專(zhuān)利名稱(chēng)：艾葉提取物及其在制備抗乙肝病毒藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然植物提取及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種艾葉提取物及其在制備抗乙肝病毒藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBv)引起的一種世界性疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全世界大約有20億人感染過(guò)HBV，其中約有3. 5億人是HBV攜帶者， 我國(guó)約有I. 2億HBV攜帶者。乙型肝炎病毒是導(dǎo)致急性、慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要病因，每年有30 50萬(wàn)人死于HBV引起的肝硬化或肝癌。目前臨床上抗HBV藥物主要為干擾素和核苷類(lèi)藥物。這兩類(lèi)藥物雖然在HBV感染的治療上取得了比較好的療效，但是有報(bào)道稱(chēng)干擾素適應(yīng)癥范圍窄，不良反應(yīng)多。核苷類(lèi)藥物停藥后易復(fù)發(fā)，長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生耐藥性， 易出現(xiàn)腎毒性、骨髓抑制等不良反應(yīng)，因此，尋找新型安全有效的抗乙肝病毒藥物是臨床急需解決的問(wèn)題。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮藥效等特點(diǎn)。傳統(tǒng)中藥在長(zhǎng)期治療乙型肝炎過(guò)程中體現(xiàn)了它獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)，開(kāi)發(fā)具有抗乙肝病毒作用的中藥和天然藥物是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。艾葉(Folium Artemisiae Argyi)是一味使用歷史悠久的傳統(tǒng)中藥,在我國(guó)的很多地區(qū)均有分布。傳統(tǒng)藥學(xué)理論認(rèn)為艾葉有理氣血、逐寒濕等功效。近代醫(yī)學(xué)研究證明艾葉還具有抗菌、平喘鎮(zhèn)咳祛痰、止血與抗凝血等作用。目前，尚未見(jiàn)到有關(guān)于艾葉提取物被用于抗乙肝病毒的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種艾葉提取物，以及該艾葉提取物在制備抗乙肝病毒藥物方面的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下
一種艾葉提取物，該提取物的有效成分包括黃酮類(lèi)、香豆素類(lèi)、內(nèi)酯類(lèi)、酚類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、甾體類(lèi)(如β_谷留醇等)和三萜類(lèi)化合物。黃酮類(lèi)化合物如5，7-二輕基-6，3 ’，4 ’ -三甲氧基黃酮(eupatilin,異澤蘭黃素)、5，7，4 ’ -三輕基-6，3 ’ - 二甲氧基黃酮(jaceosidin,棕矢車(chē)菊素)、圣草酹 (eriodictyol, 5，7，3 '，4 '-四輕基黃燒酮)、鼠李素(rhamnetin, 3,5,3 ' , 4 '-四輕基-7-甲氧基黃酮)、芳:菜素(Apigenin 5，7，4，-三輕基黃酮)、山萘酹(kaempferol, 3，4, 5, 7-四輕基黃酮)、木犀草素(Iuteolin 3’，4’，5, 7-四輕黃酮)、槲皮素(quercetin, 3，3’，4’，5，7-五羥基黃酮)、金合歡素(5，7- 二羥基-4’ -甲氧基黃酮)等。香豆素類(lèi)化合物如傘形花內(nèi)酯(umbelIiferone, 7-輕基香豆素)、瑞香素(daphnetin, 7, 8- 二輕基香豆素) 等。酚類(lèi)化合物如4-甲氧基-3-羥基苯酚、尿囊素(allantoin 5-尿基乙內(nèi)酰胺)等。三萜類(lèi)化合物如α -香樹(shù)脂醇、β -香樹(shù)脂醇、無(wú)羈萜、a -及β -香樹(shù)脂醇的乙酸酯、羽扇烯酮、粘霉烯酮、羊齒烯酮、24-亞甲基環(huán)木菠蘿烷酮、西米杜鵑醇等。