專利名稱：一種治療帕金森病運動并發(fā)癥的藥物及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種治療帕金森病運動并發(fā)癥的藥物及其應用，具體地說，是以中草藥為原料制備的中成藥。
背景技術：
帕金森病(Parkinson’ s disease，PD)是中老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾患， 主要與黑質致密區(qū)多巴胺能神經(jīng)元變性缺失及由此造成的黑質紋狀體通路多巴胺遞質減少有關。經(jīng)過多年的臨床實踐，一般認為，左旋多巴仍是最有效的治療帕金森病藥物。但左旋多巴長期應用后大部分患者會出現(xiàn)癥狀波動、異動癥(levodopa-induced dyskinesia, LID)和精神癥狀，即PD運動并發(fā)癥，加之實驗室發(fā)現(xiàn)高濃度多巴胺(dopamine，DA)和左旋多巴會由于自身氧化產(chǎn)生自由基，可導致神經(jīng)細胞變性壞死，因此，聯(lián)合其他藥物共同預防和治療PD運動并發(fā)癥十分迫切。近年研究表明，PD發(fā)生與表達Dl受體的直接通路及其下游cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)、ERK等信號轉導通路被激活關系密切，其下游信號轉導蛋白多巴胺和環(huán)磷腺苷 ilTi^i^SI^S& "32 (dopamine and cAMP-regulated phosphoprotein of Mr 32000, DARPP-32)的蛋白Thr75位點磷酸化表達的改變可能參與了異動癥的發(fā)病。目前在PD運動并發(fā)癥的治療方面，主要采用COMT抑制劑、金剛烷胺、DR激動劑、 L-dopa甲酯或乙酯等。如中國專利文獻CN 200880108979. 7，公布日2010年8月18日， 公開了一種“用于改善帕金森病的運動并發(fā)癥或精神癥狀的藥劑”，所述的藥劑具有5-羥色胺IA受體部分激動劑作用，同時對多巴胺D3受體具有激動劑作用，對于在反復給藥左旋多巴時伴隨產(chǎn)生的運動并發(fā)癥具有改善和延遲發(fā)病的效果。但是西藥治療副作用較大，不如中藥治療安全可靠。我國在中醫(yī)藥治療PD方面積累了豐富經(jīng)驗，總結其治療原則有益氣活血法，育陰潛陽法，平肝熄風法，揉筋熄風法，活血化瘀法和通絡熄風等法則，用于治療 PD的中藥組合物也有多種，但是關于緩解PD運動并發(fā)癥的中藥組合物卻很少，如中國期刊 《中華中醫(yī)藥雜志》，2011年6月第沈卷第6期，刊出的“補腎活血顆粒治療帕金森病運動并發(fā)癥臨床研究”，公開了補腎活血顆粒可以改善PD患者運動并發(fā)癥癥狀，但是并未充分公開所述的補腎活血顆粒的藥物組成和配比。因此，必須積極探索能有效治療帕金森病運動并發(fā)癥、安全可靠的藥物，但是目前關于這類藥物還未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的不足，提供一種治療帕金森病運動并發(fā)癥的藥物。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種上述藥物的用途。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是
一種治療帕金森病運動并發(fā)癥的藥物，它是由下列重量份的原料藥制成天麻10-22 份、黃芪10-23份、熟地黃10-25份、白芍藥10-32份、當歸10- 份、鉤藤10-20份。
所述的藥物是由下列重量份的原料藥制成天麻12-18份、黃芪13-18份、熟地黃 13-18份、白芍藥16-26份、當歸12-18份、鉤藤12-20份。所述的藥物是由下列重量份的原料藥制成天麻18份、黃芪18份、熟地黃18份、 白芍藥22份、當歸16份、鉤藤16份。所述的藥物的藥劑是片劑、膠囊劑、顆粒、口服液、合劑或糖漿劑。為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是 所述的藥物在制備治療帕金森病運動并發(fā)癥藥物中的應用。本發(fā)明優(yōu)點在于
