專利名稱：麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產物在制藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及抗癌藥物的制備,尤其涉及ー種麻花究& -amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產物在制備抗肝癌藥物中的應用。
背景技術：
高寒藏藥麻花究系龍膽科(Gentianaceae)、龍膽屬(Gentiana),主要分布于西 藏、青海、甘肅海拔2500-4700米的高寒地區，多年生草本，全草及根入藥，由于其分布散，生長期長，藥材收集極為困難，因而已成為瀕危物種。主治黃膽性肝炎，風濕關節痛、結核病潮熱、哮喘、抽搐、休克、過敏反應。富含五環三萜類次生代謝物，P-amyrin(0-香樹素)是其中的ー類重要的三萜類化合物。^ -amyrin是植物中最常見的三職類化合物之一。它的五碳環骨架,折疊為椅式構象，是由2, 3-氧化角S烯經過一系列反應在P-amyrin合成酶催化下形成的。而其合成酶是該途徑中非常重要的限速酶，控制著這些藥用成分前體合成的第一步反應，因此對該基因的克隆具有極其重要的意義。齊墩果酸是該反應中的最終產物，在龍膽科植物麻花艽中^ -amyrin合成酶基因對于抗肝炎有效成分齊墩果酸的積累具有很高的促進作用。到現在為止，已從許多雙子葉植物中分離到了 P-amyrin合成酶基因，如雙子葉人參中的PNY1，PNY2 ;干草中的GgbASl ;豌豆中的PSY ;還有截形苜蓿和白樺等單子葉植物燕麥中的AsbASl。并有文章報道對其功能的驗證。盡管麻花究中P-amyrin合成酶基因GsAS的克隆和功能驗證已有報道,但是,利用麻花究^ -amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產物制備抗肝癌藥物還未見報道。

發明內容
針對現有技術的不足,本發明要解決的問題是提供ー種麻花究0-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產物在制備抗肝癌藥物中的應用。本發明所述麻花究^ -amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產物在制備抗肝癌藥物中的應用，其中所述肝癌細胞是HepG2肝癌細胞或SMMC7721肝癌細胞；有效抑制H印G2肝癌細胞或SMMC7721肝癌細胞生長的麻花艽P -amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產物濃度為I 25 ii g/mL,優選濃度為10 V- g/mL。本發明提供的麻花究^ -amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產物為研制開發抗肝癌藥物奠定了基礎。為了更好地理解本發明的實質,下面用麻花究P-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產物藥理實驗及結果來說明其在抗肝癌藥物制備中的應用。本發明所述麻花究^ -amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產物的制備利用麻花艽cDNA為模板，克隆得到P -amyrin合成酶基因GsAS，構建酵母表達載體pPICZA-GsAS，轉化酵母，酵母轉化后會形成甲醇誘導型(Mut+)和甲醇敏感型(Muts)菌株，在MM培養基上生長而在MD培養基上不生長的菌株為Muts型酵母菌株，而在兩種培養基上都能生長的為Mut+型酵母菌株。對比pPICZA-GsAS酵母轉化子在含MM (含甲醇培養基)和MD(無甲醇培養基)培養基上的生長情況，篩選出Mut+酵母轉化子。挑選Mut+酵母菌于25mL MGY培養基中28°C振蕩培養至OD6tltl = 2_6，轉接到100_200mL MM培養基中，使其OD6tltl=1.0。