專利名稱：一種預防帕金森病的中藥組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種中藥組合物，具體地說，是一種預防帕金森病的中藥組合物。
背景技術：
帕金森病(Parkinson’ s disease, PD)是中老年人常見的神經系統退行性疾患， 主要與黑質致密區多巴胺能神經元變性缺失及由此造成的黑質紋狀體通路多巴胺遞質減少有關。經過多年的臨床實踐，一般認為，左旋多巴仍是最有效的藥物。但長期應用后大部分患者會出現癥狀波動、運動障礙和精神癥狀。加之實驗室發現高濃度多巴胺(dopamine， DA)和左旋多巴由于自身氧化產生自由基，可導致神經細胞變性壞死。因此，聯合其他藥物共同預防H)和H)運動并發癥十分迫切。此外，研究發現紋狀體GRKs和Arrestins表達的變化與H)的發展關系密切。近年研究表明，帕金森病運動并發癥的發生與表達Dl受體的直接通路及其下游cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)、ERK等信號轉導通路被激活關系密切，其下游信號轉導蛋白多巴胺和環磷腺苷調節的憐酸化蛋白-32 (dopamine and cAMP-regulated phosphoprotein of Mr 32000, DARPP-32)的蛋白Thr75位點磷酸化表達的改變可能參與了異動癥(levodopa-induced dyskinesia, LID)的發病。目前認為使用左旋多巴控釋劑、多巴胺受體激動劑、B型單胺氧化酶(monoamine oxidase-B type,MAO-B)抑制劑和兒茶酌氧位-甲基轉移酶抑制劑(eateehol-O-methyl transferase inhibitor,C0MTI)可延緩運動并發癥的出現。但這些藥物往往副作用較大， 容易形成耐藥性，不宜長期服用。我國在中醫藥預防PD方面積累了豐富經驗，總結其預防原則是益氣活血法，育陰潛陽法，平肝熄風法，揉筋熄風法，活血化瘀法和通絡熄風等法則。中國專利文獻CN100409867C公開了一種熄風止顫膠囊，提供了由白芍、鉤藤等組成的復方中藥，預防ro，改善震顫癥狀、肌強直、運動不能癥狀。李敏等提出了補腎活血中藥可以改善ro患者運動并發癥癥狀，且療效隨預防時間延長而增加，該補腎活血中藥由山萸肉10g，何首烏15g，丹參15g，水蛭6g等中藥組成，但沒有公開其他中藥成分 (詳見李敏等.補腎活血顆粒預防帕金森病運動并發癥臨床研究.中華中醫藥雜志， 2011, 26(6) : 1296-1299.)。但是關于一種預防帕金森病的中藥組合物目前還未見報道。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種中藥組合物在制備預防帕金森病的疾病藥物中的應用。本發明的再一的目的是，提供一種預防帕金森病的中藥組合物。為實現上述目的，本發明采取的技術方案是一種中藥組合物在制備預防帕金森病的疾病藥物中的應用，所述的中藥組合物由以下重量份的原料藥制成天麻5-12份、黃芪5-10份、熟地黃5-10份、白芍藥5-15份、當歸5-10份、鉤藤5_10份、僵蠶2_10份。所述的中藥組合物由以下重量份的原料藥制成天麻6-10份、黃芪6-9份、熟地黃6-9份、白芍藥8-13份、當歸6-7份、鉤藤6-9份、僵蠶4_6份。所述的中藥組合物由以下重量份的原料藥制成天麻8份、黃芪8份、熟地黃8份、 白芍藥10份、當歸7份、鉤藤8份、僵蠶6份。所述的中藥組合物在制備預防帕金森病運動并發癥的疾病藥物中的應用。為實現上述第二個目的，本發明采取的技術方案是一種預防帕金森病的中藥組合物，所述的中藥組合物由以下重量份的原料藥制成天麻5-12份、黃芪5-10份、熟地黃