所述艾葉提取物的制備方法，其包括如下步驟將艾葉用乙酸乙酯浸泡，然后回流，回流結(jié)束后固液分離，所得液體濃縮后，經(jīng)干燥即得。具體的，可取粉碎過(guò)的艾葉1kg，用4 IOL乙酸乙酯浸泡8h以上(用以使艾葉充分浸潤(rùn))，然后將艾葉及浸泡液回流I 6h。為了獲得較高的提取率，也可以按照下述步驟進(jìn)行回流結(jié)束后固液分離，所得固體殘?jiān)梢栽俅斡靡宜嵋阴セ亓鳎桃悍蛛x，合并兩次所得液體并濃縮成浸膏。固體殘?jiān)扇绱酥貜?fù)提取，共回流I 3次。所述艾葉提取物在制備抗乙肝病毒藥物中的應(yīng)用。艾葉提取物可制成多種劑型膠囊劑、片劑、顆粒劑、滴丸、緩釋制劑及納米制劑等劑型。可以以艾葉提取物為活性物質(zhì)，與醫(yī)學(xué)上可接受的藥用輔料、賦形劑等混配、組合，制成上述各種劑型；還可以與其他抗乙肝病毒藥物共同作為活性物質(zhì)，與醫(yī)學(xué)上可接受的藥用輔料、賦形劑等混配、組合，制成上述各種劑型。普通膠囊將艾葉提取物或與明膠等囊材制得微囊后與硬脂酸鎂等以1:3的比例混勻后，填入空膠囊中即得。規(guī)格0. 2g/粒(含量50mg/粒)。臨床擬用量200mg/日，2次/曰。軟膠囊將艾葉提取物與明膠、甘油、蒸餾水熔融制得的膠液用軋囊機(jī)壓制成囊， 即得。規(guī)格0. 2g/粒(含量50mg/粒)。臨床擬用量200mg/日，2次/日。片劑將艾葉提取物或微囊化后與微晶纖維素、乳糖、硬脂酸鎂等輔料混配，按公知的制片技術(shù)和裝備，經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的凹沖壓成片，制成片劑。規(guī)格0. 25g/片(含量50mg/片)。 臨床擬用量200mg/日，2次/日。顆粒劑將艾葉提取物或微囊化后與蔗糖、糊精、乳糖等輔料混配制粒，整粒，滅菌分裝即得。規(guī)格0. 3g/袋(含量IOOmg/袋)。臨床擬用量200mg/日，2次/日。滴丸將艾葉提取物與PEG 4000以1:3混合熔融，以固體分散技術(shù)，用滴丸機(jī)滴制成丸。規(guī)格20mg/粒(含量5mg/粒)。臨床擬用量200mg/日，2次/日。緩釋制劑將艾葉提取物或微囊化后與羥丙基甲基纖維素、乳糖、硬脂酸鎂等充分混勻、制粒，壓制成片，即得。規(guī)格0. 3g/片(含量lOOmg)。臨床擬用量400mg/2日。納米制劑將艾葉提取物與磷脂、助乳化劑和水以納米乳化法制成納米乳或亞微乳，再倒入冰水中冷卻即得到納米粒或亞微乳。規(guī)格50mg/10ml。臨床擬用量IOOmg/日。本發(fā)明艾葉提取物的提取方法簡(jiǎn)單，所得艾葉提取物經(jīng)體外細(xì)胞試驗(yàn)證明具有較強(qiáng)的抗乙肝病毒活性(這可能是提取物中包含的有效成分如黃酮類(lèi)、香豆素類(lèi)、內(nèi)酯類(lèi)、 酚類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、留體類(lèi)和三萜類(lèi)化合物等作用的結(jié)果)，可用于制備抗乙肝病毒藥物。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。實(shí)施例I
一種艾葉提取物，該提取物的有效成分包括黃酮類(lèi)、香豆素類(lèi)、內(nèi)酯類(lèi)、酚類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、甾體類(lèi)和三萜類(lèi)等化合物。所述艾葉提取物經(jīng)下述方法制得取Ikg粉碎過(guò)的艾葉置于燒瓶中，加入6000ml乙酸乙酯振搖混合后浸泡12h左右，然后將艾葉及浸泡液回流2h (燒瓶中可放入數(shù)粒沸石)，回流結(jié)束后靜置15min左右，然后過(guò)濾。濾渣與4000ml乙酸乙酯混合后再次回流2h，過(guò)濾；合并兩次所得濾液，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，濃縮至少量時(shí)轉(zhuǎn)至蒸發(fā)皿，水浴蒸干，于60°C真空干燥8h即得21. 5g墨綠色浸膏。實(shí)施例2