繼續28°C振蕩培養，每24小時加一次甲醇(終濃度0.5% )，震蕩培養4d，收集菌體備用。取甲醇誘導4天的酵母溶液加入50mL的離心管中，離心菌體，用液氮研磨菌體；カロ入3-4mL體積比為2 I的甲醇-氯仿(色譜純)，超聲波破壁30min ； IOOOOrpm,離心，上清液用氯仿萃取，并用水洗，重復操作。收集氯仿層溶液，水浴蒸餾濃縮，回收溶劑得浸膏。^ -amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產物的藥理實驗 正常組10%小牛血清的DMEM培養基培養上指數期正常貼壁生長的H印G2肝癌細胞或SMMC7721肝癌細胞；對照組用溶劑甲醇作對照；實驗組浸膏用甲醇溶解，用于處理H印G2肝癌細胞或SMMC7721肝癌細胞的濃度為0. 5,1, 5,10, 25, 50, 75,100 y g/mL。結果表明與正常組和溶劑對照組相比，處理72h后，1，5，10，25 U g/mL的處理組與對照組細胞形態相比均有變化，IOy g/mL處理組的細胞形態變化明顯(見附圖1)，其由之前的典型的貼壁生長的細胞出現變圓、脫落、壞死。而實驗組中的其他處理組的細胞形態變化相對較弱。GsAS的酵母表達產物處理對H印G2肝癌細胞和SMMC7721肝癌細胞的存活率有明顯影響。IfepG2肝癌細胞和SMMC7721肝癌細胞用不同濃度的麻花艽P-amyrin合成酶基因 GsAS 的酵母表達產物(0. 5，1，5，10，25，50，75，IOOii g/mL)處理 72h 后，1，5，10，25 u g/mL酵母表達產物處理下肝癌細胞H印G2肝癌細胞和SMMC7721肝癌細胞的存活率分別為72. 8%，67. 4%,52. 5%,49. 8% (見附圖 2)和 74%，68. 8%，49. 5%,47. 8% (見附圖3)。總結麻花究P-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產物對肝癌細胞生長的生長有抑制作用。有效抑制H印G2肝癌細胞或SMMC7721肝癌細胞生長的麻花艽P-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產物濃度為I 25 ii g/mL，優選濃度為10 u g/mL。本發明用從中草藥中克隆得到的基因的酵母轉化子進行培養、誘導、提取，得到抗肝癌的五環三萜化合物，與從中草藥中直接提取的三萜化合物相比，產物較純，特定三萜化合物的獲得更方便，為抗肝癌藥物的制備提供了一種新的方法和資源。


圖I :顯微鏡下觀察到的H印G2肝癌細胞正常組，溶劑對照組和10 u g/mL處理組培養72h后的細胞形態。正常組和溶劑對照組細胞正常的貼壁生長，10 u g/mL處理組細胞形態發生明顯變化，細胞出現變圓、脫落、壞死(SMMC7721肝癌細胞的結果類似)。圖2 :肝癌細胞H印G2在1，5，10，25 ii g/mL麻花艽P-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產物處理條件下的存活率變化。數據為三次重復實驗的平均值，利用t-test檢驗進行顯著性差異分析(*P < 0. 05，n = 3)。圖3 :肝癌細胞 SMMC7721 在 l，5，10，25ii g/mL 麻花艽 P-amyrin 合成酶基因 GsAS的酵母表達產物處理條件下的存活率變化。數據為三次重復實驗的平均值，利用t-test檢驗進行顯著性差異分析(*P < 0. 05，n = 3)。
具體實施例方式實施例I、GsAS的克隆
I. I麻花艽總RNA的提取(I)麻花艽材料放入預冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成均勻的粉末。注意研磨過程中要保證材料浸在液氮中。(2)待液氮揮發后將材料迅速轉入預冷的離心管中，每50_100mg組織材料加入ImL TRIZOL溶液，混勻后，于室溫放置5min，12000r/min, 2_8°C離心IOmin去沉淀。(3)每ImL TRIZOL溶液中加入0. 2mL氯仿，振蕩15sec充分混勻，于室溫放置5min, 12000r/min, 2_8°C離心 15min。