5-10份、白芍藥5-15份、當歸5-10份、鉤藤5-10份、僵蠶2_10份。所述的中藥組合物由以下重量份的原料藥制成天麻6-10份、黃芪6-9份、熟地黃
6-9份、白芍藥8-13份、當歸6-7份、鉤藤6-9份、僵蠶4_6份。所述的中藥組合物由以下重量份的原料藥制成天麻8份、黃芪8份、熟地黃8份、 白芍藥10份、當歸7份、鉤藤8份、僵蠶6份。所述的中藥組合物在制備預防帕金森病運動并發癥的疾病藥物中的應用。所述的中藥組合物的劑型是片劑、膠囊劑、顆粒劑、合劑、口服液或糖漿劑。本發明優點在于
1、本發明的中藥組合物，其配伍符合中藥“君臣佐使”原則，藥味數較少，具有療效高、 無毒副作用、價格低等優點，采用益氣活血法，育陰潛陽法，平肝熄風法，揉筋熄風法，活血化瘀法和通絡熄風等法則，從病原根本入手，對癥下藥，以達到預防的效果；
2、制備方法簡單，成本低，對環境友好，適于長期服用，是一種安全有效的預防帕金森病和帕金森病運動并發癥的中藥組合物，具有良好的應用前景。


附圖I是不同劑量組中藥對ro大鼠模型AIM總分的影響，#小劑量組與西藥組比較，均P〈0. 05 ;*中劑量組與小劑量組比較，均P〈0. 05 ;+大劑量組與中劑量組比較，均 Ρ〈0·05。附圖2是不同劑量中藥組合物對ro大鼠模型劑峰旋轉次數的影響，#西藥組與小劑量組比較，均p〈0. 05 ;*中劑量組與小劑量組比較，均P〈0. 01 ；+大劑量組與中劑量組比較，均 Ρ〈0· 05。附圖3是中藥組合物不同劑量對H)模型大鼠紋狀體區GRK6的影響的免疫組化結果，I為假手術組，2為ro對照組，3為西藥組，4為TCM-小劑量組，5為TCM-中劑量組，6為 TCM-大劑量組；U為未損傷側，L為損傷側；*ro對照組與假手術組比較P〈0. 01，#西藥組與 PD對照組比較Ρ〈0· 05，+TCM組與西藥組比較，均Ρ〈0· 05。附圖4是中藥組合物不同劑量對H)模型大鼠紋狀體區GRK6的影響的Western結果，1、2為假手術組，3、4為H)對照組，5、6為西藥組，7、8為TCM-小劑量組，9、10為TCM-中劑量組，11、12為TCM-大劑量組；1、3、5、7、9、11為未損傷側，2、4、6、8、10、12為損傷側;* 與假手術組比較，P〈0. 01 ；#與PD對照組比較，ρ〈0· 05 ；+TCM與西藥組比較，ρ〈0· 01。附圖5是中藥不同劑量對F1D運動并發癥大鼠模型紋狀體區β -arrestinl的影響的免疫組化結果，I為假手術組，2為H)對照組，3為西藥組，4為TCM-小劑量組，5為TCM-中劑量組，6為TCM-大劑量組；U為未損傷側，L為損傷側。附圖6是中藥不同劑量對F1D運動并發癥大鼠模型紋狀體區β -arrestinl的影響的Western結果，1、2為假手術組，3、4為H)對照組，5、6為西藥組，7、8為TCM-小劑量組， 9、10為TCM-中劑量組，11、12為TCM-大劑量組；1、3、5、7、9、11為未損傷側，2、4、6、8、10、 12為損傷側。附圖7是中藥不同劑量對ro運動并發癥大鼠模型紋狀體區磷酸化DARPP-3 2 (Thr75)表達的影響的免疫組化結果，A假手術組，B為H)對照組，C為西藥組，D為TCM-小劑量組，E為TCM-中劑量組，F為TCM-大劑量組。附圖8是中藥不同劑量對ro運動并發癥大鼠模型紋狀體區磷酸化DARPP-32 (Thr75 )表達的影響的Western結果，I為假手術組，2為LID對照組，3為西藥組，4為 TCM-小劑量組，5為TCM-中劑量組，6為TCM-大劑量組。附圖9是中藥不同劑量對H)運動并發癥大鼠模型紋狀體區磷酸化ERK1/2表達的影響的免疫組化結果，A假手術組，BSro對照組，C為西藥組，D為TCM-小劑量組，E為 TCM-中劑量組，F為TCM-大劑量組。附圖10是中藥不同劑量對H)運動并發癥大鼠模型紋狀體區磷酸化ERK1/2表達的影響的Western結果，I為假手術組，2為H)對照組，3為TCM-小劑量組，4為TCM-中劑量組，5為TCM-大劑量組。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明提供的具體實施方式
