專利名稱：荔枝核黃酮類化合物在制備治療單純皰疹病毒腦炎藥物上的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及荔枝核黃酮類化合物在制備治療單純皰疹病毒腦炎藥物上的用途，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
單純皰疹病毒(HSV)在人群中的感染極為普遍，而較為嚴重的是HSV感染能引發(fā)單純皰疹病毒腦炎(HSVE)，又稱急性壞死性腦炎，病死率高達50% _70%，存活者致殘率高，常有不同程度的腦功能障礙，后遺癥嚴重。目前臨床治療HSV感染主要用皰疹凈、阿糖腺苷、無環(huán)鳥苷等抗病毒藥物，但這些藥物副作用較大，如消化道癥狀明顯，常出現(xiàn)過敏和耐藥現(xiàn)象。因此，研究和開發(fā)新的抗單純皰疹病毒藥物具有重要的現(xiàn)實意義和社會意義。蒸枝核是無患子科植物蒸枝(Litchi chinensis Sonn)的干燥成熟種子,又名蒸仁或荔核，味甘、微苦，我國古代藥典記載荔枝核性溫、歸肝、腎經(jīng)、能祛寒止痛和行氣散結(jié)； 荔枝核的化學(xué)成分有留類、皂苷、揮發(fā)油、鞣質(zhì)、脂肪酸、聚合花色素、糖類、蛋白質(zhì)以及無機鹽。黃酮類化合物為荔枝核提取物中的主要成分，具有毒性低、副作用小等特點。荔枝核黃酮類化合物除具有降血糖、調(diào)血脂和抗氧化作用等多種功效外，還具有抗病毒作用，已有文獻報道其具有體外抗こ型肝炎病毒(HBV)、流感病毒(IFV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、SARS病毒等多種病毒作用，我們前期也發(fā)現(xiàn)其在體外有抗單純皰疹病毒的作用，但其對由單純皰疹病毒感染所引起的皰疹性腦炎的治療作用尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供荔枝核黃酮類化合物在制備治療單純皰疹病毒引起的皰疹性腦炎的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)荔枝核黃酮類化合物在體內(nèi)可提高單純皰疹病毒致死感染動物的生存率，加快組織中病毒的清除，臨床上可用于單純皰疹病毒感染引起的皰疹性腦炎病人的治療。本發(fā)明采用的荔枝核黃酮類化合物的提取方法，其過程如下將荔枝核打碎成粉過40目篩，稱取荔枝核粉，加入こ醇溶液，采用微波預(yù)處理，恒溫提取并間歇震蕩，經(jīng)過兩次提取后，將提取液過濾，濃縮后加兩倍量的無水こ醇靜置一段時間后，充分沉淀后過濾除去蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)。減壓回收こ醇，濃縮后轉(zhuǎn)入水相，配制成用于樹脂吸附的荔枝核浸出液。在帶塞的磨ロ錐形瓶中加入預(yù)處理好的吸附樹脂和上述制備的荔枝核浸出液，于室溫下振蕩，調(diào)節(jié)上柱液pH = 5. 0左右，室溫下以相應(yīng)流速吸附飽和；解吸時先用水淋洗，再用こ醇解吸，控制脫附劑流速和脫附劑的用量，然后收集所需成分，濃縮除去有機溶剤，最后獲得純度更高，活性更好的荔枝核黃酮類化合物。荔枝核黃酮類化合物對小鼠感染單純皰疹病毒具有治療作用。感染后24小時給藥，隨著藥物劑量的増加，小鼠死亡率降低，平均生存時間延長。
荔枝核黃酮類化合物在動物體內(nèi)對單純皰疹病毒具有抑制作用。感染后24小時給藥，可降低體內(nèi)病毒核酸表達水平，減輕組織(腦)病理改變，降低組織(腦、肺、肝)中
病毒滴度。本發(fā)明可從荔枝核中獲得含量更高、純度更高的黃酮類化合物，提取的黃酮類化合物對單純皰疹病毒感染所致皰疹性腦炎有良好的治療作用。


圖I. PCR檢測HSV-I感染小鼠不同組織中HSV-I核酸I :100bp標準分子量；2、8、10 :正常小鼠腦、肺、肝組織；3、4、5、6 :病毒感染小鼠