(4)取上清，每ImL TRIZOL加入0. 5mL的異丙醇，混勻，室溫放置10 20min。(5) 2-8°C 12000r/min 離心 IOmin,棄上清。(6)加ImL 75%こ醇洗漆沉淀2次,4°C不超過7500r/min離心5min,棄上清。(7)室溫放置晾干后，加入15uL DEPC處理的雙蒸水溶解RNA。I. 2逆轉錄合成第一鏈cDNA(I)0. 2mL Eppendorf 管中，加入下列成分用DNaseI 純化的上述總 RNA (0. I U g/ U L) 2. 0 U LOlige (dT) anchored primer (2 U M) 2. 0 U L(2)(TC水浴變性10分鐘，立即置于冰浴中。(3)在 IOii L 反應體系中加入下列成分2. Oii L 5 X MMLV RT buffer ；1. Ou L250umol/L dNTP mix ；0. 25 u L Rnasin ;0. 5 y L(200u/y L)MMLV 逆轉錄酶；2 y L 上述 RNA變性液。42°C進行逆轉錄反應Ihr。反轉錄第一鏈cDNA用于后面的反應。I. 3PCR以上述逆轉錄合成第一鏈cDNA為模板，PCR法擴增基因片段。(I)PCR引物由上海生エ生物工程技術服務有限公司合成引物PO : 5' -ATGTGGAGGCTAAAAATCGG-3'引物PlA' -CGTCTCCTACGGCACTTGCTTGCG-3'(2) PCR反應體系
10XPCR buffer2|j L
MgC12(25mmol/L)I. 5|j L
dNTP (each 250|j mol/L)0. 2|j L
PO (10|j mol/L)l|j L
Pl (4|j mol/L)l|j L
逆轉錄第一鏈產物4jj L
Ex Taq0. 2|J L
無菌水10. 1|J L(3) PCR反應程序94°C 5min ；94°C 30sec,50°C 30sec，72°C 2min，35 個循環；最后 72°C延伸 7min。PCR產物電泳如圖I所示。1.4 5' -RACE按照TaKaRa 5' -Full RACE Core Set說明書所示步驟操作。電泳5' -RACE產物。1.5目的片段的回收(I)用刀片切下上述電泳結果中含目的條帶的膠條置于I. 5mLEppendorf管中。(2)稱重，加入3-4倍體積的DR-I Buffer, 65°C加熱IOmin融化膠塊，每隔2min混勻一次保證膠塊能充分融化。(3)加入 DR-I Buffer 量的 1/2 體積的 DR-II Buffer，均勻混合。 (4)將 Spin Cloumn 安置于 Collection Tube 上,將上述溶液轉移至 Spin Column中，5000rpm離心lmin,棄濾液。(5)將 500 u L Rinse A 加入 Spin Column 中，5000rpm 離心 lmin,棄濾液。(6)將 700ii L Rinse B 加入 Spin Column 中，5000rpm 離心 lmin,棄濾液。(7)重復步驟6,然后12000rpm再離心lmin。(8)將Spin Cloumn安置于新的I. 5mL的離心管上,在Spin Cloumn膜的中央處加入預熱到60°C的25 ii L的水或洗脫緩沖液，室溫靜置lmin。(9) 12000rpm 離心 lmin 洗脫 DNA。(10)重復步驟9，2次，將所有洗脫液集中收集于一管內，混勻，取少量電泳檢查回收效率，其余加入1/10體積的3mol/L NaAc (pH5. 3)和2倍體積的無水こ醇，_20°C沉淀Ihr0(11)然后4°C，WOOOrpm離心15min，用70%冷乙醇洗滌沉淀，棄盡液體，用40 u L無菌水溶解沉淀?；厥盏钠斡糜诤竺娴倪B接反應。I. 6 連接用上述的回收目的片段與PMD-18T載體(購自寶生物工程有限公司，下同)按摩爾比約I : I的比例進行連接，連接體系如下
