專利名稱：：人乳頭瘤病毒型別雜合病毒樣顆粒及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及分子病毒學和免疫學領域。具體地，本發明涉及由不同型別HPVLI蛋白雜合組裝形成的人乳頭瘤病毒型別雜合病毒樣顆粒及其制備方法，所述型別雜合病毒樣顆粒可用于預防兩種或兩種以上HPV感染及由HPV感染所導致的疾病。本發明還涉及上述型別雜合病毒樣顆粒用于制備藥物組合物或疫苗的用途，所述藥物組合物或疫苗用于預防HPV感染及由HPV感染所導致的疾病如宮頸癌、尖銳濕疣等。
背景技術：
：人乳頭瘤病毒(HumanPapillomavirus,HPV)主要引起皮膚,粘膜的撫狀病變。根據其與腫瘤發生的關系，HPV可分為高危型與低危型，其中高危型的HPV感染被證實是誘發包括女性宮頸癌在內的肛生殖器癌癥主要原因；低危型則主要引起尖銳濕疣。預防與控制HPV感染的最有效方式是HPV疫苗，特別是能引起宮頸癌的高危型HPV疫苗。HPV的主要衣殼蛋白LI具有自組裝為空心病毒樣顆粒(Virus-LikeParticle,VLP)的特性。HPVVLP是由72個主要衣殼蛋白LI的五聚體以二硫鍵連接而構成20面體立體對稱結構(Doorbar,J.andP.H.Gallimore.1987.JVirol,61(9):2793-9)。HPVVLP結構與天然HPV高度相似，保留了天然病毒的絕大多數中和表位，可誘導高滴度的中和抗體(Kirnbauer，R.，F.Booy，etal.1992ProcNatlAcadSciUSA89(24):12180-4)。結構研究和突變分析表明，HPV16LI蛋白Cysl75、Cysl85和Cys428對VLP的基本結構單位五聚體之間的相互作用起關鍵的作用，Cysl61、Cys229、Cys379對于單體分子間的相互作用是必需的，提示發生在LI蛋白分子內和/或分子間的二硫鍵對于HPV病毒樣顆粒的組裝有重要的作用(IshiiY.，TanakaK.，KandaT.2003Virology.308:128-136)。本研究即對這些二硫鍵進行改造，發明新的人工HPV型別雜合病毒樣顆粒。現有的研究發現，HPVVLP主要誘導針對同型HPV的中和抗體，產生針對同型HPV的保護性免疫，僅在一些同源性高的型別之間存在交叉保護。因此，現有的HPV疫苗的保護范圍有限。如果要擴大HPV疫苗的保護范圍只能通過增加疫苗中所含有的HPVVLP型別來實現。這將大大提高HPV疫苗的生產成本，并可能因為免疫劑量增加而帶來潛在的安全性問題。而目前已上市的HPV疫苗(包括Merck公司的GardasiIHPV16,18,6,11四價疫苗和GSK公司的CervarixHPV16，18二價疫苗)均采用單獨型別vlp混合制備而成的。因此，本領域仍然需要能夠誘導針對多型別HPV保護性抗體的HPVLI病毒樣顆粒，從而使制備預防更多型別HPV的宮頸癌疫苗成為可能。
發明內容本發明至少部分基于發明人的以下的出人意料的發現利用大腸桿菌表達系統表達兩個或兩個以上不同型別的175位與428位半胱氨酸突變或缺失的HPVLI蛋白，所述突變或缺失的HPVLI蛋白單獨不能形成病毒樣顆粒，然而，按照一定的混合方式及一定的濃度比例混合后去除還原劑，可得到一種新的雜合VLP。該雜合VLP含有兩種或兩種以上的HPVLI蛋白，可誘導針對兩種或兩種以上HPV的高滴度中和抗體。因此，在一方面，本發明涉及組裝成雜合病毒樣顆粒的突變或缺失的HPVLI蛋白，所述蛋白包括但不限于HPVL1-C175A、HPVL1_AC428、HPVL1_AC175、HPVL1_C175S、HPVL1-C428A、HPVL1-C428S等。在一個優選的實施方案中，HPVL1-C175A與HPVL1-AC428按照I:I的摩爾比混合。在其它實施方式中，二者的比例包括21、12等等。在另一個方面，本發明涉及一種制備本發明的雜合病毒樣顆粒的方法。在一個優選實施方案中，制備本發明的雜合病毒樣顆粒的方法包括a)在大腸桿菌中表達所述突變或缺失HPVLI蛋白，b)將表達所述突變或缺失HPVLI蛋白純化，得到純度95%以上的突變或缺失HPVLI蛋白，c)將b)純化的突變或缺失LI蛋白HPVL1-C175A與HPVLI-AC428按照I:I的摩爾比混合，透析去除還原劑，即得到雜合VLP。d)將c)得到的雜合VLP進一步純化，收集顆粒組分。本發明還涉及一種制備疫苗的方法，其包括將本發明的HPV雜合VLP與藥學可接受的載體和/或賦形劑混合，任選地還混合一種或多種選自HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58和59的HPV型別的病毒樣顆粒或其他型別的雜合VLP。如上所論述的，所獲得的疫苗可以用于預防HPV感染或由HPV感染所導致的疾病如宮頸癌等。