作詳細說明。本發明提供一種預防帕金森病的中藥組合物，所述的中藥組合物由以下重量份的原料藥制成天麻5-12份、黃芪5-10份、熟地黃5-10份、白芍藥5-15份、當歸5_10份、鉤藤5-10份、僵蠶2-10份。實施例I中藥組合物的制備(一)
天麻5份、黃芪10份、熟地黃5份、白芍藥15份、當歸5份、鉤藤10份、僵蠶2份，常規方法煎煮。實施例2中藥組合物的制備(二)
天麻6份、黃芪9份、熟地黃6份、白芍藥14份、當歸6份、鉤藤9份、僵蠶3份，常規方法煎煮。實施例3中藥組合物的制備(三)
天麻7份、黃芪7份、熟地黃7份、白芍藥12份、當歸8份、鉤藤7份、僵蠶4份，常規方法煎煮。實施例4中藥組合物的制備(四)
天麻8份、黃芪8份、熟地黃8份、白芍藥10份、當歸7份、鉤藤8份、僵蠶6份，常規方法煎煮。實施例5中藥組合物的制備(五)
天麻9份、黃芪6份、熟地黃9份、白芍藥9份、當歸9份、鉤藤6份、僵蠶5份，常規方法煎煮。實施例6中藥組合物的制備(六)
天麻10份、黃芪5份、熟地黃10份、白芍藥8份、當歸10份、鉤藤5份、僵蠶7份，常規
方法煎煮。
實施例7中藥組合物的制備(七)
天麻11份、黃芪10份、熟地黃8份、白芍藥7份、當歸8份、鉤藤10份、僵蠶8份，常規
方法煎煮。實施例8中藥組合物的制備(八)
天麻12份、黃芪8份、熟地黃6份、白芍藥5份、當歸6份、鉤藤8份、僵蠶10份，常規方法煎煮。需要說明的是，實施例1-8所述的常規方法煎煮是中藥湯劑常規的制作方法，即將所述的原料藥加水煎煮成湯劑。實施例9中藥組合物片劑/膠囊劑的制備
取實施例1-8任一所述的中藥組合物，加6-10倍量水，煎煮1-3小時，濾出藥汁。再加 6-10倍量水，煎煮O. 5-2小時，濾出藥汁，合并二次煎液，靜置，濾取上清液，濃縮，放冷，加濃縮液2-3倍量酒精，攪拌沉淀過夜。取上清液，濃縮至稠浸膏，或濃縮至稠浸膏干燥制備成顆粒；加入制藥輔料，真空干燥，粉碎制粒，壓制成片劑或填充裝膠囊。實施例10中藥組合物顆粒劑的制備
取實施例1-8任一所述的中藥組合物，加6-10倍量水，煎煮1-3小時，濾出藥汁。再加 6-10倍量水，煎煮O. 5-2小時，濾出藥汁，合并二次煎液，靜置，濾取上清液，濃縮，放冷，加濃縮液2-3倍量酒精，攪拌沉淀過夜。取上清液，濃縮至稠浸膏，或濃縮至稠浸膏干燥制備成顆粒；加適當制藥輔料，制粒，干燥，整粒，得顆粒，分裝。實施例11中藥組合物合劑/ 口服液/糖漿劑的制備
取實施例1-8任一所述的中藥組合物，加6-10倍量水，煎煮1-3小時，濾出藥汁。再加
6-10倍量水，煎煮O. 5-2小時，濾出藥汁，合并二次煎液，靜置，濾取上清液，濃縮，放冷，加濃縮液2-3倍量酒精，攪拌沉淀過夜。取上清液，濃縮至稠浸膏，或濃縮至稠浸膏干燥制備成顆粒；加適當制藥輔料，制成合劑、口服液或糖衆劑。實施例12本發明的中藥組合物的臨床前試驗一、實驗方法