目的片段7[JL
T-vectorIm l
10XT4 DNA Ligase Buffer1|J L
T4 DNA Ligase1|J L混勻并短暫離心，16°C連接過夜。得到重組質粒PMD18T-AS1，用于后面的反應。I. 7CaC12法制備感受態細胞(I)挑取DH10B單菌落接種于5mL LB液體培養基中，37°C振蕩培養過夜。(2)按I 100-1 50的比例，取ImL菌液接種于IOOmL LB液體培養基中，37°C振蕩培養至菌液0D600為0. 3-0. 6。(3)將菌液冰浴IOmin, 4°C 4000rpm離心IOmin,收集菌體。(4)沉淀加IOmL預冷的0. IM CaCl2懸浮后，冰浴30min。(5) 4°C 4000rpm離心lOmin。沉淀重懸浮于ImL預冷的0. IM CaC12,混勻并冰水浴中保存，備用或加入15%的甘油置于_70°C中保存。
I. 8 熱擊法轉化 Ecoli DHlOB(I)在無菌條件下吸取100 U L感受態細胞,加入I. 5mL預冷的無菌Eppendorf管中，加入IOiiL連接產物(1.6中的重組質粒)，輕輕混勻，立即置于冰上30min。(2)在42°C恒溫水浴中熱激90sec (準確記時)。(3)冰浴 3_5min。(4)加入800 u L不含抗生素的LB液體培養基，混勻，37°C振蕩培養45_60min。(5)短暫離心收集菌體,用150 ii L LB液體培養基重懸菌體,轉至含抗生素Amp、X-gal、IPTG的LB固體平板上，用無菌涂布棒涂布。(6)將平板于37°C正向放置15_30min至液體被吸收，倒置平板，于37°C培養12-16hr，觀察平板會有藍白斑。白斑用于后面的質粒提取。I. 9堿裂解法提取大腸桿菌質粒(I)挑取白色單菌落，接入含抗生素Amp(50mg/L)的3mL LB液體培養基中，同時也要保存所挑取的白色單菌落于含抗生素Amp (50mg/L)的固體LB平板中，37°C震蕩培養12-16h ；(2) 12000rpm離心30sec，收集培養物中的菌體，盡量棄盡上清；(3)加入IOOy L冰預冷的溶液I，在渦旋器上使菌體充分重懸；(4)加入200 u L溶液II，立即將離心管緩緩顛倒數次，冰浴5-lOmin ；(5)加入150ii L冰預冷的溶液III，緩緩顛倒離心管數次直至白色沉淀充分形成，冰浴 5-10min ；(6) 12000rpm離心3min，取上清轉入另一微量離心管中，加入2倍體積95%こ醇，混勻后，室溫靜置3min ；12000rpm離心3min,使質粒DNA沉淀；(7)棄盡上清，取200 UL TE溶液溶解沉淀；(8)加入等體積冰預冷的5mol/L LiCl溶液，冰浴5min，沉淀大量的RNA ； (9) 12000rpm,離心 3min ；(10)轉移上清到另ー離心管中，加入2倍體積的95%こ醇，混勻后于室溫靜置3min, 12000rpm離心3min使質粒沉淀；(11)棄上清后用ImL 70%こ醇洗滌沉淀，棄盡液體；(12)室溫干燥后，取20 ii L含RNaseA(20 U g/mL)的TE溶液溶解沉淀，37°C水浴30 60min 消化 RNA。(13)為減少損失，可先用TE將總體積補充至200 U L，加入等體積的酚-氯仿-異戍醇，充分振蕩5-10min, 12000rpm離心5min ；(14)取上清，加入等體積的氯仿-異戊醇，重復以上操作；(15)取上清，加入1/10體積的3mol/L醋酸鈉(pH5. 3)和2倍體積的無水こ醇，混勻后_20°C放置15min, 12000rpm離心3min使質粒沉淀；(16)棄上清用ImL 70%こ醇洗滌沉淀，棄液體，用40 y L TE或無菌水溶解沉淀。質粒用于后面的反應。I. 10質粒酶切驗證用EcoRI酶切上述質粒,酶切反應體系如下表所示重組質粒pMD18T-ASl16 U L