在另一個方面，還涉及根據本發明的雜合病毒樣顆粒在制備藥物組合物或疫苗中的用途，所述藥物組合物或疫苗用于預防HPV感染或由HPV感染所導致的疾病。本發明中相關術語的說明及解釋在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、免疫學實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規步驟。同時，為了更好地理解本發明，下面提供相關術語的定義和解釋。根據本發明，術語“HPVLI”是指人乳頭瘤病毒(HPV)的LI蛋白，其序列是本領域公知的(參見，例如NCBI數據庫序列號DQ469930.I)。在本發明中，當涉及HPVLI的序列時，參考IshiiY，TanakaK，KandaT.Virology.(2003)，308(I)，128-36。其使用NCBI數據庫序列號DQ469930.I進行描述。根據本發明，術語“HPVLI突變體蛋白”是指，在LI蛋白中的某一位或某幾位半胱氨酸(C)殘基進行缺失或用其它氨基酸殘基置換所獲得的蛋白質，非必需地包括對LI蛋白進行N端或C端的缺失。根據本發明，術語“HPVX-CYZ”是指，用Z氨基酸殘基置換HPVX型LI蛋白質第Y位的半胱氨酸(C)殘基所獲得的蛋白質，其中X是指HPV的型別，Y是指GenBankABR)6542.1(其核苷酸序列為DQ469930.I)氨基酸序列的從N端甲硫氨酸(M)開始計數的氨基酸所處的位置，如X=16，Y=175是指ABR)6542.I氨基酸序列的第175位氨基酸半胱氨酸C，非HPV16型別的Y值則指將目標蛋白序列與ABR)6542.I氨基酸序列進行序列比對(可使用Blast、FaSta、CluSter等程序)后，相應于ABR)6542.I氨基酸序列的位置。如“HPV16-C175A”指用丙氨酸(A)殘基置換HPV16型LI蛋白質ABR)6542.I的第175位的半胱氨酸(C)殘基所獲得的蛋白質；“HPV52-C175A”指用丙氨酸(A)殘基置換HPV52型LI蛋白質中對應于ABR)6542.I氨基酸序列的第175位殘基的半胱氨酸殘基(C)后所獲得的蛋白質。根據本發明，術語“HPVX-ACY”是指，將HPVX型LI蛋白質的第Y位的半胱氨酸(C)殘基缺失所獲得的蛋白質，其中氨基酸位置編號適用以上定義。如“HPV16-AC428”指將HPV16型LI蛋白質ABR)6542.I的第428位半胱氨酸殘基缺失后所獲得的蛋白質；“HPV52-AC428”指將HPV52型LI蛋白質中對應于ABR)6542.I氨基酸序列的第428位殘基的半胱氨酸殘基(C)缺失后所獲得的蛋白質。根據本發明，術語“雜合顆粒”是指，將2種或2種以上型別經突變后不能單獨組裝形成VLP的LI蛋白混合組裝，所形成的VLP。根據本發明，術語“X與Y雜合VLP”是指，將X與Y蛋白混合組裝，所形成的雜合VLP0如“HPV16L1-C175A與HPV52LI-AC428雜合VLP”是指將HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428蛋白混合組裝，所形成的雜合VLP。根據本發明，術語“變體”是指這樣的蛋白，其氨基酸序列與本發明的突變的HPVLI蛋白的氨基酸序列具有一個或多個(例如1-10個或1-5個或1-3個)氨基酸不同(例如保守氨基酸置換)或者具有至少60%，80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，或99%的同一性，并且其保留了所述截短蛋白的必要特性。此處術語“必要特性”可以是如下特性中的一個或者多個能夠誘導針對該型HPV的中和抗體；能夠在大腸桿菌中可溶性地表達；利用本發明所涉及的表達純化方法能夠獲得高產率的純化蛋白。根據本發明，術語“同一性”用于指兩個多肽之間或兩個核酸之間序列的匹配情況。當兩個進行比較的序列中的某個位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據時(例如，兩個DNA分子的每一個中的某個位置都被腺嘌呤占據，或兩個多肽的每一個中的某個位置都被賴氨酸占據)，那么各分子在該位置上是同一的。兩個序列之間的“百分數同一性”是由這兩個序列共有的匹配位置數目除以進行比較的位置數目XlOO的函數。例如，如果兩個序列的10個位置中有6個匹配，那么這兩個序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(總共6個位置中有3個位置匹配)。通常，在將兩個序列比對以產生最大同一性時進行比較。