腦組織；7 :病毒感染小鼠肺組織；9 :病毒感染小鼠肝組織；11 :病毒陽性對照；12 :空白對照。圖2. HSV-I感染小鼠模型的檢測HSV-I感染小鼠腦組織HE染色鏡下顯示小鼠前腦有明顯的淋巴細胞浸潤(圖 2B)，并有特征性的出血性壞死(圖2C)，而正常組無任何病理變化(圖2A)，由此可見已成功建立了單純皰疹病毒感染小鼠模型。圖3.荔枝核黃酮類化合物治療HSV-I感染組小鼠腦組織病理切片A.高劑量組(166. 25mg/kg/d)B.中劑量組(83. 13mg/kg/d) C.低劑量組 (41. 56mg/kg/d)。
具體實施例方式實施例I :荔枝核黃酮類化合物的提取與純化將荔枝核打碎成粉過40目篩，稱取一定量的荔枝核粉，按照料液比I : 12加入相應(yīng)體積的濃度為60vol %こ醇溶液，在700W頻率微波下作用150S后，恒溫提取并間歇震蕩， 經(jīng)過兩次提取后，將提取液過濾，濃縮后加兩倍量的無水こ醇靜置一段時間，充分沉淀后過濾除去蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)。減壓回收こ醇，濃縮后轉(zhuǎn)入水相，配制成用于樹脂吸附的荔枝核浸出液。在帶塞的磨ロ錐形瓶中加入600mg預(yù)處理好的X-5吸附樹脂和450ml上述制備的荔枝核浸出液，并調(diào)整上樣液質(zhì)量濃度為0. 5mg/ml，于室溫25°C下振蕩(180r/min) 24h， 調(diào)節(jié)上柱液pH = 5. 0,室溫下以流速2ml/min吸附飽和；解吸時先用水淋洗，再用85vol% こ醇解吸，控制脫附劑流速為0. 5ml/min，脫附劑的用量為50ml/批，然后收集所需成分，濃縮除去有機溶剤。實施例2 :荔枝核提取物中黃酮的定性鑒定和含量測定I)首先取荔枝核提取物，溶于60vol%こ醇，與HCl-Mg，AlCl3, Pb (Ac)3反應(yīng)均為陽性，表明荔枝核提取物中含有黃酮類化合物。2)以60vol %こ醇為溶剤，以NaNO2-Al (NO3) 3_NaOH作為顯色劑，分別作蘆丁標準品及荔枝核提取物的吸收曲線，二者均在508nm有一強吸收峰，故選擇508nm為測定波長。 準確稱取蘆丁標準品5. OOmg，用50VOl%こ醇溶解后定容至50ml容量瓶中，配制成蘆丁標準溶液(IOOii g/ml)。精確量取蘆丁標準溶液 0. 00、I. 00,2. 00,3. 00,4. 00,5. 0,6. 0,7. Oml 分別置于25ml容量瓶中，各加入5被％亞硝酸鈉溶液Iml搖勻，放置6min，加IOwt%硝酸鋁溶液1ml，搖勻放置6min，加4被％氫氧化鈉溶液10ml，然后用60vol %こ醇稀釋至刻度，搖勻放置15min，試劑為空白作參比，測定吸光度，顯色測定吸光度A，用最小二乗法得到回歸方程為A = 0. 0049C(u g/ml)+0. 0027。取荔枝核提取物Iml置于25ml容量瓶中，依次加入 5被％亞硝酸鈉溶液1ml，搖勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液1ml，搖勻，放置6min，加4% 氫氧化鈉溶液10ml，然后用60vol%こ醇定容，搖勻，放置15min，以不含荔枝核提取物的上述試劑作參比液，在508nm處測定吸光度，得到黃酮類化合物的濃度為13. 33333mg mじ1， 從而推知荔枝核中黃酮類化合物質(zhì)量含量為1.98%。實施例3 :荔枝核黃酮類化合物對小鼠的毒性作用取昆明小鼠40只(雄性)，4 5周齡，16± lg。完全隨機法分為5組,姆組8只， 其中包含ー個正常對照組。將荔枝核黃酮類化合物用雙蒸水梯度稀釋成3436. 25,344. 00、 34. 40,3. 44mg/kg 4組，小鼠空腹4小時后，按每只0. 2ml灌胃，每天I次，連續(xù)14天，每天定時補充飼料、水分，更換墊料，室內(nèi)溫度為22±2°C，記錄動物體重變化和死亡情況。觀察 14天后，發(fā)現(xiàn)344. 00mg/kg、34. 40mg/kg、3. 44mg/kg三個不同濃度組中的動物無中毒和死亡情況，結(jié)果顯示荔枝核黃酮類化合物對昆明小鼠以灌胃給藥途徑在344. 00mg/kg濃度以下為安全給藥濃度。