EcoRI限制性內切酶2iiLIOXBuffer2 U L將上述反應體系混勻并5000rpm離心lmin，37°C水浴反應過夜，然后進行I %的TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。I. IIDNA 測序挑取含有重組質粒的陽性單菌落用含有Amp (50mg/L)的液體LB搖過夜，然后送上海博亞生物技術有限公司測序，得到測序結果 ，經過NCBI blast分析，上述cDNA序列與人參的PNYl同源，證明實驗得到的是麻花艽的P-amyrin合成酶基因，命名為GsAS。實施例2、麻花艽P -amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達載體構建2. I酵母表達載體的構建2. I. I目的基因的獲得(I)引物設計設計ー對PCR擴增帶EcoRI和XhoI酶切位點都GsAS基因。POl :5’ -GAATTCATGTGGAGGCTAAAAATCGG-3’EcoRIP12 :5’ -CTCGAGCGTCTCCTACGGCACTTGCTTGCG-3’XhoI(2) PCR 反應體系
IOXPCR buffer2|j L
MgC12(25mmol/L)I. 5|j L
dNTP (each 250|j mol/L)0. 2|j L
POl (4|j mol/L)l|j L
P02 (4|j mol/L)l|j L
重組質粒 PMD18T-AS1l|j L
rTaq (TaKaRa)0. 2|J L
無菌水13. l|j L(3) PCR反應條件為94°C 5min ；94°C 30sec,60°C 30sec,72°C 2min，35 個循環；最后 72で延伸 7min。PCR產物電泳回收后用于后面的反應。2. I. 2表達載體的構建步驟引入酵母表達載體pPICZA (購自寶生物工程有限公司)，該載體上含有中所含有EcoR和XhoI兩個酶切位點。將帶有EcoR和XhoI酶切位點的cDNA與質粒分別進行EcoR和XhoI的雙酶切，再按照5 I的比例在T4連接酶的催化下進行連接16小時以上。反應體系及條件如下(l)cDNA酶切反應體系和條件cDNA /EcoR+XhoI6|j L
EcoRl|j L
XhoIl|j L
IOXH Buffer2|j L37 °C 16h ；
(2)質粒酶切反應體系和條件
pPICZA 質粒6|j L
EcoRl|j L
XhoIl|j L
IOXH Buffer2|J L37 °C 16h ；連接反應用T4DNA Ligase進行，體系和條件同T載體的連接體系和條件。用連接產物轉化大腸桿菌，從卡那霉素抗性的菌落中篩選出重組子，得到酵母表達載體pPICZA-GsAS0提取陽性克隆pPICZA-GsAS的質粒進行PCR鑒定和雙酶切鑒定，反應體系和條件同鑒定重組子。2. 2DNA導入酵母(I)挑取酵母菌株(畢赤酵母)的單克隆，接種至IOmL液體YH)培養基[20g/L蛋白胨，10g/l酵母提取物，葡萄糖2% (單配單加)]，30°C，200rpm,培養2_3天；(2)按照I : 50的比例將菌液轉移至50mL YPD液體培養基中30°C，200rpm,培養3 5h，此時的菌液OD6tltl = 0. 4 0. 6。(3)將菌液分裝至IOmL無菌離心管中，姆管5mL ；(4)3000rpm離心5min,收集細胞。用2. 5mL無菌ddH20重懸菌體；(5) 3000rpm 離心 5min,收集細胞。用 0. ImL IOOmM(I X) LiAc/TE buffer 重懸菌體；(6)3000rpm離心I 2min沉淀細胞(僅需將菌體離心至離心管底即可)，用微量移液器小心吸走上清；(7)用50iiL IOOmM (I X) LiAc/TE buffer重懸菌體,將菌懸液移至滅菌的I. 5mLEppendorf 管中；(8)將ImL單鏈擔體DNA煮沸5min，快速在冰水中冷卻；(注無需每次使用時都煮沸擔體DNA，可分裝成小份凍存；凍融3 4次后應再煮沸，取出后應保持在冰上)(9)將步驟7準備的樣品，3000rpm離心I 2min沉淀細胞,用微量取樣器小心吸