這樣的比對可通過使用，例如，可通過計算機程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地進行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48=443-453的方法來實現。還可使用已整合ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和ff.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAMl20權重殘基表(weightresiduetable)、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分來測定兩個氨基酸序列之間的百分數同一丨I"生。此外，可使用已整合入GCG軟件包(可在www.gcg.com上獲得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(JMoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣以及16、14、12、10、8、6或4的缺口權重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的長度權重來測定兩個氨基酸序列之間的百分數同一性。如本文中使用的，術語“保守置換”意指不會不利地影響或改變包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物學活性的氨基酸置換。例如，可通過本領域內已知的標準技術例如定點誘變和PCR介導的誘變引入保守置換。保守氨基酸置換包括用具有相似側鏈的氨基酸殘基替代氨基酸殘基的置換，例如用在物理學上或功能上與相應的氨基酸殘基相似(例如具有相似大小、形狀、電荷、化學性質，包括形成共價鍵或氫鍵的能力等)的殘基進行的置換。已在本領域內定義了具有相似側鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側鏈(例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、3分支側鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，優選用來自相同側鏈家族的另一個氨基酸殘基替代相應的氨基酸殘基。鑒定氨基酸保守置換的方法在本領域內是熟知的(參見，例如，Bru_ell等人，Biochem.32:1180-1187(1993);Kobayashi等人ProteinEng.12(10):879-884(1999);和Burks等人Proc.NatlAcad.SetUSA94:412-417(1997)，其通過引用并入本文)。根據本發明，術語“大腸桿菌表達系統”是指由大腸桿菌(菌株)與載體組成的表達系統，其中大腸桿菌(菌株)來源于市場上可得到的菌株，例如但不限于GI698、ER2566、BL21(DE3)、B834(DE3)、BLR(DE3)等等。根據本發明，術語“載體(vector)”是指，可將多核苷酸插入其中的一種核酸運載工具。當載體能使插入的多核苷酸所編碼的蛋白獲得表達時，載體稱為表達載體。載體可以通過轉化，轉導或者轉染導入宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞中獲得表達。載體是本領域技術人員公知的，包括但不限于質粒；噬菌體；柯斯質粒等等。可用于本發明的方法中的緩沖液是本領域公知的，包括但不限于，Tris緩沖液，磷酸鹽緩沖液，HEPES緩沖液，MOPS緩沖液等等。根據本發明的HPV雜合病毒樣顆粒可通過如下步驟獲得將上述純度至少95%的突變或缺失的HPVLI蛋白按I:I的摩爾比混合組裝；去除該溶液中的還原劑，得到所述HPV雜合病毒樣顆粒。去除還原劑的方式是本領域已知的，包括但不限于，透析，超濾或者層析等。根據本發明，術語“藥學可接受的載體和/或賦形劑”是指在藥理學和/或生理學上與受試者和活性成分相容的載體和/或賦形劑，其是本領域公知的(參見例如Remington'sPharmaceuticalSciences.EditedbyGennaroAR,19thed.PennsylvaniaMackPublishingCompany,1995),并且包括但不限于pH調節劑，表面活性劑，佐劑，離子強度增強劑。例如，PH調節劑包括但不限于磷酸鹽緩沖液；表面活性劑包括但不限于陽離子，陰離子或者非離子型表面活性劑，例如Tween-80;佐劑包括但不限于鋁佐劑(例如氫氧化鋁)，弗氏佐劑(例如完全弗氏佐劑)；離子強度增強劑包括但不限于氯化鈉。發明的有益效果目前制備HPV病毒樣顆粒均為單一型別LI組裝形成的VLP，主要誘導針對同型HPV的中和抗體，產生針對同型HPV的保護性免疫，僅在一些同源性高的型別之間存在交叉保護。