專利名稱：一種運載蜂毒肽的多肽、運載蜂毒肽的納米顆粒及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物科學和藥物載體領域，特別涉及一種一種運載蜂毒肽的多肽、運載蜂毒肽的納米顆粒及其應用。
背景技術：
蜂毒肽(melittin，GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ)是一種兩親性的α 螺旋結構的多肽，是蜂毒中的主要活性成分，占其干重的40%-60%。蜂毒肽的活性很高，具有廣譜的抗菌功能，能在極短的時間內發揮其作用，其效率是普通抗生素的上百倍。蜂毒肽對于細胞膜結構具有非常高效的破壞性，包括質膜以及胞內一些細胞器的膜結構。其作用機制主要有通過其兩親性的結構嵌入至膜結構中，然后在膜上打孔，致使膜結構發生破裂，膜內外環境的變化最終導致細胞的死亡；也可以通過影響細胞內介導腫瘤增殖的多條信號通路中的關鍵蛋白，進而引起細胞凋亡。因此，蜂毒肽在治療腫瘤方面可以發揮很大功效。除此之外，相關研究表明蜂毒肽還可以通過抑制HIV-1基因的表達及LTR的活性來抑制艾滋病病毒的增殖；也具有抗炎鎮痛的作用，鎮痛強度是嗎啡的40%，鎮痛時間持久，抗炎活性是近氫化可的松的100多倍，不會引起免疫抑制的作用；蜂毒肽也能調節腎上腺皮質激素的釋放，達到抗風濕、類風濕關節炎的作用；此外，蜂毒肽還能夠引起神經內分泌反應，增強機體抗輻射作用以及防止血小板聚集，抗血栓的功效?？傊涠倦脑谥委煾鞣N疾病上都具有廣泛的應用前景。然而，由于蜂毒肽自身的特性，難以將其直接應用于活體的疾病治療中。因為蜂毒肽在注入血管后會迅速與紅細胞結合，破壞細胞膜，以致產生強烈的溶血反應。而且直接將蜂毒肽應用于活體治療，可能會對機體正常細胞造成破壞，帶來極大的毒副作用。另外，蜂毒肽在機體內的半衰期很短，代謝速度很快，并不利于臨床的疾病治療。納米運載體作為一種新型的給藥方式正逐漸被人們所關注。利用納米顆粒運載蜂毒肽是一種有效避免其毒副作用的方法。然而，目前使用納米顆粒運載蜂毒肽的報道并不多見。有些研究學者嘗試使用脂質體(liposome)對蜂毒肽進行運載，而電鏡結果顯示裝載蜂毒肽后脂質體的結構會發生極大的改變，甚至有些會被降解掉。雖然在此基礎上有學者提出了更加穩定的使用脂質體運載蜂毒肽的PEG修飾的盤形顆粒，但并沒有真正應用于活體治療。還有學者使用PLGA[poly (D, L-lactide-co-glycolide acid)]顆粒實現了對蜂毒肽的高包封率的運載，但是他們同樣只是進行了體外的對比實驗，并沒有繼續深入。運載蜂毒肽的其他一些納米顆粒同樣因為其溶血性質得不到改善而被大大限制。目前，有一種基于全氟化碳(perf luocarbon, PFC)納米顆粒能夠在活體動物中穩定運輸蜂毒肽,在降低了其毒副作用的同時，能夠有效地發揮抗腫瘤作用。此外，此蜂毒肽納米顆粒在修飾了靶向基團后，還可以實現腫瘤的 特異性富集。但是這類PFC顆粒粒徑較大，在200-300nm之間，無法穿越實體瘤內致密的網狀膠原纖維的縫隙(20-40nm)，難以有效地擴散到腫瘤的內部，尤其是對血管不豐富的實體瘤，很難達到預期的治療效果。而且PFC顆粒在人體內的代謝、排泄和生物毒性還需進一步實驗驗證；另外作為一種溫室氣體材料，全氟化碳的大量應用還會帶來環境的破壞。因此，發展一種超小徑粒(<40nm)的穩定運載蜂毒肽的納米顆粒載藥方法，有效地避免蜂毒肽的溶血性和對正常細胞的毒副作用，同時具有特異性富集在病變區域并有效釋放蜂毒肽的能力，將會極大地促進蜂毒肽在臨床疾病治療中的應用。