走上清；(10)按下列順序加入240 ii L PEG(50% w/v)(加入后用槍頭上下吹打，盡量將菌體懸浮)；36iiL IM(IOX)LiAc ;25 y L單鏈擔體DNA(2. Omg/mL) 50 y L水和質粒DNA(0. I 10 u g)( 一般情況下,質粒加入10 40 y L即可)；(11)潤旋振蕩Eppendorf管lmin,直到細胞完全混勻，30°C水浴30min ；(12) 42 °C 水浴中熱激 20 25min ；(13) 5000rpm離心I 2min，用微量移液器除去轉化混合液；
(14)吸取0.2 I. OmL無菌水加到每個反應管中，用移液器輕輕抽提以懸浮沉淀；(15)取50 ii L轉化液，均勻涂布在含卡那霉素抗性的培養基上，30°C培養2 4d。用未轉化的酵母做對照。2. 3酵母重組子的鑒定2. 3. I菌落PCR鑒定初篩(I)平板上的菌落長到肉眼可見時。(2)將除了模板以外的其他PCR反應液組分準備好，井分裝。(3)用ー根滅菌牙簽挑取菌落，在PCR管中測ー下，放入一個滅菌的I. 5ml離心管，對PCR管和I. 5ml離心管編號。 (4)PCR擴增，0.8%瓊脂糖凝膠電泳。對PCR擴增顯現特異性條帶的克隆，置于
I.5ml離心管中的半截牙簽扔到5mlYro培養基中，30°C培養，24±1小時提取DNA，用DNA作為模板再進行PCR進ー步確定。PCR反應體系及條件如下
10XPCR buffer2|j L
MgC12(25mmol/L)I. 5|j L
dNTP (each 250|j mol/L)0. 2|j L
PO (4|j mol/L)l|j L
Pl (4|j mol/L)l|j L
菌液IjJ l
rTaq (TaKaRa)0. 2|J L
無菌水13. l|j LPCR反應條件為94°C 5min ；94°C 30sec,60°C 30sec,72°C 2min，35 個循環；最后 72で延伸 7min。2. 3. 2酵母總DNA為模板進行二次鑒定酵母基因組的提取(I)接種重組和空質粒轉化子于5ml YPD培養基，30°C，培養16-18小時；(2)室溫下，1500g離心5-10min收集菌體；(3) IOOuL TE (pH7. 0)重懸后 1500g 離心 5-lOmin 收集菌體；(4)用 2mL 的 SCED (PH7. 5)重懸；(5)加入 I 3mg 蝸牛酶，37°C, 50min ；(6)加入2ml I % SDS,輕搖混勻，然后置于冰上5min ；(7)加入I. 5mL 5M醋酸鉀，輕輕混勻；(8) IOOOOg 離心 5-lOmin,棄上清；(9)加入2倍體積無水こ醇,室溫放置15min ；(10) IOOOOg 離心 20min,棄上清；(11)加入 0. 7mLTE 緩沖液；(12)加入等體積的苯酚氯仿(I 1V/V)；
(13)加入1/2體積的7. 5M醋酸銨溶液；(14)加入2倍體積的無水こ醇，-20°C放置Ihr ；(15) IOOOOg 離心 20min ;(16)加入ImL 75%こ醇漂洗沉淀一次；

(17)干燥后，加入50ul的TE或H20溶解，-20°C備用。PCR反應體系的組成和反應條件同菌落PCR，PCR產物0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析。實施例3、酵母轉化子的培養，誘導表達及表達產物的提取。3. I酵母轉化子的表型篩選3. I. I篩選酵母表型的試劑匪培養基，MD培養基(I)MM 培養基1. 34% YNB 4X1(T5%生物素 0.5% 甲醇先將890mL水高溫滅菌，冷卻至60°C時加入100mL10XYNB，2mL500X生物素和IOmLlOOX甲醇，固體培養基中加入15g瓊脂粉。(2)MD 培養基1. 34% YNB 4X1(T5%生物素 2%葡萄糖先將800mL水高溫滅菌20min，冷卻至60°C時加入IOOmL 10XYNB,2mL 500 X生物素，IOOmLlOX葡萄糖，固體培養基中加入15g瓊脂粉。