I. ro大鼠模型制備根據巴茂文等方法制備ro大鼠模型。取65只大鼠進入實驗，其中5只為假手術組，于內側前腦束(MFB)注射生理鹽水。腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠， 嚴格平頭顱位固定大鼠于腦立體定向儀，參照包新民所著大鼠腦立體定向圖譜，確定右側前腦內側束(right medical forebrain, MFB)坐標①前囟后3. 7 mm,矢狀縫右側I. 7 mm, 盧頁骨骨膜下7. 8 mm,門齒線2. 4 _ 前囟后4. 4 mm,矢狀縫右側I. 2 mm,盧頁骨骨膜下7. 8 mm,門齒線2. 4 mm。按上述確定的注射位點鉆孔，用10 μ I的微量注射器抽取6-0HDA6 μ I (含O. 2%維生素C的生理鹽水配置，濃度4 μ g/μ 1)，每點注射3μ 1，留針10 min后退針， 縫合創面。3周后，大鼠腹腔注射阿樸嗎啡(0.5 mg / kg)，平均旋轉頻率>7次/min為成功H)模型。模型制備與行為學測定將25只成功的H)模型隨機分為3大組。(I)PD對照組 PD模型大鼠腹腔注射O. 2%維生素C液29天；(2)西藥處理組腹腔注射左旋多巴甲酯+ 芐絲肼(50 mg/kg左旋多巴甲酯和25 mg/ kg芐絲肼，溶于含O. 2%維生素C的消毒生理鹽水中)，2次/d (上午9點和下午5點)，持續29d ; (3)中藥組合物小劑量組(TCM-小劑量組)、中藥組合物中劑量組(TCM-大劑量組)、中藥組合物大劑量組(TCM-大劑量組)給予左旋多巴甲酯/芐絲肼的基礎上分別加用本發明的中藥組合物，9 ml /kg，每日I次灌胃， 連續4周。中藥組合物中劑量組參照實施例4所述的方法制備中藥組合物；中藥組合物大劑量組按照中劑量組各中藥原料藥各增加20% ;中藥組合物小劑量組按照中劑量組各中藥原料藥各減少20%。在治療過程中于第2、8、15、22、29天上午用藥后進行大鼠行為學觀察和評分。AM評定AM分成4個組分(上肢AM、口面部AM、軸性AM和旋轉AM)進行評定， 每部分又根據其有無和嚴重程度分為5個等級(0-4):0無；I持續時間小于30s ;2持續時間大于30s，小于60s ；3持續時間大于60s，外界刺激可使之停止；4持續時間大于60s，外界刺激不能使之停止。用藥后每20min評估一次，每次觀察lmin。AM總分按觀察時間內總積分的平均值進行統計，理論上I只大鼠一次用藥后各組分AIM最大評分為4分，總AIM 評分為16分。劑峰旋轉次數注射左旋多巴后，每5min記錄旋轉次數，最多的旋轉次數為劑峰旋轉次數。免疫組化顯示紋狀體β -arrestinl、GRK6、DARPP-32 (Thr75)和 ERK1/2 的變化 結束注射后12h，3%戊巴比妥鈉麻醉，左心室灌注4%多聚甲醛固定，斷頭取腦后相同固定液中后固定8h，經修塊、梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟后用石蠟包埋。行石蠟切片，切片厚度為5μηι。石臘切片脫臘至水；3%雙氧水室溫避光孵育5min,以消除內源性過氧化氫酶活性；PH7. 7的lnmol/1乙二胺四乙酸-三羥甲基氨基甲烷-氯化氫(EDTA-Tris-HCl微波加熱修復；1%牛血清白蛋白室溫封20min ;兔抗鼠GRK6抗體、兔抗鼠β -arrestinl多克隆抗體、兔抗鼠DARPP-32抗體、抗磷酸化DARPP-32 (Thr75)抗體、兔抗大鼠總ERK1/2和兔抗大鼠磷酸化ERK1/2單克隆抗體4°C濕盒內孵育過夜；滴加稀釋的生物素標記二抗， 37°C孵育20min ;滴加稀釋的辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素，37°C孵育20min ;聯苯二胺 (3, 3 " -diaminobenzidine tetrahydrochloride, DAB)顯色劑顯色，自來水沖洗，之后脫水、透明、封片。各步驟之間均用O.Olmol/1 TBS充分漂洗，TBS代替一抗作為陰性對照。