1、本發(fā)明的藥物其配伍符合中藥“君臣佐使”原則，采用補腎固表法從病原根本入手， 對癥下藥，輔助治療帕金森病運動并發(fā)癥療效確切；
2、本發(fā)明的藥物由純中藥制成，具有無毒副作用、價格低等優(yōu)點，易于被患者接受；
3、本發(fā)明的藥物藥味數(shù)少，原材料豐富，制備工藝簡單，對環(huán)境友好，在治療帕金森病運動并發(fā)癥中有良好的應用前景。


附圖1是不同劑量藥物對LID大鼠模型AIM評分的影響。附圖2是不同劑量藥物對LID大鼠模型劑峰旋轉次數(shù)的影響。附圖3是LID大鼠模型紋狀體區(qū)磷酸化ERK1/2表達的免疫組化圖。附圖4是LID大鼠模型紋狀體區(qū)磷酸化ERK1/2表達的Western圖譜。附圖5是LID大鼠模型紋狀體區(qū)磷酸化DARPP-32 (THr75)表達的免疫組化圖。附圖6是LID大鼠模型紋狀體區(qū)磷酸化DARPP-32 (THr75)表達的Western圖譜。附圖7是LID大鼠模型紋狀體區(qū)GRK6表達的免疫組化圖。附圖8是LID大鼠模型紋狀體區(qū)GRK6表達的Wfestern圖譜。附圖9是LID大鼠模型紋狀體區(qū)β -arrestinl表達的免疫組化圖。附圖10是LID大鼠模型紋狀體區(qū)β -arrestinl表達的^festern圖譜。
具體實施例方式下面結合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式
作詳細說明。實施例1治療帕金森病運動并發(fā)癥的藥物的制備(一)
天麻10份、黃芪23份、熟地黃10份、白芍藥32份、當歸10份、鉤藤20份，常規(guī)方法煎煮。實施例2治療帕金森病運動并發(fā)癥的藥物的制備(二)
天麻22份、黃芪10份、熟地黃25份、白芍藥10份、當歸觀份、鉤藤10份，常規(guī)方法煎煮。實施例3治療帕金森病運動并發(fā)癥的藥物的制備(三)
天麻10份、黃芪10份、熟地黃25份、白芍藥32份、當歸10份、鉤藤10份，常規(guī)方法煎煮。實施例4治療帕金森病運動并發(fā)癥的藥物的制備(四)
天麻22份、黃芪23份、熟地黃25份、白芍藥10份、當歸觀份、鉤藤10份，常規(guī)方法煎煮。實施例5治療帕金森病運動并發(fā)癥的藥物的制備(五)
天麻10份、黃芪23份、熟地黃10份、白芍藥10份、當歸10份、鉤藤20份，常規(guī)方法煎煮。實施例6治療帕金森病運動并發(fā)癥的藥物的制備(六)
天麻22份、黃芪10份、熟地黃10份、白芍藥32份、當歸觀份、鉤藤20份，常規(guī)方法煎煮。實施例7治療帕金森病運動并發(fā)癥的藥物的制備(七)
天麻12份、黃芪18份、熟地黃13份、白芍藥沈份、當歸12份、鉤藤20份，常規(guī)方法煎煮。實施例8治療帕金森病運動并發(fā)癥的藥物的制備(八)
天麻18份、黃芪13份、熟地黃18份、白芍藥16份、當歸18份、鉤藤12份，常規(guī)方法煎煮。實施例9治療帕金森病運動并發(fā)癥的藥物的制備(九)
天麻12份、黃芪13份、熟地黃18份、白芍藥沈份、當歸12份、鉤藤12份，常規(guī)方法煎煮。實施例10治療帕金森病運動并發(fā)癥的藥物的制備(十)
天麻18份、黃芪18份、熟地黃18份、白芍藥22份、當歸16份、鉤藤16份，常規(guī)方法煎煮。需要說明的是，實施例1-10所述的常規(guī)方法煎煮是中藥湯劑常規(guī)的制作方法，即將所述的原料藥加水煎煮成湯劑。實施例11治療帕金森病運動并發(fā)癥藥物片劑/膠囊的制備
取實施例1-10任一所述的藥物，加6-10倍量水，煎煮1-3小時，濾出藥汁；再加6-10 倍量水，煎煮0. 5-2小時，濾出藥汁；合并二次煎液，靜置，濾取上清液，濃縮，放冷，加濃縮液2-3倍量酒精，攪拌沉淀過夜；取上清液，濃縮至稠浸膏；加入藥用輔料(按照常規(guī)的方法選用藥用輔料)，真空干燥，粉碎制粒，壓制成片劑或填充裝膠囊。實施例12治療帕金森病運動并發(fā)癥藥物顆粒的制備
