專利名稱：新穎乳酸菌株、含有其的組合物及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新穎乳酸菌株，特別是指一種可以降低發光桿菌 (Photobacterium damselae)生長且可提升海鱺對發光桿菌抵抗力的乳酸菌株，以及含有該乳酸菌株的組合物及該組合物的用途。
背景技術：
隨著全球人口的增加，人類對于糧食的需求也與日俱增；在捕魚業漁獲量日漸減少的情況下，養殖漁業成為重要的肉品供應來源之一。海鱺(Rachycentron canadum)是一種熱帶海洋魚類，也是海鱺科(Rachycentridae)唯一的魚種。因為海鱺對環境的高忍受度以及其快速的生長率，海鱺成為理想的海水箱網養殖魚種。臺灣海鱺養殖業始于1990 年代初期；于1997年人工育種成功后，此高經濟價值的魚種便廣泛地被養殖于海水箱網中 (Liao et al.，2004)。
盡管海鱺產量逐年增加，但包括發光桿菌(或稱巴斯德桿菌)(Photobacterium damselae subsp. piscicida, Pdp)與弧菌(Vibrio)等的細菌性病原菌已對海鱺魚苗造成嚴重的疫情。其中發光桿菌Pdp對海鱺造成的威脅最嚴重，死亡率也最高。發光桿菌Pdp 為革蘭氏陰性菌，會造成感染魚的內臟產生白色的結節，并且由受感染的吞噬細胞散布傳染。到目前為止，海鱺養殖業者對抗發光桿菌Pdp最主要的方法是使用抗生素；然而，發現有越來越多對抗生素產生抗性的發光桿菌，而且使用抗生素也會有藥物殘留等食品安全的問題。另一方面，由于海鱺的免疫記憶力(immune memory)不像許多其它的魚種(如石斑魚)那么有效，因此對海鱺接種發光桿菌疫苗的效果并不穩定。
由此可見，上述常規針對海鱺抵抗發光桿菌感染的方法仍有諸多不足，并非權宜之計，而亟待加以改良。
在許多研究中，乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)已被使用作為益生菌 (probiotics)。乳酸菌產生的有機酸與細菌素(bacteriocin)能夠抑制或直接殺死許多微生物(Ercolani et al. , 1976 ；Mathur et al. , 2005),且乳酸菌抗酸及抗膽汁的能力可以提高該菌在動物腸胃道的存活率(Irianto et al.，2002)。此外，前人研究顯示，約有I % 至10%的腸道細菌具有成為益生菌的潛力(Sugita et al.，2002)。
因此，本申請發明人鑒于上述常規針對海鱺抵抗發光桿菌感染的方法所衍生的各種缺點，以及乳酸菌作為益生菌的可能性，亟思加以改良創新，并經多年苦心孤詣潛心研究后，終于成功研發完成本申請的新穎乳酸菌株、含有其的組合物及其用途。發明內容
本說明書中所述的所有技術性及科學術語，除非另外有所定義，均為本領域普通技術人員可共同了解的意義。
本發明的目的在于提供一種新穎乳酸菌株-乳酸戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus),該菌株篩選自饑餓三天后海鱺的腸道。
本發明的再一個目的在于提供一種含有新穎乳酸菌株-乳酸戊糖片球菌 (Pediococcus pentosaceus)的組合物，該組合物具有抑制發光桿菌(Photobacterium damselae)等病原菌生長，以及提升海鱺免疫力的效果。
本發明的另一個目的在于提供一種含有新穎乳酸菌株-乳酸戊糖片球菌 (Pediococcus pentosaceus)的組合物的應用，所述組合物可作為魚飼料、魚疫苗的添加劑，以增進魚類抵抗發光桿菌等病原菌的能力。