在顯微鏡下觀察免疫組化切片，各觀察區隨機取5個不重疊視野，于高倍鏡(10X40)下觀察， 采用0LYMPUS-IX50成相系統拍攝，Image-Pro Plus 5. I圖象處理軟件進行半定量分析，計算陽性細胞指數(IOD) =陽性細胞面積X校正光密度值(測量區光密度一背景光密度)。法檢測β-arrestinl、GRK6、DARPP-32 (Thr75)和 ERK1/2 的表達最后一次注射后3h，3%戊巴比妥鈉麻醉，迅速斷頭取腦，冰上剝離雙側紋狀體，超聲裂解，提取總蛋白。測定蛋白濃度后，置_80°C凍存備用。40 μ g蛋門樣本經10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，以電轉膜儀轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。封閉液(5%脫脂奶粉)室溫封閉2h,按照相應濃度稀釋抗GRK6抗體(I 500)、抗β -arrestinl抗體 (1:500)、抗總 DARPP-32 抗體(I 1000)或抗磷酸化 DARPP-32 (Thr75)抗體(I :1000)、抗總 ERK1/2 抗體(I 1000)或抗磷酸化 ERK1/2 抗體(I 500)或抗 β -actin (I 1000),4°C 輕搖孵育過夜。次日加入二抗，室溫下搖床孵育I h;滴加ECL顯色混合液，Bio-Rad凝膠成像儀曝光、顯像。Western blot圖像采用SmartView2000圖像分析軟件計算各樣本目的蛋白條帶OD值與面積值的乘積，從而進行蛋白條帶密度定量。統計分析方法
實驗數據采用SPSS 13.0統計軟件進行分析。所得計量資料以均數土標準差( I 土s)表示，多個樣本均數的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。以P〈0.05 為差異具有統計學意義。
二、結果
I.中藥組合物對ro大鼠模型行為的影響
I.I中藥組合物對ro大鼠模型各組分AIM評分的影響
就口面部AIM評分而言，第2天各組間均值無顯著差異。第8、15、22、29天各組間均值差異顯著(/^=4. 981=22. 701=30. 961=23. 27，/X0. 01)。其中小劑量組在第22天口面部 AM評分較西藥處理組降低，差異有統計學意義(t=2. 50, P<0. 05)，其余幾天差異均無統計學意義；中劑量組第8、15、22、29天口面部AIM評分較小劑量組明顯降低，差異有統計學意義(t=2. 86、t=3. 80、t=4. 38、t=6. 54，均/XO. 05);中劑量組與大劑量組比較，僅于第22天大劑量組較中劑量組口面部AIM評分降低，差異有統計學意義( =2. 50，7X0.05)。就上肢AM評分而言，第2、8天各組均值無明顯差異，第15、22、29天各組間均值差異有統計學意義0^=15. 12、Α=32. 86、片35. 80，7X0.01)。用藥第2天和第8天小劑量組上肢AM評分與西藥處理組比較無顯著性差異，至用藥第15、22、29天小劑量組上肢AM 評分低于西藥組，差異有統計學意義( =4. 45、 =4. 47，均7X0.01)。第15、22、29天中劑量組比小劑量組上肢AM評分明顯降低，差異有統計學意義( =3.40、 =4.04、 =3. 95，均 Ρ<Λ· 01)。大劑量組與中劑量組之間比較，差異無統計學差異。就軸向AM評分而言，第15、22、29天各組間均值差異有統計學意義(片3.30、 F=2b. 06,/^=36.41, 7X0.01)。小劑量組用藥至第22、29天軸向AM值比西藥處理組降低， 差異有統計學意義( =3. 93、 =3. 