取實施例1-10任一所述的藥物，加6-10倍量水，煎煮1-3小時，濾出藥汁；再加6-10 倍量水，煎煮0. 5-2小時，濾出藥汁；合并二次煎液，靜置，濾取上清液，濃縮，放冷，加濃縮液2-3倍量酒精，攪拌沉淀過夜；取上清液，濃縮至稠浸膏；加入藥用輔料(按照常規(guī)的方法選用藥用輔料)，真空干燥，粉碎制粒，干燥，整粒，得20g顆粒，分裝IOg/袋。實施例13治療帕金森病運動并發(fā)癥藥物合劑/ 口服液/糖漿劑的制備
取實施例1-10任一所述的藥物，加6-10倍量水，煎煮1-3小時，濾出藥汁；再加6-10 倍量水，煎煮0. 5-2小時，濾出藥汁；合并二次煎液，靜置，濾取上清液，濃縮，放冷，加濃縮液2-3倍量酒精，攪拌沉淀過夜；取上清液，濃縮至稠浸膏；加適當制藥輔料(按照常規(guī)的方法選用藥用輔料)，制成合劑、口服液或糖漿劑。實施例14治療帕金森病運動并發(fā)癥藥物療效的動物實驗一、實驗方法
1.異動癥(levodopa-induced dyskinesia，LID)模型制備和分組腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，嚴格平頭顱位固定大鼠于腦立體定向儀，參照包新民所著大鼠腦立體定向圖譜(DeWire SM, Lefkowitz RJ, Shenoy SK, et al. Beta arrestins and cell signaling. Annu Rev Physiol. 2007，69: 483-510.)，確定右側前腦內側束坐標①前囟后3. 7 mm，矢狀縫右側1. 7 mm，顱骨骨膜下7. 8 mm,門齒線2. 4 mm ； ②前囟后4. 4 mm，矢狀縫右側1.2 mm，顱骨骨膜下7. 8 mm，門齒線2. 4 mm。按上述確定的注射位點鉆孔，用ΙΟμΙ的微量注射器抽取6-0HDA 6μ1 (含0. 2%維生素C的生理鹽水配置，濃度4 yg/yl)，每點注射3μ1，留針10 min后退針，縫合創(chuàng)面。3周后，大鼠腹腔注射阿樸嗎啡(0. 5 mg / kg)，平均旋轉頻率>7次/min為成功PD大鼠模型。利用6-0HDA制備PD模型大鼠后，腹腔注射左旋多巴甲酯/芐絲胼(50 mg/kg左旋多巴甲酯和25 mg/kg 芐絲胼溶于含0. 2%維生素C的消毒生理鹽水中)4周，制備LID大鼠模型，隨機將LID大鼠模型分為LID組、西藥組、藥物小劑量組、藥物中劑量組、藥物大劑量組。LID組為LID模型大鼠腹腔注射0. 2%維生素C液四天。西藥組為腹腔注射左旋多巴甲酯/芐絲胼(注射劑量為50 mg/kg左旋多巴甲酯和25 mg/kg芐絲胼，二者溶于含0. 維生素C的消毒生理鹽水中)，2次/d(上午9點和下午5點)，持續(xù)^d ；藥物小劑量組、藥物中劑量組、藥物大劑量組在給予左旋多巴甲酯/芐絲胼的基礎上分別加用實施例10制備的藥物，按照50g原料藥濃縮至IOOml的比例煎煮，藥物小劑量組7. 2 ml/kg，藥物中劑量組9 ml/kg，藥物大劑量組10. 8 ml/kg，每日1次灌胃，連續(xù)4周。在治療過程中于第8、15、22、四天上午用藥后進行異常不自主運動(AIM)評分及劑峰旋轉次數(shù)測定。另設有以下對照組Sham組正常大鼠，不作處理；假手術組每日一次灌胃無菌水；生理鹽水組LID大鼠，腹腔注射含0. 2%維生素C的消毒生理鹽水；PD組PD模型大鼠。2. AIM 評定
AIM分成4個組分(上肢AIM、口面部AIM、軸性AIM和旋轉AIM)進行評定，每部分又根據(jù)其有無和嚴重程度分為5個等級(0-4):0無；1持續(xù)時間小于30s ;2持續(xù)時間大于30s， 小于60s ；3持續(xù)時間大于60s，外界刺激可使之停止；4持續(xù)時間大于60s，外界刺激不能使之停止。用藥后每20min評估一次，每次觀察lmin。AIM總分按觀察時間內總積分的平均值進行統(tǒng)計，理論上1只大鼠一次用藥后各組分AIM最大評分為4分，總AIM評分為16分。 劑峰旋轉次數(shù)注射左旋多巴后，每5min記錄旋轉次數(shù)，最多的旋轉次數(shù)為劑峰旋轉次數(shù)。3.免疫組化染色