實施例4 :荔枝核黃酮類化合物體內(nèi)抗單純皰疹病毒I、致病模型的建立動物室應(yīng)保持空氣新鮮、相対濕度60%，溫度22±2°C。4 周 5周齡雄性昆明鼠72只，こ醚麻醉及感染部位常規(guī)消毒后，將病毒進行10倍連續(xù)稀釋 (KT1 10_8)，每個濃度接種8只小鼠，病毒總量0. 02ml/只，腦部接種，位置在小鼠右耳和右眼前緣連線中間，稍偏離正中線的頭蓋部，將注射針垂直刺入2 3_深，緩慢注射藥液。 正常對照組給予無病毒的稀釋液。觀察2晩，記錄小鼠發(fā)病、死亡情況，按Reed-Muench法計算半數(shù)致死量(Median lethal dose, LD50)。結(jié)果為感染后經(jīng)過短暫潛伏期后，出現(xiàn)震顫、聳毛、弓背、抽搐、體重下降。在腦、 肺、肝組織中均檢測到病毒核酸存在，結(jié)果見圖I。組織病理切片鏡下顯示小鼠前腦中有明顯神經(jīng)結(jié)構(gòu)的病理改變，并伴有大量的淋巴細胞浸潤和出血性壞死灶，結(jié)果見圖2。該病毒的半數(shù)致小鼠死亡劑量(LD50)為IO-5 VO. 2ml。2、體內(nèi)抗病毒實驗實驗小鼠隨機分成①正常對照組，灌服生理鹽水病毒感染對照組，灌服生理鹽水；③ACV治療對照組(100. 00mg/kg/d)，已有文獻報道ACV 在100mg/kg/d時對小鼠感染皰疫病毒的治療效果最好；@蒸枝核黃酮類化合物低劑量組(41. 56mg/kg/d);⑤蒸枝核黃酮類化合物中劑量組(81. 13mg/kg/d) 蒸枝核黃酮類化合物高劑量組(166. 25mg/kg/d);每組小鼠12只，病毒感染劑量采用致死劑量 (IOOLD50)O. 02ml/只，經(jīng)腦部注射接種。24小時后開始灌胃給藥，療程5天。觀察動物的癥狀和體征，記錄各組動物的死亡數(shù)和存活天數(shù)，比較各組的死亡保護率和平均生存天數(shù)(Mean time to death,MTA)0各治療組動物干治療結(jié)束后第5天和第10天各處死4只小鼠，摘眼球取血并分離血清，同時無菌取腦、肺、肝等臟器，用于組織病理學(xué)檢查、感染性病毒分離以及病毒核酸檢測，各組動物均觀察14天后處死。實驗結(jié)果為荔枝核黃酮類化合物給藥組中，高劑量組動物在觀察14天后，存活率為67%，與病毒對照組比較，顯示有明顯差異(p<0.01);但中劑量組和低劑量組的存活率分別為50%和42%，與病毒對照組比較，則均無統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05)。荔枝核黃酮類化合物高劑量組的平均存活時間與病毒對照組比較，有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05);但中劑量組和低劑量組的平均存活時間與病毒對照組分別比較，均無統(tǒng)計學(xué)差異(P > 0. 05)。詳細結(jié)果見表I。表I.荔枝核黃酮類化合物對HSV-I所致小鼠病毒性腦炎作用
權(quán)利要求
1.荔枝核黃酮類化合物在制備治療單純皰疹病毒引起的病毒性腦炎的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了荔枝核黃酮類化合物在制備治療單純皰疹病毒(HSV)感染所致的病毒性腦炎藥物中的應(yīng)用，具體體現(xiàn)在體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)荔枝核黃酮類化合物在小鼠體內(nèi)有明顯抑制HSV作用，表現(xiàn)為隨著藥物濃度的增加，小鼠感染癥狀減輕，死亡率降低，平均存活時間延長，小鼠腦炎癥狀明顯緩解，與病毒對照組相比有顯著性差異，且與藥物濃度呈正相關(guān)。
文檔編號A61K131/00GK102600290SQ20121007080
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月16日
發(fā)明者侯煒, 彭璇, 朱丹, 李立, 楊艷, 羅凡 申請人:武漢大學(xué)