可達成上述發明目的的新穎乳酸菌株、含有其的組合物及其用途，包括一種新穎乳酸戍糖片球菌株(Pediococcus pentosaceus),或所述菌株的繼代培養后代；所述菌株篩選自海鱺腸道樣品，并經過耐酸性、耐膽鹽性篩選，以及喂食海鱺后進行攻毒試驗所得到可以幫助海鱺抵抗發光桿菌Pdp感染的乳酸菌株。
所述新穎乳酸戍糖片球菌株(P. pentosaceus)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心、保藏編號為CGMCC No. 5235的菌株，保藏日期為2011年9月9曰。
將本發明所篩選的乳酸戍糖片球菌(P. pentosaceus)PP49菌株培養懸浮液與發光桿菌Pdp —起培養，結果顯示，本發明的新穎乳酸戊糖片球菌PP49菌株可以抑制病原菌發光桿菌Pdp的生長。
將本發明的乳酸戍糖片球菌(P. pentosaceus)PP49菌株與市售魚飼料混合以喂食海鱺，結果顯示本發明乳酸戊糖片球菌(P. pentosaceus)PP49菌株可明顯促進海鱺生長率；搭配接種發光桿菌疫苗后，可以增加海鱺對發光桿菌Pdp感染的抵抗力，其相對存活率顯著高于只有接種疫苗的魚以及對照組。
本發明進一步提供含有本發明的乳酸戍糖片球菌(P. pentosaceus)PP49菌株的組合物，所述組合物用于抑制發光桿菌Pdp的生長；所述組合物可制成動物飼料添加劑或動物用醫療組合物等形式。
其中所述組合物可進一步包含藥學上可接受的載體，所述載體包含但不限于 溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer) > 黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、穩定劑(stabilizing agent)、螯合劑 (chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、 潤滑劑(lubricant)、表面活性劑(surfactant)、佐劑(adjuvant),及其它類似或適用本發明的載體。
本發明還提供增強魚類對抗發光桿菌的免疫力的方法，包含對魚類施予有效量的乳酸戊糖片球菌(P. pentosaceus)PP49菌株、或含有其的組合物及發光桿菌疫苗，即可增強其對抗發光桿菌的免疫力；其中所述乳酸戍糖片球菌(P. pentosaceus)PP49菌株可進一步混合于飼料或動物用醫療組合物中喂食魚類，并搭配該發光桿菌疫苗接種，以提高其對抗發光桿菌的免疫力。
另外，本發明亦提供前述乳酸戍糖片球菌(P. pentosaceus)PP49菌株用于制備保護魚類免于感染發光桿菌的藥物的方法或用途。
本發明所述的新穎乳酸戍糖片球菌(P. pentosaceus)PP49菌株,亦應包含其繼代培養的后代或突變株，但仍具有與本發明所述的菌種相同的特性、基因體(genomic)或功能性。
術語“有效量”是指對于個體的用量，該用量可有效增進、改善該個體的免疫力以對抗發光桿菌，進而預防及保護該個體免于感染發光桿菌及其衍生的相關疾病。
術語“預防、保護”是指相較于未使用本發明的疫苗者，使用本發明的疫苗者將可有效增強其免疫力以對抗發光桿菌，增加其存活率，進而預防及保護其免于發光桿菌引起的疾病及其衍生的相關疾病。


圖I為海鱺腸道乳酸菌株抑制發光桿菌Pdp生長的曲線圖；取乳酸戊糖片球菌 (P. pentosaceus)菌株PP49培養懸浮液加入發光桿菌Pdp生長培養基中培養該菌,并觀察發光桿菌Pdp的生長量；陰性對照組以BHI液體培養基混合MRS液體培養基(pH值為6. 2) 培養發光桿菌Pdp，而陽性對照組則是以BHI液體培養基混合調整過pH值的MRS液體培養基(pH值為5)培養發光桿菌Pdp ;吸光值OD6tltl代表發光桿菌Pdp的生長量。