結束注射后12h，3%戊巴比妥鈉麻醉，于左心室灌注4%多聚甲醛固定，斷頭取腦后相同固定液中后固定他，經(jīng)修塊、梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟后用石蠟包埋。行石蠟切片，切片厚度為5 μ m。取紋狀體冠狀層面采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結 (SP)法行免疫組化染色，步驟如下石蠟切片脫蠟至水；3%雙氧水室溫避光孵育5min，以消除內源性過氧化氫酶活性；PH7.7的lnmol/1乙二胺四乙酸-三羥甲基氨基甲烷-氯化氫(EDTA-Tris-HCl)微波加熱修復；1%牛血清白蛋白室溫封20min ；GRK6多克隆抗體 (1 200)、β-arrestinl 多克隆抗體(1 500)、兔抗鼠 DARPP-32 抗體(1 500)、抗磷酸化DARPP-32 (Thr75)抗體(1 500)、兔抗大鼠總ERK1/2單克隆抗體(1 500)和兔抗大鼠磷酸化ERK1/2單克隆抗體(1 500)4°C濕盒內孵育過夜；滴加稀釋的生物素標記二抗， 37°C孵育20min ；滴加稀釋的辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素，37°C孵育20min ；聯(lián)苯二胺 (3，3，-diaminobenzidine tetrahydrochloride，DAB)顯色劑顯色，自來水沖洗，之后脫水、透明、封片。各步驟之間均用O.Olmol/1 TBS充分漂洗，TBS代替一抗作為陰性對照。在顯微鏡下觀察免疫組化切片，各觀察區(qū)隨機取5個不重疊視野，于高倍鏡(10 X 40)下觀察，采用0LYMPUS-IX50成相系統(tǒng)拍攝，Image-Pro Plus 5. 1圖象處理軟件進行半定量分析，計算 GRK6蛋白陽性細胞指數(shù)(IOD)=陽性細胞面積X校正光密度值(測量區(qū)光密度一背景光密度)。4. Western blot 蛋白免疫印跡
結束注射后3h，快速冰上分離雙側紋狀體，每IOmg組織加入100 μ 1蛋白裂解液RIPA 和1μ 1蛋白酶抑制劑PMSF，超聲裂解，提取總蛋白。測定蛋白濃度后于一 80°C保存。40 yg 樣本經(jīng)10% SDS -聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉移至二氟化樹(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜，用5%脫脂奶粉洗脫緩沖液后室溫封閉1 h;加入抗GRK6抗體(1 500)、抗 β-arrestinl 抗體(1 500)、抗總 DARPP-32 抗體(1 1000)或抗磷酸化 DARPP-32 (11^75)抗體(1 1000)、抗總 ERK1/2 抗體(1 1000)或抗磷酸化 ERK1/2 抗體(1 500)或抗3-actin(l 1000)，4°C孵育過夜；TBST沖洗，加HRP標記的山羊抗兔二抗(1 1000) 或山羊抗小鼠二抗(1 3000),37 °C孵育Ih ;TBST沖洗，滴加ECL顯色液，Bio-Rad凝膠成像儀曝光、顯像。Western blot圖像采用SmartVieWOOO圖像分析軟件計算各樣本目的蛋白條帶OD值與面積值的乘積，從而進行蛋白條帶密度定量。4.統(tǒng)計學方法
采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準誤表示，用單因素方差分析及獨立T建議進行檢驗，P<0. 05表示差異有統(tǒng)計學意義。二、結果
1.不同劑量藥物對LID大鼠模型行為學的影響
1. 1不同劑量藥物對LID大鼠模型各組分AIM評分的影響