04，均/XO. 05);中劑量組比小劑量組比較，僅于第29天差異有統計學意義( =3. 05，P<Q. 05);大劑量組明顯降低了軸向AM值，但與中劑量組比較，僅于第29天有差異( =2. 83，7X0.05)，其它時間點差異無統計學差異。就旋轉AM評分而言，第8、15、22、29天各組間均值差異顯著(/MO. 50^=11. 62、 /^=18. 92、/^=61. 26，P<0. 01)。小劑量組與西藥處理組旋轉AM評分比較，差異無統計學意義。中劑量組用藥至第15、22、29天，旋轉AM評分比西藥組明顯降低，差異有統計學意義 ( =3. 43、t=5. 11、t=7. 63,均/X0.01);大劑量組與中劑量組比較，第8、15、29天差異明顯 ( =3. 81、t=2. 52、 =3. 58,均/*〈0· 05)。表I中藥組與西藥組AM評分的比較土S，分)
權利要求
1.一種中藥組合物在制備預防帕金森病的疾病藥物中的應用，其特征在于，所述的中藥組合物由以下重量份的原料藥制成天麻5-12份、黃芪5-10份、熟地黃5-10份、白芍藥5-15份、當歸5-10份、鉤藤5-10份、僵蠶2-10份。
2.根據權利要求I所述的應用，其特征在于，所述的中藥組合物由以下重量份的原料藥制成天麻6-10份、黃芪6-9份、熟地黃6-9份、白芍藥8-13份、當歸6_7份、鉤藤6_9份、 僵蠶4-6份。
3.根據權利要求I所述的應用，其特征在于，所述的中藥組合物由以下重量份的原料藥制成天麻8份、黃芪8份、熟地黃8份、白芍藥10份、當歸7份、鉤藤8份、僵蠶6份。
4.根據權利要求1-3任一所述的應用，其特征在于，所述的中藥組合物在制備預防帕金森病運動并發癥的疾病藥物中的應用。
5.一種預防帕金森病的中藥組合物，其特征在于，所述的中藥組合物由以下重量份的原料藥制成天麻5-12份、黃芪5-10份、熟地黃5-10份、白芍藥5-15份、當歸5_10份、鉤藤5-10份、僵蠶2-10份。
6.根據權利要求I所述的中藥組合物，其特征在于，所述的中藥組合物由以下重量份的原料藥制成天麻6-10份、黃芪6-9份、熟地黃6-9份、白芍藥8-13份、當歸6_7份、鉤藤6-9份、僵蠶4-6份。
7.根據權利要求I所述的中藥組合物，其特征在于，所述的中藥組合物由以下重量份的原料藥制成天麻8份、黃芪8份、熟地黃8份、白芍藥10份、當歸7份、鉤藤8份、僵蠶6 份。
8.根據權利要求5-7任一所述的中藥組合物，其特征在于，所述的中藥組合物在制備預防帕金森病運動并發癥的疾病藥物中的應用。
9.根據權利要求5-7任一所述的中藥組合物，其特征在于，所述的中藥組合物的劑型是片劑、膠囊劑、顆粒劑、合劑、口服液或糖漿劑。
全文摘要
本發明涉及一種中藥組合物在制備預防帕金森病的疾病藥物中的應用，所述的中藥組合物由以下重量份的原料藥制成天麻5-12份、黃芪5-10份、熟地黃5-10份、白芍藥5-15份、當歸5-10份、鉤藤5-10份、僵蠶2-10份。本發明優點在于配伍符合中藥“君臣佐使”原則，藥味數較少，具有療效高、無毒副作用、價格低等優點，采用益氣活血法，育陰潛陽法，平肝熄風法，揉筋熄風法，活血化瘀法和通絡熄風等法則，從病原根本入手，對癥下藥，以達到預防的效果；制備方法簡單，成本低，對環境友好，適于長期服用，是一種安全有效的預防帕金森病和帕金森病運動并發癥的中藥組合物，具有良好的應用前景。
文檔編號A61K36/8988GK102600372SQ201210063008
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月12日 優先權日2012年3月12日
發明者劉振國, 吳娜, 袁偉恩, 陳偉, 魏江磊 申請人:上海交通大學醫學院附屬新華醫院