圖2為比較喂食乳酸菌株(PP49) 14天后的試驗組海鱺與對照組海鱺的體重，圖2A 為海鱺體重分析圖；圖2B為海鱺生長速率分析圖。
圖3為比較喂食乳酸菌株PP49 (乳酸菌喂食試驗組)海鱺與未喂食乳酸菌(對照組)海鱺的吞噬細胞分解病原體的能力分析圖；吸光值OD595代表吞噬細胞分解病原體的能力。
圖4為針對喂食乳酸菌株PP49 (乳酸菌喂食試驗組)海鱺與未喂食乳酸菌(對照組)海鱺，進行發光桿菌Pdp攻毒試驗的結果分析圖。
圖5為針對接種發光桿菌疫苗的海鱺，進行發光桿菌Pdp攻毒試驗的結果分析圖； 兩組試驗組魚均接種發光桿菌疫苗，其中一組試驗組同時配合喂食乳酸菌株PP49(疫苗接種及乳酸菌喂食組)，另一組試驗組則只喂食市售魚飼料(僅疫苗接種組)；對照組則未接種疫苗，并且只喂食市售魚飼料。
具體實施方式
本發明通過下面的實施例進行示范闡明，但本發明不受下述實施例的限制。
實施例一海鱺腸道乳酸菌株的篩選與分離
I.海鱺腸道乳酸菌篩選
收集饑餓三天后的海鱺腸道樣品，于乳酸菌篩選用MRS培養基(Fluka 69966)中， 在37°C厭氧環境下培養(De Man et al.，1960)。將分離出的乳酸菌在體外初步完成耐酸性及耐膽鹽測試，以及吸附性試驗后，選出三株乳酸菌株。其中，代號為strain PP49的乳酸菌株對胃酸與膽鹽的耐受度最高，因此被挑選作為喂食海鱺的試驗材料。
2.以16S rDNA測序鑒定海鱺腸道乳酸菌株
&16S rDNA測序對所篩選出的乳酸菌進行菌種鑒定，以下列引物對進行PCR反應 (ffeisburg et al. ，1991)。
正向引物
5， -agagtttgatcatggctcag-
反向引物
5， -aaggaggtgatccagcc-3，(SEQ ID No. 1) (SEQ ID No. 2)
以 PCR System 2700 (Applied Biosystems 公司)進行 PCR 反應，PCR 產物以 ABI 3730 (Applied Biosystems公司)進行測序,接著以NCBI網站上BLAST功能進行序列比對, 根據比對結果，PP49菌株屬于乳酸戍糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。
實施例二海鱺腸道乳酸菌株抗發光桿菌Pdp的效果
I.乳酸菌株PP49抑制發光桿菌Pdp的生長
取實施例一分離得到的乳酸菌株PP49的代謝產物來測試抑制發光桿菌Pdp的效果。發光桿菌Pdp菌株P40由澎湖大學古鎮鈞教授提供，于37° C下，以MRS液體培養基培養至吸光值OD6c 為2，然后以5，000 Xg離心15分鐘后，收集上清液(pH值為5)。將收集的上清液加入BHI液體培養基中(Becton, Dickinson and Company), BHI培養基與上清液的混合比例為4:1，并紀錄發光桿菌Pdp在該混合培養基內的生長曲線。陰性對照組以BHI液體培養基混合MRS液體培養基(pH值為6. 2)培養發光桿菌Pdp，而陽性對照組則是以BHI 液體培養基混合調整過PH值的MRS液體培養基(pH值為5)來培養發光桿菌Pdp ;兩個對照組的培養基混合比例均為4: I。在本試驗中，分別將0. Iml的發光桿菌Pdp菌液(吸光值 OD600為I)加入到5ml各組培養基中，于28。C下培養，并以吸光值0D_測量發光桿菌Pdp 的生長曲線。
發光桿菌Pdp的生長曲線如圖I所示。添加乳酸菌株PP49培養上清液的Pdp生長曲線遠低于沒有添加乳酸菌培養上清液的兩個陰性對照組。
實施例三乳酸戊糖片球菌(P. pentosaceus)菌株PP49喂食海鱺后對海鱺免疫力提升的效果分析