一種艾葉提取物，該提取物的有效成分包括黃酮類(lèi)、香豆素類(lèi)、內(nèi)酯類(lèi)、酚類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、甾體類(lèi)和三萜類(lèi)等化合物。所述艾葉提取物經(jīng)下述方法制得取Ikg粉碎過(guò)的艾葉置于燒瓶中，加入9000ml乙酸乙酯振搖混合后浸泡24h左右，然后將艾葉及浸泡液回流4h，回流結(jié)束后靜置片刻，然后過(guò)濾。所得濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器儀濃縮，濃縮至少量時(shí)轉(zhuǎn)至蒸發(fā)皿，水浴蒸干，于60°C真空干燥8h即得20. Og墨綠色浸膏。實(shí)施例3
一種艾葉提取物，該提取物的有效成分包括黃酮類(lèi)、香豆素類(lèi)、內(nèi)酯類(lèi)、酚類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、甾體類(lèi)和三萜類(lèi)等化合物。所述艾葉提取物經(jīng)下述方法制得取Ikg粉碎過(guò)的艾葉置于燒瓶中，加入5000ml乙酸乙酯振搖混合后浸泡IOh左右，然后將艾葉及浸泡液回流3h，回流結(jié)束后靜置片刻，然后過(guò)濾。濾渣與5000ml乙酸乙酯混合后再次回流2h，過(guò)濾；合并兩次所得濾液，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，濃縮至少量時(shí)轉(zhuǎn)至蒸發(fā)皿，水浴蒸干，于60°C真空干燥8h 即得22. 6g墨綠色浸膏。艾葉提取物所含有效成分的驗(yàn)證試驗(yàn)
1、制備樣品溶液 1.1樣品水溶液
稱(chēng)取O. 2g實(shí)施例I所得艾葉提取物，置具塞錐形瓶中，加水15ml，超聲振蕩15分鐘使溶解,過(guò)濾,收集濾液,得樣品水溶液。I. 2樣品乙醇溶液
稱(chēng)取O. 2g實(shí)施例I所得艾葉提取物，置具塞錐形瓶中，加乙醇20ml，超聲振蕩15分鐘， 活性碳脫色兩次(每次O. 5g)，過(guò)濾，收集濾液，得樣品乙醇溶液。I. 3樣品氯仿溶液
稱(chēng)取O. 2g實(shí)施例I所得艾葉提取物，置具塞錐形瓶中，加氯仿15ml，超聲振蕩15分鐘,活性碳脫色三次(每次O. 5g)，過(guò)濾，收集濾液，得樣品氯仿溶液。2、驗(yàn)證試驗(yàn)
2.I黃酮類(lèi)化合物
2.I. I鹽酸-鎂粉試驗(yàn)
取樣品乙醇溶液1ml，加少量鎂粉后，滴加濃鹽酸5-7滴，溶液顏色變紅。為正反應(yīng)。2. I. 2鹽酸-鋅粉試驗(yàn)
取樣品乙醇溶液1ml，加少量鋅粉后，滴加濃鹽酸5-7滴，放置后溶液顏色變紅。為正反應(yīng)。2. 1.3三氯化鋁熒光試驗(yàn)
取樣品乙醇溶液適量，點(diǎn)于濾紙片上，晾干后，噴以I %三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈下觀察，樣品斑點(diǎn)呈現(xiàn)黃色熒光。為正反應(yīng)。I %三氯化鋁乙醇溶液的配制取O. Ig三氯化鋁，加乙醇使溶解成10ml，即得。2. I. 4濃氨水熒光試驗(yàn)取樣品乙醇溶液適量，點(diǎn)于濾紙片上，晾干后，置氨蒸氣中熏幾分鐘，置紫外光燈下觀察，樣品斑點(diǎn)呈現(xiàn)黃色熒光。為正反應(yīng)。2. 2香豆素、內(nèi)酯類(lèi)化合物 2. 2. I開(kāi)閉環(huán)反應(yīng)
取樣品乙醇溶液1ml，加I %氫氧化鈉溶液2-3滴，溶液為澄清，再加2%鹽酸5_6滴，溶液變渾濁。為正反應(yīng)。2. 2. 2異羥肟酸鐵反應(yīng)
取樣品乙醇溶液1ml，加7%鹽酸羥胺乙醇溶液和10%氫氧化鈉溶液各5-6滴，置水浴上加熱幾分鐘后，加2%鹽酸溶液4-5滴,再加1%三氯化鐵溶液4-5滴,溶液呈現(xiàn)紅色。為正反應(yīng)。2. 2. 3重氮鹽試劑反應(yīng)
取樣品乙醇溶液Iml,加I %氫氧化鈉溶液數(shù)滴,置水浴加熱,后放至室溫,加新配置的重氮對(duì)硝基苯胺試液數(shù)滴，溶液呈紅色。為正反應(yīng)。重氮對(duì)硝基苯胺試液的配制取對(duì)硝基苯胺O. 4 g，加稀鹽酸20ml與水40ml，使溶解，冷卻至15°C，緩緩加入10%亞硝酸鈉溶液，至取溶液I滴能使碘化鉀淀粉試紙變?yōu)樗{(lán)色， 即得。2. 3酚類(lèi)化合物