發明內容
本發明的目的是為解決上述問題而提供了一種運載蜂毒肽的多肽及其納米顆粒、制備方法及其應用。利用運載蜂毒肽的多肽制備得到的納米顆粒能夠有效降低蜂毒肽對于機體的毒副作用，特異性地在腫瘤等疾變區域發揮作用，可以應用于臨床治療。本發明所采用的技術方案是:一種運載蜂毒肽的多肽，所述多肽是由α螺旋多肽、連接序列和蜂毒肽以共價鍵的形式串連而成。優選地，所述α螺旋多肽的氨基酸序列為DWFKAFYDKVAEKFKEAF。優選地，所述連接序列的氨基酸序列為GSG。一種運載蜂毒肽的納米顆粒，所述納米顆粒由權利要求要求I所述的運載蜂毒肽的多肽、磷脂、膽固醇脂三種有機結合的方式組成。優選地，所述憐脂為DMPC (I, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)。一種運載蜂毒肽的納米顆粒的應用，所述納米顆粒能夠有效降低蜂毒肽對于機體的毒副作用，特異性地在包括腫瘤在內的疾變區域發揮作用，可以應用于臨床治療。
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本發明具有以下優點:I)理化特性優良:利用動態激光光散射方法測得納米顆粒的平均粒徑為12nm左右，電鏡結果顯示，納米顆粒的粒徑均一、分散性好，無聚集現象。2)生物相容性好:制備該納米顆粒所使用的原料為磷脂、膽固醇脂和運載蜂毒肽的多肽，這些原材料都已各自用于臨床或臨床試驗，具有良好的生物相容性。3)制備工藝簡單，便于規模化生產。4)藥物包封率大于80%，符合《中華人民共和國藥典》對于微囊制劑的要求；而相比于游離的蜂毒肽，采用運載蜂毒肽的多肽制備的運載蜂毒肽的納米顆粒藥物包封率提高了 18倍。5)治療效果好:以實體瘤為例，運載蜂毒肽的納米顆?？梢越柚鷮嶓w瘤的EPR效應(enhanced permeability and retention effect)在其內部富集,有效提高腫瘤區域的局部藥物濃度，其超小的納米尺寸可以自由地穿過實體瘤致密的網狀膠原縫隙到達腫瘤核心部位，從而高效地殺傷腫瘤細胞，而且還可以有效避免腫瘤細胞的耐藥性。6)毒副作用低:運載蜂毒肽的多肽設計可以增加其與磷脂之間的相互作用，使其埋藏在單層磷脂層當中，從而避免了與血細胞和正常細胞的直接接觸。動物實驗研究結果顯示，運載蜂毒肽的納米顆粒治療組能夠明顯地抑制腫瘤的生長，且實驗小鼠的血液生化指標與對照組之間無顯著差異且都在正常值范圍內。7)功能可擴展:運載蜂毒肽的納米顆粒除了直接應用于腫瘤、風濕、血栓等疾病治療外，還可以在其核心裝載用于疾病診療的染料分子和藥物分子，也可同時裝載其它類型的靶向性多肽或治療性多肽，實現疾病的協同靶向或協同治療的功效。


