12. 5ug/ml刀豆蛋白AlOul及經(jīng)絲裂霉素C預(yù)處理30min的ICR和KM鼠脾淋巴細(xì)胞懸液按I X 105濃度IOul分別接種于3個(gè)實(shí)驗(yàn)孔中；37°C、5% C02培養(yǎng)培養(yǎng)48小吋，結(jié)束培養(yǎng)前4小時(shí)每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)加入O. 01mol/L pH 7. 2PBS配制的5g/L MTT染液ΙΟμΙ。培養(yǎng)結(jié)束后棄去上清液，每孔內(nèi)加入DMSO液150 μ L，搖床振蕩lOmin，使藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解，使用酶標(biāo)儀570nm下測(cè)定各孔吸光度。細(xì)胞增值率等于測(cè)定組吸光度值與對(duì)照組吸光度值的比值。I.外源性ー氧化碳釋放分子(C0RM)2對(duì)同種異基因小鼠皮膚移植后脾臟淋巴細(xì)胞分泌功能的影響酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)操作步驟加樣分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。空白孔加樣品稀釋液IOOul，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品IOOul, 37°C反應(yīng)120分鐘。棄去液體,甩干,姆孔加檢測(cè)溶液A工作液IOOul(取Iul檢測(cè)溶液A加99ul檢測(cè)稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制)，37°C，60分鐘。溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，毎次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，輕拍將孔內(nèi)液體拍干。每孔加檢測(cè)溶液B工作液(同檢測(cè)A工作液)IOOul，37°C,60分鐘。溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔,輕拍將孔內(nèi)液體拍干。依序每孔加底物溶液90ul，37°C避光顯色(30分鐘內(nèi))依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度(OD值)。在加終止液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果計(jì)算所有OD值減去空白后再計(jì)算。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，查出濃
度統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用X土s差表示，均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)。P <0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。差異顯著性檢驗(yàn)采用SPSS 13. O統(tǒng)計(jì)軟件。結(jié)果如下I、T淋巴細(xì)胞亞群⑶4+T、⑶8+T的比較圖8示小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群FCM分析姆組FCM圖片各2張，左側(cè)右下象限為⑶4+T占⑶3+T相對(duì)百分比(以彩點(diǎn)密度表示)，左上象限為CD8+T占CD3+T相對(duì)百分比(以彩點(diǎn)密度表示)，右側(cè)為流式細(xì)胞原始圖像，所設(shè)門(mén)在T淋巴細(xì)胞團(tuán)，即圖中黑圈所在位置，左側(cè)團(tuán)塊為B淋巴細(xì)胞群，上部細(xì)胞團(tuán)為中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞等。2、各組小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群⑶4+/⑶8+ :表2示同種異基因皮膚移植后的小鼠，經(jīng)外源性CO干預(yù)后脾臟T淋巴細(xì)胞亞群⑶4+/⑶8+的比值比較對(duì)照組顯著下降，與CsA干預(yù)的效果比較接近(表2)。3、淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)SI = OD (刺激細(xì)胞/ConA+反應(yīng)細(xì)胞)/OD (增殖底)*100%:圖8示在ConA(藍(lán)色條柱)刺激下，1-5組小鼠脾淋巴細(xì)胞均出現(xiàn)了相對(duì)于增值本底的細(xì)胞增殖現(xiàn)象，尤其是在2、4組的淋巴細(xì)胞，SI超過(guò)了 4，3組C0RM-2實(shí)驗(yàn)組超過(guò)3，5組CsA對(duì)照組最低，低于2，I組sham組約2. 5左右；在ICR鼠脾淋巴細(xì)胞(紅色條柱)刺激下，各組小鼠脾淋巴細(xì)胞也發(fā)生了相對(duì)本底的增值現(xiàn)象，以1、2、4組最為明顯，3、5組相對(duì)明顯抑制，接近1，特別是5組CsA組低于1，即出現(xiàn)顯著抑制現(xiàn)象；在KM鼠脾淋巴細(xì)胞(黃色條柱)刺激下的情況基本與ICR脾細(xì)胞刺激大體趨勢(shì)相似。
4、各組小鼠外周血TNF-a、IL-2含量表3示在外源性CO釋放分子干預(yù)7天后，同種異基因小鼠皮膚移植受體外周血TNF-a、IL-2濃度比較對(duì)照組有明顯減低，但仍高于CsA組水平。圖8為5組小鼠體外培養(yǎng)脾臟淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)(SI)在ConA刺激下，1-5組小鼠脾淋巴細(xì)胞均出現(xiàn)了相對(duì)于增值本底的細(xì)胞增殖現(xiàn)象，尤其是在2、4組的淋巴細(xì)胞，SI超過(guò)了 4，3組C0RM-2實(shí)驗(yàn)組超過(guò)3，5組CsA對(duì)照組最低，低于2，I組sham組約2. 5左右；在ICR鼠脾淋巴細(xì)胞(紅色條柱)刺激下，各組小鼠脾淋巴細(xì)胞也發(fā)生了相對(duì)本底的增值現(xiàn)象，以1、2、4組最為明顯，3、5組相對(duì)明顯抑制，接近1，特別是5組CsA組低于1，即出現(xiàn)顯著抑制現(xiàn)象；在KM鼠脾淋巴細(xì)胞刺激下的情況基本與ICR脾細(xì)胞刺激大體趨勢(shì)相似。表I 50%皮片平均存活時(shí)間(median survival time, MST)的觀(guān)察
權(quán)利要求
1.一氧化碳分子在制備皮膚移植后抑制急性排斥反應(yīng)藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的急性排斥反應(yīng)，為同種異基因小鼠皮膚移植后，脾臟淋巴細(xì)胞分泌功能的增強(qiáng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的急性排斥反應(yīng)，為同種異基因小鼠皮膚移植后脾臟淋巴細(xì)胞體外增值能力的增強(qiáng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I 3任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，劑量為7 8mg/kg體重/天。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一氧化碳分子在皮膚移植后抑制急性排斥反應(yīng)中的應(yīng)用，發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量的細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將所說(shuō)的一氧化碳釋放分子溶解在DMSO溶劑中，然后將其置于生物體內(nèi)，可以持續(xù)性釋放CO，故可作為一種外源性CO供體，并以ICR小鼠和BALB/C小鼠皮膚作為供體和受體建立同種異基因急性排斥反應(yīng)模型，小鼠尾靜脈注射外源性CO，進(jìn)行早期干預(yù)，進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)一氧化碳釋放分子對(duì)皮膚移植后急性排斥反應(yīng)有抑制作用。采用所述的一氧化碳釋放分子抑制皮膚移植后急性排斥反應(yīng)，其濃度控制相對(duì)容易且正確，長(zhǎng)期使用時(shí)追加方便，可以作為一種特異性強(qiáng)、低毒、高效的免疫抑制劑。
文檔編號(hào)A61P37/06GK102614215SQ20121003550
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月16日
發(fā)明者孫志偉, 孫炳偉, 孫艷 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院