2.3. I FeCl3試劑反應(yīng)
取樣品水溶液1ml，加l%FeCl3溶液5_6滴，放置后發(fā)現(xiàn)有暗綠色沉淀。為正反應(yīng)。2. 3. 2三氯化鐵-鐵氰化鉀試劑反應(yīng)
取樣品水溶液適量，點(diǎn)于濾紙片上，晾干后，噴以1%三氯化鐵一 1%鐵氰化鉀(1:1)溶液，顯藍(lán)色斑點(diǎn)。為正反應(yīng)。2. 4有機(jī)酸化合物
2.4. I pH試紙檢查
取水溶液用pH試紙檢查,與標(biāo)準(zhǔn)色版比較為4. 6。為正反應(yīng)。2. 4. 2溴酚藍(lán)試液反應(yīng)
取樣品水溶液適量，點(diǎn)于濾紙片上，晾干后，噴以O(shè). 1%溴酚藍(lán)乙醇溶液，呈藍(lán)色背景黃色斑點(diǎn)。為正反應(yīng)。O. 1%溴酚藍(lán)乙醇溶液配制稱(chēng)取O. 005g溴酚藍(lán)，加乙醇使溶解成5ml，即得。2. 5甾體、三萜化合物
2.5. I氯仿-濃硫酸反應(yīng)
取樣品氯仿溶液1ml，加濃硫酸1ml，使其分層，氯仿層顯紅色，濃硫酸層有黃綠色熒光。為正反應(yīng)。2. 5. 2三氯醋酸反應(yīng)
取樣品乙醇溶液適量，點(diǎn)于濾紙片上，晾干后，滴25%三氯醋酸乙醇溶液，于干燥箱內(nèi) 100°C烘烤,呈紅棕色。為正反應(yīng)。25%三氯醋酸乙醇溶液的配制取三氯醋酸25g，加乙醇使溶解成100ml，即得。由上述驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果可知，本發(fā)明所述艾葉提取物中含有黃酮類(lèi)、香豆素類(lèi)、內(nèi)酯類(lèi)、酚類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、留體類(lèi)和三萜類(lèi)化合物。
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艾葉提取物的體外試驗(yàn) I. I主要試驗(yàn)材料
I.I. I HepG2. 2. 15細(xì)胞株由廣州暨南大學(xué)生物醫(yī)藥研究開(kāi)發(fā)基地贈(zèng)予，本研究室自行傳代培養(yǎng)供實(shí)驗(yàn)使用。I. 1.2主要試劑拉米夫定(3TC，賀普丁片)購(gòu)自葛蘭素-史克制藥(蘇州)有限公司產(chǎn)品；1640培養(yǎng)基購(gòu)自北京索萊寶生物醫(yī)藥科技有限公司；胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Amersco 公司；MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；G418,購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司；HBV核酸擴(kuò)增突光定量檢測(cè)試劑盒，深圳匹基生物工程股份有限公司；乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg) ELISA診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)，上海科華生物技術(shù)有限公司；乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg) ELISA診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)，上海科華生物技術(shù)有限公司；DNA提取試劑盒，美國(guó)Omega公司。1.1.3主要儀器生物安全柜Hfsafe-1200TE Class II Type B2，香港力康發(fā)展有限公司；水套式二氧化碳培養(yǎng)箱HF160W，香港力康發(fā)展有限公司；酶標(biāo)儀168-1000XC， 美國(guó)BIO RAD ;熒光PCR檢測(cè)儀，美國(guó)Roche LightCyclerl. 5 ;全自動(dòng)滅菌器HVE-50，日本HIRAYAMA ；96孔培養(yǎng)板，24孔培養(yǎng)板，50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，美國(guó)corning公司；超純水儀為 Millipore公司產(chǎn)品。實(shí)施例I所得艾葉提取物對(duì)細(xì)胞的毒性試驗(yàn)