下面結合附圖和實施方式對本發明作進一步詳細的說明。圖1 為 FPLC (Fast protein liquid chromatography)系統純化小劑量制備的運載蜂毒肽的納米顆粒時的雙波段吸收-時間曲線圖；圖2為FPLC系統純化運載蜂毒肽的納米顆粒時的雙波段吸收-時間曲線圖；圖3為FPLC系統純化大劑量制備的運載蜂毒肽的納米顆粒時的雙波段吸收-時間曲線圖；圖4為FPLC系統純化核心裝載熒光染料DiR-BOA的運載蜂毒肽的納米顆粒時的三波段吸收-時間曲線圖；圖5為FPLC系統純化核心裝載Flu0-BOA的運載蜂毒肽的納米顆粒時的三波段吸收-時間曲線圖；圖6為使用動態激光光散射(DLS)系統測試運載蜂毒肽的納米顆粒的納米粒徑結果; 圖7為運載蜂毒肽的納米顆粒的透射電子顯微鏡成像圖像；圖8為運載蜂毒肽的納米顆粒與游離蜂毒肽的紅細胞溶血性試驗比較；圖9為運載蜂毒肽的納米顆粒與游離蜂毒肽對于各種腫瘤細胞的增殖抑制能力比較；圖10為運載蜂毒肽的納米顆粒抑制B16腫瘤在C57BL/6鼠體內生長的時間-腫瘤體積曲線圖；圖11為運載蜂毒肽的納米顆粒抑制B 16腫瘤在C57BL/6鼠體內治療第13天時治療組與對照組小鼠體內剝離后的腫瘤塊實物圖；圖12為運載蜂毒肽的納米顆粒治療荷B16腫瘤的鼠模型第13天時的血液生化和血細胞指標。
具體實施例方式實施例1運載蜂毒肽的多肽，該肽是由α螺旋多肽、連接序列和蜂毒肽以共價鍵的形式串連而成。本實施例中α螺旋多肽的氨基酸序列為:DWFKAFYDKVAEKFKEAF，連接序列的氨基酸序列為GSG，蜂毒肽的氨基酸序列為:GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ。該運載蜂毒肽的多肽的氨基酸序列為序列表中SEQ ID N0.1所述。制備運載蜂毒肽的納米顆粒，其步驟為:I)將 3ymolDMPC(I, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)>0.2 μ moI 膽固醇月旨(Cholesteryl oleate,簡稱C.0)的氯仿溶液在玻璃試管中充分混合,并用封口膜將試管口封死；2)在穩定的氮氣流中將試管內的氯仿吹干，使步驟I)中的混合物能夠在試管底部形成一層薄膜；3)將試管放入真空干燥器中真空干燥Ih ；
4)向試管中加入Iml的磷酸緩沖液，充入氮氣密封后，利用渦旋震蕩儀將試管底部的藥品薄膜充分重懸形成均勻的乳白色的懸濁液；5 )將試管48 V超聲Ih ；6)使用注射器向密封的試管中加入含有0.19 μ mol運載蜂毒肽的多肽的PBS溶液，混勻后密封，4 0C放置過夜。7)次日，使用FPLC系統純化，收集有效溶液濃縮備用。運載蜂毒肽的納米顆粒利用上述步驟進行合成，并使用FPLC系統對制備好的運載蜂毒肽的納米顆粒進行純化，其結果參照如圖1至圖3。圖1為FPLC系統純化小劑量制備的運載蜂毒肽的納米顆粒時的雙波段吸收-時間曲線圖。使用0.19 μ mol運載蜂毒肽的多肽小量制備運載蜂毒肽的納米顆粒。圖1中顯示的215nm吸收曲線值為實際值的1/5。圖1中共出現3個峰，根據時間順序分別定義為Peak 1、2、3 ;其中Peak 2為運載蜂毒肽的納米顆粒，Peak 3為游離的多肽。Peak 2的積分面積占總面積的80.3%，而游離多肽含量(Peak 3面積)為8.74%。圖2為FPLC系統純化蜂毒肽納米顆粒時的雙波段吸收-時間曲線圖。同時使用0.19 μ mol α -螺旋多肽和0.19 μ mol蜂毒肽小量制備蜂毒肽納米顆粒。圖中顯示的215nm吸收曲線值為實際值的1/5。圖2中的Peak 2的面積為4.22%，游離多肽含量為88.28%。實驗結果表明，使用串聯多肽的方法可以使蜂毒肽的運載率提高18倍，并有效提高多肽的利用率。