因此，現有的HPV疫苗的保護范圍有限。如果要擴大HPV疫苗的保護范圍只能通過增加疫苗中所含有的HPVVLP型別來實現。這將大大提高HPV疫苗的生產成本，并可能因為免疫劑量增加而帶來潛在的安全性問題。雖然有研究表明，HPVLI蛋白的175位和428位半胱氨酸對于病毒樣顆粒組裝可能其重要作用，突變或刪除這些氨基酸可能影響HPVVLP的形成，但是本發明經過突變分析和組裝條件摸索，卻出乎意料地發現，這些半胱氨酸只影響同種型別HPVLI蛋白組裝成VLP，但是這種影響卻可以通過不同型別HPVLI來消除，從而發明制備不同型別HPVLI組裝雜合VLP的方法，這種方法完全排除了同種型別HPVLI蛋白組裝成為VLP的可能性，因為單獨型別的HPVLI蛋白的175位或428位突變體自身無法形成VLP，只有與其他型別的HPVLI蛋白突變體相互補才能形成雜合型的VLP，這樣的方法不僅可以應用于HPVVLP的結構和組裝機理研究，以及疫苗制備的用途，也可應用于基于HPVVLP結構和組裝的納米材料及相關的研究。將不同型別LI蛋白雜合組裝形成雜合具有免疫原性好，易產生非疫苗型別的交叉保護等優點，但如采用不同型別LI蛋白直接混合組裝成VLP，不僅組裝效率低，組裝成的VLP形態也較差，同時還存在可能存在各種配比而VLP不均一的問題，限制了雜合VLP的工業化的制備，嚴重影響了獲得的雜合VLP的免疫原性。本發明提供的雜合VLP和其制備方法有效的解決了上述問題。首先，本發明采用突變后單獨無法組裝成VLP的LI蛋白為原料，確保了其易于制備。其次，用該突變蛋白以一定的條件和比例組裝制備雜合VLP，能夠獲得高組裝效率的雜合VLP，且組裝比例一致，組裝得到的雜合VLP狀態均一。進一步，該雜合VLP在同等劑量下能比同種VLP混合免疫在體內獲得更高滴度的中和抗體，具有更好的免疫原性，此外，還能獲得更高滴度的非疫苗型別的中和抗體，與混合的多價VLP相比，更適合作為疫苗使用。下面將結合附圖和實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將理解，下列附圖和實施例僅用于說明本發明，而不是對本發明的范圍的限定。根據附圖和優選實施方案的下列詳細描述，本發明的各種目的和有利方面對于本領域技術人員來說將變得顯然。圖I顯示了實施例I中經HIC(疏水相互作用色譜)純化獲得的HPV-Ll突變體的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果。泳道M:蛋白分子量標記；泳道I:HPV16L1-C175A經HIC(疏水相互作用色譜)純化洗脫級分；泳道2:HPV16L1-AC428經HIC(疏水相互作用色譜)純化洗脫級分；泳道3HPV52L1-C175A經HIC(疏水相互作用色譜)純化洗脫級分；泳道4HPV52L1-AC428經HIC(疏水相互作用色譜)純化洗脫級分；結果顯示，經過ButylSepharose4FastFlow柱純化后，HPV16L1-C175A、HPV16L1-AC428、HPV52L1-C175A、HPV52L1-AC428蛋白純度達到95%以上。圖2顯示了實施例2中所得的HPV-Ll突變體蛋白復性后透射電鏡觀察(放大100，000倍，Bar=0.Ii!m)結果。圖2A，復性后的HPV16L1-C175A蛋白；圖2B，復性后的HPV16L1-AC428蛋白；圖2C，復性后的HPV52L1-C175A蛋白；圖2D，復性后的HPV52L1-AC428蛋白。結果顯示，在這4個圖的視野中可見大量半徑在5nm左右的五聚體，沒有病毒樣顆粒存在。圖3顯示了實施例3中所述方法制備的HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428在不同的緩沖液條件下，按摩爾比I:I組裝的雜合VLP的透射電鏡觀察結果(100，000倍，Bar=0.Ium)o圖3A,HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428在50mMPB(磷酸鈉緩沖液)，pH6.0,0.5MNaCl組裝成的雜合VLP;圖3B，HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428在20mMPB，pH6.5,0.5MNaCl組裝成的雜合VLP;圖3(，冊￥16L1-C175A與HPV52L1-AC428在20mMPB，pH7.0,0.5MNaCl組裝成的雜合VLP。結果顯示，圖3A視野中可見大小不均一半徑為20nm左右的病毒樣顆粒，圖3B視野中可見大小均一，半徑30nm左右的病毒樣顆粒，圖3C視野中可見大量半徑在5nm左右的五聚體，沒有病毒樣顆粒存在。