依據(jù)Mosmann建立的MTT比色法檢測(cè)實(shí)施例I所得艾葉提取物對(duì)H印G 2. 2. 15細(xì)胞的毒性。具體為細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后，加入O. 25%胰蛋白酶，消化后加入培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞,加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，濃度為2 X IO4個(gè)/mL后接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(每孔ΙΟΟμΙ),每個(gè)濃度設(shè)四個(gè)孔，置CO2培養(yǎng)箱(37°C，5. 0%C02)中培養(yǎng)24h。細(xì)胞長(zhǎng)成單層后加入含有不同濃度艾葉提取物的1640培養(yǎng)基，并設(shè)不含艾葉提取物的正常細(xì)胞為空白對(duì)照組。連續(xù)培養(yǎng)72h，每孔加入20μ1含結(jié)晶紫的MTT，于CO2培養(yǎng)箱(37°C，5. 0% CO2)中繼續(xù)培養(yǎng)。4h后， 棄去上清液,每孔加入200μ1 DMS0，用微量振蕩器充分震蕩，使結(jié)晶紫充分溶解。用酶標(biāo)儀 (檢測(cè)波長(zhǎng)490nm，參考波長(zhǎng)630nm)讀取各孔OD值，記錄結(jié)果。計(jì)算不同濃度艾葉提取物對(duì) HepG 2. 2. 15細(xì)胞的抑制百分率，結(jié)果見(jiàn)表I。
Γ I方八f 空白對(duì)給藥孔OD埴ιηηο/
_9]抑制百分率=^空白對(duì)照toffl^Xi00%
表I、不同濃度艾葉提取物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的毒性作用
權(quán)利要求
1.一種艾葉提取物，其特征在于，該提取物的有效成分包括黃酮類(lèi)、香豆素類(lèi)、內(nèi)酯類(lèi)、 酚類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、留體類(lèi)和三萜類(lèi)化合物。
2.權(quán)利要求I所述艾葉提取物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟將艾葉用乙酸乙酯浸泡，然后回流，回流結(jié)束后固液分離，所得液體濃縮后，經(jīng)干燥即得。
3.如權(quán)利要求2所述艾葉提取物的制備方法，其特征在于，取粉碎過(guò)的艾葉1kg，用 4 IOL乙酸乙酯浸泡8h以上，然后將艾葉及浸泡液回流I 6h。
4.權(quán)利要求I所述的艾葉提取物在制備抗乙肝病毒藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種艾葉提取物，該提取物的有效成分包括黃酮類(lèi)、香豆素類(lèi)、內(nèi)酯類(lèi)、酚類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、甾體類(lèi)和三萜類(lèi)化合物。所述艾葉提取物經(jīng)如下步驟制得將艾葉用乙酸乙酯浸泡，然后回流，回流結(jié)束后固液分離，所得液體濃縮后，經(jīng)干燥即得。本發(fā)明所述艾葉提取物的提取方法簡(jiǎn)單，所得艾葉提取物經(jīng)體外細(xì)胞試驗(yàn)證明具有較強(qiáng)的抗乙肝病毒活性，可用于制備抗乙肝病毒藥物。
文檔編號(hào)A61K127/00GK102600225SQ20121011761
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月20日
發(fā)明者侯迎迎, 張壯麗, 張小俊, 張艷, 張長(zhǎng)征, 王寧, 王慶端, 王桂芳, 趙志鴻, 鄒敏, 鄭立運(yùn), 陳慧平, 馬方, 黃勇勇 申請(qǐng)人:河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院