圖3為FPLC系統純化大劑量制備的運載蜂毒肽的納米顆粒時的雙波段吸收-時間曲線圖。使用1.9 μ mol運載蜂毒肽的多肽大量制備運載蜂毒肽的納米顆粒。與圖1所示的制備劑量同比放大10倍，圖中顯示的215nm吸收曲線值為實際值的1/5。)。圖3中的Peak 2面積為79.5%，與小量制備的產率類似，表明該方法在放大過程中產率并未明顯降低，可進行大規模的制備與純化。作為運載蜂毒肽的納米顆粒的擴展，在制備時也可在其核心內裝載熒光染料。原料配比為:3 μ mol DMPC、0.Ιμπιο C.0,0.3 μ mol DiR-BOA (—種經過修飾的近紅外熒光染料，激發和發射波長 分別為748nm和780nm)、0.57 μ mol運載蜂毒肽的多肽，其FPLC純化結果參見圖4，圖4中顯示的215nm吸收曲線值為原值的1/10。3 μ mol DMPC.0.1ymolC.0,0.3 μ mol Fluo-BOA (一種經過修飾的綠色熒光染料，激發和發射波長分別為495nm和525nm)、0.38 μ mol a -melittin，其FPLC純化結果參加圖5，圖5中顯示的215nm吸收曲線值為原值的1/10運載蜂毒肽的納米顆粒基本性質的測定:納米粒徑的測量顯示d=ll.76±2.40nm,其結果參見圖6。透射電子顯微鏡照片參見圖7，圖7中顯示出運載蜂毒肽的納米顆粒是一種單分散性、粒徑均一的納米顆粒，沒有明顯的聚集現象。實施例2實施例1中制備得到的運載蜂毒肽的納米顆粒與游離蜂毒肽對于溶血性能的比較參見圖8。圖8中顯示運載蜂毒肽的納米顆粒在蜂毒肽的濃度達到60 μ M的情況下溶血率仍然沒有達到10%，而游離的蜂毒肽則在I μ M已經接近100%。證明運載蜂毒肽的納米顆粒能夠有效降低蜂毒肽的溶血性能，靜脈注射后不會破壞紅細胞，為其應用于活體治療提供了基礎。運載蜂毒肽的納米顆粒與游離蜂毒肽在細胞殺傷能力方面的比較參照圖9。通過圖9和細胞增殖實驗比較可以看出運載蜂毒肽的納米顆?？梢越档头涠倦膶τ诩毎钠茐?，進而能夠在活體應用過程中保護機體正常細胞免受侵害，有效降低蜂毒肽帶來的毒副作用。實施例3實施例1中制備得到的運載蜂毒肽的納米顆粒在體治療腫瘤模型:構建B16皮下腫瘤模型。消化B16細胞，使用滅菌的PBS漂洗兩次后進行細胞計數，最后將細胞濃度定為8 X IO6個/L。麻醉C57BL/6小鼠，將腫瘤細胞溶液注射至鼠左腿根部皮下，注射體積為100μ I。接種日期定為第O天，其后的日期分別記做第1、2、3……天。在第4天按照需求對鼠進行分層隨機分組，每組建議數量不低于5只。在第5天時開始尾靜脈注射。注射前先對各鼠進行標記，稱取各鼠的質量，在預先制定好的表格中記錄。Control組注射時只需尾靜脈注射滅菌的PBS即可，注射量為0.2ml/10g。1.v.therapy組·需尾靜脈注射a -melittin-NP,注射劑量為20mg/kg(多肽含量),注射體積為0.2ml/10g。1.p.therapy組需腹腔注射a -melittin-NP,注射劑量為20mg/kg(多肽含量)，注射體積為0.3ml/10g。NP Control組作為空載體對照，注射的濃度根據磷脂濃度來確定，磷脂濃度需要與Therapy組的磷脂濃度一致。注射周期為每隔一天注射一次，共4次。在第13天時取血化驗并立即處死小鼠進行后續實驗操作。使用游標卡尺來測定腫瘤體積。從第5天開始測量，每隔一天測一次，測量數據需及時記錄在表格中。體積的計算公式為V=0.5XLXWXH。經過4輪治療后顯現出運載蜂毒肽的納米顆粒的抑瘤率達到90%，與對照組相比具有顯著的治療效果。解剖后的腫瘤塊對比也很明顯地印證了這一效果。其結果參見圖10和圖11，圖10中*代表P〈0.05。檢測運載蜂毒肽的納米顆粒治療后小鼠的生理生化水平和血細胞指標，參加圖