圖4顯示了實施例4中所述方法制備的HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428按不同的摩爾比例組裝的雜合VLP的凝膠過濾層析的結果。結果顯示，HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428按摩爾比I:I組裝的雜合VLP顆粒組裝比例比較合適，五聚體剩余最少。圖5顯示了實施例4中所述的方法制備的HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428按不同的摩爾比例組裝的雜合VLP的透射電鏡觀察結果(100，000倍，Bar=0.Iiim)。圖5A,HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428按摩爾比2.5I組裝的雜合VLP；圖5B,HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428按摩爾比2I組裝的雜合VLP;圖5C，HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428按摩爾比II組裝的雜合VLP;圖HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428按摩爾比I:2組裝的雜合VLP。結果顯示，圖5A視野中可見大量半徑在5nm左右的五聚、體，沒有病毒樣顆粒存在。圖5B視野中可見大小不均一，半徑20-30nm左右的病毒樣顆粒；圖5C視野中可見大小均一，半徑30nm左右的病毒樣顆粒；圖5D視野中視野中可大小不均一的，半徑20nm左右的病毒樣顆粒，并有大量半徑在5nm左右的五聚體。圖6顯示了實施例4所述方法得到的HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428雜合VLP的冷凍電鏡觀察的結果及其重建的三維結構。圖6A，HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428雜合VLP;圖6B，HHPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428雜合VLP的重建的三維結構。重建的三維結構顯示，HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428雜合VLP是由72個殼粒(形態亞單位，五聚體)形成的T=7的二十面體結構(h=l，k=2)。與一般的符合準等價原理的二十面體病毒衣殼不同，HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428雜合VLPVLP結構中所有的組成亞單位均為五聚體，而未見六聚體，且VLP的最外圍直徑為約60nm。這與之前報道的天然HPV病毒顆粒及真核表達系統(例如，痘病毒表達系統)來源的HPVVLP的三維結構(BakerTS,NewcombWff,OlsonNH.etal.BiophysJ.(1991),60(6):1445-1456.HagenseeME,OlsonNH,BakerTS,etal.JVirol.(1994),68(7):4503-4505.BuckCB,ChengN,ThompsonCD.etal.JVirol.(2008),82(11):5190-7.)類似。圖I顯示了實施例4中制備的HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428雜合VLPSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果。泳道M:蛋白分子量標記；泳道I:HPV16L1蛋白；泳道2HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428雜合VLP;泳道3HPV52L1蛋白。結果顯示電泳結果表明HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428雜合VLP有兩條特異條帶，分別與HPV16L1、HPV52L1的條帶相一致。圖8顯示了實施例4中制備的HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428雜合VLP與HPV16特異線性抗體21A5進行蛋白質免疫印跡檢測結果。泳道M:蛋白分子量標記；泳道IHPV52L1蛋白；泳道2HPV16L1蛋白；泳道3HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428雜合VLP。