隨機將魚(體重為4. 6g)分為喂食乳酸菌組與對照組，每組含有17只魚。乳酸菌喂食劑量為109CFU/g，每日喂食量為魚體重的5%，共喂食2周。喂食期間結束后，每組選出2只魚采血進行分析；接著進行攻毒試驗。
喂食期間過后，所有的魚都以浸泡方式進行攻毒試驗，于20°C下將魚浸泡在含有 2X104CFU/ml發光桿菌的海水中2分鐘。收集死亡魚并分離腎臟與脾臟中的微生物樣本以確認死因，并計算攻毒后10天內魚的累積死亡率。
I.海鱺體重增長率的分析
比較喂食乳酸菌14天后的試驗組海鱺與對照組海鱺的體重，結果如圖2所示。喂食乳酸菌PP49的海鱺體重有明顯增長，該結果顯示，喂食乳酸菌株PP49可以提高魚12% 的生長率。
2.海鱺吞噬細胞分解病原體能力的分析
根據Choudhury等人于2005年提出的方法，以硝基藍四氮唑(nitroblue tetraxolium, NBT)分析法測定血液中吞噬細胞分解病原菌的能力，又稱為呼吸爆 (respiratory burst, RB)。簡言之,取96孔盤,每孔加入50 μ I血液樣本,并于37°C下培養I小時，使吞噬細胞貼附于盤上。接著，去除上清液，并以PBS清洗三次后，加入50 μ I 2%硝基藍四氮唑(NBT)，于37°C下再培養I小時。之后加入50 μ I 100%甲醇作用3分鐘，并以30%甲醇清洗三次。待96孔盤風干后，每孔加入60 μ I 2Ν氫氧化鉀(potassium hydroxide)以及70 μ I 二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMS0),待所有試劑反應后，以盤式酵素免疫分析儀(ELISA reader,MRX II,Dynex Technologies公司)讀取吸光值OD49tl 的讀值。
海鱺吞噬細胞分解病原體能力的分析結果如圖3所示。結果顯示喂食乳酸菌的海鱺吞噬細胞分解病原體的能力明顯高于對照組(P < O. 05)。
3.攻毒試驗結果
進行攻毒試驗后，海鱺的死亡率如圖4所示。喂食乳酸菌(試驗組)的海鱺相對存活率(RPS)為74. 3。所有死亡的魚確定死因均為感染發光桿菌Pdp所引起，喂食較對照組高出60%。
實施例四接種Pdp死毒疫苗配合喂食乳酸戍糖片球菌(P. pentosaceus)菌株PP49 對海鱺免疫力提升的效果分析
隨機將魚(體重為35g)分為3組(接種疫苗組、接種疫苗加喂食乳酸菌組、無接種疫苗無喂食乳酸菌的對照組)。每組含有12只魚。所有的試驗均重復三次，攻毒試驗方式與實施例三相同，但攻毒劑量改為I. 5X105CFU/ml。
除了對照組魚外，所有魚于試驗開始時均進行Pdp死毒疫苗初次免疫(primary vaccination),并于三周后進行第二次追加免疫。初次免疫及追加免疫的免疫劑量為 O. 333mg發光桿菌Pdp/魚體重(g)。
攻毒試驗結果如圖5所示，只接種疫苗沒有喂食乳酸菌株PP49的海鱺，其相對存活率(RPS)為59 ;配合喂食乳酸菌株PP49與接種疫苗的海鱺死亡率最低(如圖5所示)， 則存活率(RPS)提高為95. 5。
本發明所提供的新穎乳酸菌株(Pediococcuspentosaceus)、含有其的組合物及其用途，與其它常規技術相互比較時，具有下列的優點
I.本發明所提供的乳酸戍糖片球菌株PP49 (P. pentosaceus strain PP49)分離自海鱺腸道，該菌具有耐酸性及耐膽鹽等特性，制成口服劑型喂食魚后，可存活在魚腸胃道內。
2.喂食本發明所提供的乳酸戍糖片球菌株PP49 (P. pentosaceus strain PP49)的魚，在同一生長時間內，其體重較未喂食該菌株的魚重；可見本發明的菌株可增加魚的生長率。