12。實驗結果表明，運載蜂毒肽的納米顆粒對小鼠的肝腎并未產生明顯毒性，血細胞參數與對照差異不大，證實其良好的生物相容性。實施例4實施例1中制備得到的制備運載蜂毒肽的納米顆粒的三類物質(磷脂、膽固醇油酸酯、多肽)都已經在臨床上有應用。磷脂類物質已經應用于臨床治療，脂質體就是一個很好的例子。Doxil是一種用脂質體包裹阿霉素用來治療卡波濟氏肉瘤的藥物，美國FDA已經批準Doxil用于卵巢癌和多發性骨髓瘤的治療。膽固醇是人機體內本身存在的物質，具有很好的生物安全性。多肽類物質也有許多應用于臨床治療，舉個例子:鹿瓜多肽就是一種很好的治療骨折的藥物。作為該藥物主要成分的骨誘導多肽類生物因子可有效促進機體內影響骨形成和吸收的骨源性生長因子的合成。鹿瓜多肽注射液能明顯促進骨愈合及新骨的形成，調節骨代謝，具有抗炎鎮痛等作用，對骨折不愈合骨質疏松癥療效確切，無明顯不良反應，對類風濕性關節炎軟組織損傷療效優良。
以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而 不脫離本發明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍當中。
權利要求
1.一種運載蜂毒肽的多肽，其特征在于，所述多肽是由α螺旋多肽、連接序列和蜂毒肽以共價鍵的形式串連而成。
2.根據權利要求1所述的運載蜂毒肽的多肽，其特征在于，所述α螺旋多肽的氨基酸序列為 DWFKAFYDKVAEKFKEAF。
3.根據權利要求1所述的運載蜂毒肽的多肽，其特征在于，所述連接序列的氨基酸序列為GSG。
4.一種運載蜂毒肽的納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒由權利要求要求I所述的運載蜂毒肽的多肽、磷脂、膽固醇脂三種有機結合的方式組成。
5.根據權利要求4所述的運載蜂毒肽的納米顆粒，其特征在于，所述磷脂為DMPC(I, 2-dimyristoyl-sn -glycero-3-phosphocholine)。
6.一種運載蜂毒肽的納米顆粒的應用，其特征在于，所述納米顆粒能夠有效降低蜂毒肽對于機體的毒副作用 ，特異性地在包括腫瘤在內的疾變區域發揮作用，可以應用于臨床治療。
全文摘要
本發明公開了一種運載蜂毒肽的多肽、運載蜂毒肽的納米顆粒及其應用，屬于生物科學和藥物載體領域。所述肽是由α螺旋多肽、連接序列和蜂毒肽以共價鍵的形式串連而成；所述納米顆粒由運載蜂毒肽的多肽、磷脂、膽固醇脂三種有機結合的方式組成。用運載蜂毒肽的多肽制備得到的納米顆粒能夠有效降低蜂毒肽對于機體的毒副作用，特異性地在腫瘤等疾變區域發揮作用，可以應用于臨床治療。
文檔編號A61K9/14GK103073646SQ20121006456
公開日2013年5月1日 申請日期2012年3月13日 優先權日2012年3月13日
發明者駱清銘, 張智紅, 黃川 申請人:華中科技大學