就口面部AIM評分而言，第8天各組間均值無顯著差異(F=2. 18，P >0.05)，第15、22、 29天各組間均值差異顯著(F=10. 43、F=Il. 70、F=15. 62，P<0. 01)。藥物小劑量組與西藥組比較，各天差異均不明顯。第15、22、四天藥物中劑量組比藥物小劑量組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=5. 06、t=5. 48、t=5. 46，均P<0. 01)。藥物中劑量組與藥物大劑量組比較，無統(tǒng)計學差異。就上肢AIM評分而言，第8、22、四天各組間均值差異有統(tǒng)計學意義(F=9. 64、 F=13. 70、F=30. 30，P<0. 01)，第15天各組間無明顯差異。藥物小劑量組與西藥組比較，僅于第22天差異顯著(t=5. 69，P<0. 01)。藥物中劑量組于第8、15、22天與藥物小劑量組比較差異不顯著，僅于第四天差異有統(tǒng)計學意義(t=6. 20，P<0. 01)，與西藥組比較，第22、四天差異有統(tǒng)計學意義(t=3. 113=7.30，均？<0.05)。藥物大劑量組與藥物中劑量組之間比較， 第8、22天時差異有統(tǒng)計學差異(t=5. 06、t=2. 53，均P<0. 05)；與西藥組比較，第8、15、22、 29 天差異均有統(tǒng)計學意義(t=3. 10、t=2. 72、t=6. 06、t=7. 31，均 Ρ<0· 05)。就軸向AIM評分而言，第8、15、22、四天各組間比較，均無統(tǒng)計學意義。就旋轉AIM評分而言，第15、22、四天各組間均值差異顯著^=17. 12、F=27. 26、 F=26. 18，Ρ<0·01)。第8、15、22、四天藥物小劑量組與西藥組比較均無統(tǒng)計學意義。第15、 22,29天藥物中劑量組與西藥組比較，旋轉AIM值均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=5. 67、 t=6. 80、t=6. 40，均P<0. 01)。藥物大劑量組比藥物中劑量組第15、22天旋轉AIM評分降低(t=2.43、t=2.32j^P<0.05)。(見表 1)
表1藥物小、中、大劑量組與西藥組A頂評分的比較(；士S，分)
權利要求
1.一種治療帕金森病運動并發(fā)癥的藥物，其特征在于，它是由下列重量份的原料藥制成天麻10-22份、黃芪10-23份、熟地黃10-25份、白芍藥10-32份、當歸10- 份、鉤藤 10-20 份。
2.根據(jù)權利要求1所述的藥物，其特征在于，它是由下列重量份的原料藥制成天麻 12-18份、黃芪13-18份、熟地黃13-18份、白芍藥16-26份、當歸12-18份、鉤藤12-20份。
3.根據(jù)權利要求1所述的藥物，其特征在于，它是由下列重量份的原料藥制成天麻18 份、黃芪18份、熟地黃18份、白芍藥22份、當歸16份、鉤藤16份。
4.根據(jù)權利要求1-3任一所述的藥物，其特征在于，所述的藥物的藥劑是片劑、膠囊齊U、顆粒、口服液、合劑或糖漿劑。
5.根據(jù)權利要求1-3任一所述的藥物，其特征在于，所述的藥物在制備治療帕金森病運動并發(fā)癥藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療帕金森病運動并發(fā)癥的藥物，它是由下列重量份的原料藥制成天麻10-22份、黃芪10-23份、熟地黃10-25份、白芍藥10-32份、當歸10-28份、鉤藤10-20份。本發(fā)明還涉及上述藥物在治療帕金森病運動并發(fā)癥中的用途。本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明的藥物其配伍符合中藥“君臣佐使”原則，采用補腎固表法從病原根本入手，對癥下藥，輔助治療帕金森病運動并發(fā)癥療效確切；本發(fā)明的藥物由純中藥制成，具有無毒副作用、價格低等優(yōu)點，易于被患者接受；本發(fā)明的藥物藥味數(shù)目少，原材料豐富，制備工藝簡單，對環(huán)境友好，在治療帕金森病運動并發(fā)癥中有良好的應用前景。
文檔編號A61P25/16GK102526512SQ20121006227
公開日2012年7月4日 申請日期2012年3月12日 優(yōu)先權日2012年3月12日
發(fā)明者劉振國, 吳娜, 袁偉恩, 陳偉, 魏江磊 申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院