3.本發明所提供的乳酸戍糖片球菌株PP49 (P. pentosaceus strain PP49)的培養懸浮液可以抑制發光桿菌Pdp的生長速度；而且以發光桿菌Pdp攻毒后，喂食該菌株的魚的相對存活率較對照組高出60% ;此外，喂食本發明菌株的魚，其吞噬細胞分解病原體的能力(respiratory burst)明顯比對照組的吞曬細胞的高；因此,本發明的乳酸戍糖片球菌株PP49 (P. pentosaceus strain PP49)可作為益生菌,幫助魚抵抗發光桿菌。
4.本發明所提供的含乳酸戊糖片球菌株PP49的飼料，經與Pdp死毒疫苗搭配使用后，可增強海鱺或其它魚類對抗發光桿菌的免疫能力，且其效果相較于單獨使用疫苗的魚， 喂食該飼料及搭配疫苗接種的魚其相對存活率大幅提高。
上述詳細說明是針對本發明的可行實施例的具體說明，但這些實施例并非用于限制本發明的專利范圍，凡未脫離本發明技術精神所做的等效實施或變更，均應包含于本申請的專利范圍中。
綜上所述，本申請提供的乳酸菌株不但為新穎菌株，而且具有上述多種功效，應已充分符合新穎性及創造性的法定發明專利要件，現依法提出申請，懇請貴局核準本發明專利申請，以勵發明，至感德便。序列表序列表<110>生合生物科技股份有限公司澎湖科技大學 <120>新穎乳酸菌株、含冇其的組合物及其用途 <160>3<210> I <-211>20 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>止向引物 <400> !agagtttgat catggctcag20<210>2 <211> Vl <212>DNA<213〉人工序列 <220〉<223>反向引物 <400> 2aaggaggtga tccagcc1權利要求
1.一種新穎乳酸菌株，所述菌株為ー種乳酸戍糖片球菌株(Pediococcuspentosaceus)，其為保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心、保藏編號為CGMCC No. 5235的菌株，或所述保藏菌株的繼代培養后代。
2.ー種包含如權利要求I所述的乳酸菌株的組合物。
3.如權利要求2所述的組合物,其中所述組合物用于抑制發光桿菌(Photobacteriumdamselae)的生長。
4.如權利要求2所述的組合物，其中所述組合物包含動物飼料添加劑或動物用醫療組合物。
5.如權利要求4所述的組合物，其中所述動物為魚類。
6.一種增強魚類對抗發光桿菌的免疫力的方法，包含對魚類施予有效量的如權利要求I所述的乳酸菌株及發光桿菌疫苗，即可增強其對抗發光桿菌的免疫力。
7.如權利要求6所述的方法，所述乳酸菌株可進ー步混合于飼料或動物用醫療組合物中喂食魚類，并搭配所述發光桿菌疫苗接種，以提高其對抗發光桿菌的免疫力。
全文摘要
一種新穎乳酸菌株、含有其的抑菌組合物及其用途，包括一種新穎乳酸戊糖片球菌株(Pediococcus pentosaceus)，或該菌株的繼代培養后代；該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.5235，該菌株可以抑制發光桿菌(或稱巴斯德桿菌)(Photobacterium damselae)等病原菌的生長；以及包含該乳酸菌PP49菌株的組合物，該組合物為動物飼料添加劑或動物用醫療組合物等形式。
文檔編號A61P31/04GK102978126SQ20121012665
公開日2013年3月20日 申請日期2012年4月26日 優先權日2011年4月28日
發明者胡宏熙, 齊肖琪 申請人:生合生物科技股份有限公司, 澎湖科技大學