結果顯示HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428雜合VLP與HPV52特異線性抗體21A5Western反應有特異性的條帶。圖9顯示了實施例4中制備的HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428雜合VLP與HPV52特異線性抗體12D10進行蛋白質免疫印跡檢測結果。泳道M:蛋白分子量標記；泳道IHPV52L1蛋白；泳道2HPV16L1蛋白；泳道3HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428雜合VLP。結果顯示HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428雜合VLP與HPV52特異線性抗體Western反應有特異性的條帶。圖10顯示了實施例4中制備的HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428雜合VLP，突變體蛋白和HPVVLP熱穩定性檢測的結果。圖11顯示了實施例7中免疫不同階段血清中和抗體滴度檢測結果。結果表明根據實施例1-4所述方法獲得的HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428、HPV52L1-C175A與HPV16L1-AC428雜合VLP具有良好的免疫原性，可在小鼠體內誘導高滴度的針對HPV16、HPV52的中和抗體。同時還產生針對HPV58、33、35的中和抗體。圖12顯示了實施例5中所述的HPV52L1-C175A與HPV16L1-AC428雜合VLP，HPV16L1-C175A與HPV6L1-AC428雜合VLP，HPV6L1-C175S與HPV16L1-AC428HPV6雜合VLP，HPV6L1-C175S與HPV52L1-AC428HPV52L1-C175S，HPV52L1-C175A與HPV6L1-AC428雜合VLP在儲存緩沖液中的透射電鏡觀察結果(100，000倍，Bar=0.Iiim)。圖12A，HPV52L1-C175A與HPV16L1-AC428雜合VLP；圖12B,HPV16L1-C175A與HPV6L1-AC428雜合VLP;圖12C,HPV6L1-C175S與HPV16L1-AC428HPV6雜合VLP；圖12D,HPV6L1-C175S與HPV52L1-AC428雜合VLP;圖12E，HPV52L1-C175A與HPV6L1-AC428雜合VLP。結果顯示，視野中均可見大小較均一半徑為25nm左右的病毒樣顆粒。具體實施例方式現參照下列意在舉例說明本發明(而非限定本發明)的實施例來描述本發明。除非特別指明，本發明中所使用的分子生物學實驗方法和免疫檢測法，基本上參照J.Samtoook等人，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人,精編分子生物學實驗指南,第3版,JohnWiley&Sons,Inc.,1995中所述的方法進行；限制性內切酶的使用依照產品制造商推薦的條件。本領域技術人員知曉，實施例以舉例方式描述本發明，且不意欲限制本發明所要求保護的范圍。實施例I.用于構建雜合病毒樣顆粒的HPVLI突變蛋白的表達與純化構津HPVLI突變蛋白表汰載體基因克隆采用定點突變PCR反應來進行，使用的初始模板包括PT0-I7-HPV16L1N30C質粒(在表I中簡寫為16L1)，pT0-I7-HPV52LlN40C質粒(在表I中簡寫為52L1)，PT0-T7-HPV6L1N5C質粒(在表I中簡寫為6L1)。各個PCR反應的模板、弓丨物見表1，PCR反應擴增條件設為94°C變性10分鐘，25個循環的“94°C變性50秒，指定溫度退火一定時間，72°C延伸50秒”，最后72°C延伸10分鐘。所使用的PCR引物的序列列于表2。表I.構建突變HPVLI蛋白的各PCR反應條件表2:用于構建突變HPVLI蛋白的引物序列(SEQIDNO19-30)SEQIDNO:引物名稱_引物序列_19HPV16L1-C175A-F5，TGWGCAAAGGATCCCCAAGTACCAATGTTGCAGTAAAT-3520HPV16L1-C175A-R5，-AnTACTGCAACATTGGTACTTGGGGATCCnTGCC-3’21HPV16L1-AC428-F5-ACATCCCAGGCAAITGCTCAAAAACATACACCT-3’22HPV16L1-AC428-R5，-AGGTGTATGTTTnGAGCMITGCCTGGGATGT-3’23HPV52L1-C175A-F5，GGCAAGGGCACCCCCGCCAACAACAACAGCGGCAAC-3，24HPV52L1-C175A-R5，GrTGCCGCTGTTGTTGITGGCGGGGGTGCCCTTGCC-3，25HPV52L1-AC428-F5，AGCACCGCCATCACCCAGAAGAACACCCCCCCCAAG~3，26HPV52L1-AC428-R5，CrrGGGGGGGGTGTTCITCTGGGTGATGGCGGTGCT-3，27HPV6L1-C175S-F5，TGGGGTAAAGGTAAACAGGCCACTMTACACCTGTACAG~328HPV6L1-C175S-R5，CTGTACAGGTGTAmGTGGCCTGnTACCTTTACCCCA-329HPV6L1-AC428-F5’CAGTCACAGGCCAITACCCAAAAGCCCACTCCTGAAAAG^30_HPY6L1-AC428-R5TTCAGGAGTGGGCmTGGGTAATGGCCTGTGACTG~3_PCR擴增得到產物(50uL)加入2uLDpnI限制性內切酶，在37°C處理60min。取IOuL轉化40uL以氯化鈣法制備的感受態大腸桿菌ER2566(購自新英格蘭生物實驗室公司)細菌，將其涂布于含卡那霉素(終濃度25mg/mL，下同)的固體LB培養基(LB培養基成分10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化鈉，下同)，并37°C靜置培養10-12小時至單菌落清晰可辨。挑取單菌落至含4mL液體LB培養基(含卡那霉素)的試管，在37°C220轉/分鐘下振蕩培養10小時，從中取ImL菌液于_70°C保存。利用17引物，測得pT0_T7質粒中插入的目的片段的核苷酸序列分別為SEQIDN0:13、14、15、16、17、18，其編碼的氨基酸序列為SEQIDNO:4、5、6、7、8、9。權利要求1.包含兩個或更多個不同型別的HPVLI蛋白的雜合病毒樣顆粒，其中所述HPVLI蛋白在第175位與428位半胱氨酸發生置換和/或缺失。2.權利要求I的雜合病毒樣顆粒，其中所述雜合病毒樣顆粒包括來源于一種基因型的HPVL1-C175置換突變體和來自另一種不同基因型的HPVL1-C428缺失突變體。3.權利要求I的雜合病毒樣顆粒，其中所述雜合病毒樣顆粒包括來源于一種基因型的HPVL1-C428置換突變體和來自另一種不同基因型的HPVL1-C175缺失突變體。4.權利要求1-3任一項的雜合病毒樣顆粒，其中所述HPVLI的置換突變體選自C175A置換突變體，C175S置換突變體，C428A置換突變體，C428S置換突變體。5.權利要求1-3任一項的雜合病毒樣顆粒，其中所述HPVLI的缺失突變體選自AC175缺失突變體，AC428缺失突變體。6.權利要求1-5任一項的雜合病毒樣顆粒，其中所述HPVLI蛋白突變體源自下列兩種或更多種HPV基因型HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58和59，優選為HPV16,52和6，最優選為HPV16L1-C175A與HPV52L1-AC428、HPV52L1-C175A與HPV16L1-AC428、HPV16L1-C175A與HPV6L1-AC428、HPV52L1-C175A與HPV6L1-AC428、HPV6L1-C175S與HPV16L1-AC428或HPV6L1-C175S與HPV52L1-AC428雜合病毒樣顆粒。7.權利要求1-6任一項的雜合病毒樣顆粒，其中組裝成雜合病毒樣顆粒的兩種不同型別的HPVLI蛋白的配比為I:1，2:I或I:2。8.制備權利要求1-7任一項的雜合病毒樣顆粒的方法,包括a)在大腸桿菌中表達所述突變或缺失HPVLI蛋白，b)將表達所述突變或缺失HPVLI蛋白純化，得到純度95%以上的突變或缺失HPVLI蛋白，c)將b)純化的突變或缺失的HPVLI蛋白按照I:I的摩爾比混合，透析去除還原劑，即得到雜合VLP;優選地，所述方法包括將所制備的雜合病毒樣顆粒與藥學可接受的載體和/或賦形劑混合，以制備用于預防HPV感染或由HPV感染所導致的疾病如宮頸癌的疫苗。全文摘要本發明涉及人乳頭瘤病毒型別雜合病毒樣顆粒及其制備方法。所述病毒樣顆粒可用于預防兩種或兩種以上HPV感染及由HPV感染所導致的疾病。本發明還涉及上述蛋白和病毒樣顆粒用于制備藥物組合物或疫苗的用途，所述藥物組合物或疫苗用于預防HPV感染及由HPV感染所導致的疾病如宮頸癌、尖銳濕疣等。文檔編號A61P31/20GK102747047SQ20121004712公開日2012年10月24日申請日期2012年2月28日優先權日2012年2月28日發明者夏寧邵,張軍,李少偉,王大寧,顧穎,魏旻希申請人:廈門萬泰滄海生物技術有限公司,廈門大學