(3) 10XYNB(含硫酸銨不含氨基酸的酵母単元)134g YNB用IOOOmL溶解，充分溶解后過濾滅菌，4°C保存；(4) 500X生物素20mg生物素溶解在IOOmL水中，過濾滅菌，4°C保存；(5) 100X甲醇50mL甲醇與IOOmL水混勻，過濾滅菌，備用；(6) IOX葡萄糖；IOOOmL水中溶解200g葡萄糖,高溫滅菌15min或是過濾滅菌；3. I. 2酵母轉化子的表型篩選(I)酵母轉化后會形成甲醇誘導型(Mut+)和甲醇敏感型(Muts)菌株，在麗培養基(含甲醇培養基)上生長而在MD培養基(無甲醇培養基)上不生長的菌株為Muts型酵母菌株，而在兩種培養基上都能生長的為Mut+型酵母菌株；(2)將篩選出的陽性菌落按依次對應的順序在點在MM培養基和MD培養基上，30°C條件下靜置培養2-3d ；(3)對比pPICZA-GsAS酵母轉化子在含MM和MD培養基上的生長情況，篩選出在兩種培養基上都能生長的Mut+型酵母菌株。3. 2酵母轉化子的培養和誘導表達3. 2. I酵母轉化子的培養和誘導表達的培養基和試劑(I)MGY 培養基IOX甘油IOOmL甘油同900mL水混勻，高溫滅菌或過濾滅菌，備用；MGY 培養基1. 34% YNB 1% 甘油 4 X 10-5% 生物素將800mL滅菌水同IOOmL 10XYNB,2mL 500X生物素和IOOmL IOX甘油混合，
4°C保存。(2) MM 培養基(3)甲醇3. 2. I酵母轉化子的培養和誘導表達(I)挑選Mut+酵母菌，接種到含25mL MGY培養基的IOOmL三角瓶中，28°C振蕩培養至 OD6tltl = 2-6 ；(2)將MGY培養基中培養的均轉接到100-200mL MM培養基中，使其OD6tltl = I. 0 ；(3)麗培養基中的酵母菌繼續30°C振蕩培養，每24小時加一次甲醇(終濃度
0.5% )，震蕩培養4d；(4) 12，OOOrpm,離心 IOmin,收集菌體備用。3. 3表達產物提取
(I)Mut+型酵母轉化子誘導表達4d后，12，OOOrpm離心收集菌體,用液氮研磨菌體；(2)加入3-4mL體積比為2 I的甲醇-氯仿(色譜純)，超聲波破壁30min(超生15s，間隔IOs)；(3) 10，OOOrpm，離心；(4)上清液用氯仿萃取，并用水洗，重復操作3次；(5)收集氯仿層溶液，水浴蒸餾濃縮，回收溶劑得浸膏。實施例4、酵母轉化子表達產物抗癌活性檢測4. I酵母轉化子表達產物對HepG2肝癌細胞的藥理學作用檢測4. I. lHepG2肝癌細胞的培養H印G2肝癌細胞用含10%小牛血清的DMEM培養基培養，于37°C、飽和濕度、5% CO2的培養箱中培養，2-3d傳代I次。4. I. 2對H印G2肝癌細胞的處理(I)取對數生長期的貼壁細胞，PBS沖洗并消化，用含10%小牛血清的培養基配制成2. 5 XlO4. mじ1的細胞懸液；(2)實施例3中獲得的酵母轉化子提取的浸膏用甲醇溶解；(3)將細胞接種于96孔培養板中，每孔200 U L ;分別加入用甲醇配制的酵母轉化子提取物，使提取物的終濃度為0. 5,1, 5,10, 25, 50, 75,100 ii g/mL ;加入甲醇的細胞組為對照組；正常生長的細胞組作空白組；每個濃度3組，實驗重復3次。4. I. 3HepG2肝癌細胞形態變化和存活率觀察分別在12h，24h，48h，72h在顯微鏡下觀察肝癌細胞的形態變化，統計其存活率。4. I. 4結果統計分析結果發現與正常組和溶劑對照組相比，處理72h后，1，5，10，25 U g/mL的處理組與對照組HepG2肝癌細胞的細胞形態相比均有變化，10 u g/mL處理組的細胞形態變化明顯(見附圖I)，其由之前的典型的貼壁生長的細胞出現變圓、脫落、壞死。而實驗組中的其他處理組的細胞形態變化相對較弱。GsAS的酵母表達產物處理對H印G2肝癌細胞的存活率有明顯影響。I, 5,10, 25 ii g/mL麻花究P-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產物處理72h后，肝癌細胞H印G2肝癌細胞存活率分別為72.8%，67.4%，52. 5%，49.8% (見附圖2)。GsAS的酵母表達產物處理對H印G2肝癌細胞的存活率的影響，在I 25 ii g/mL提取物處理下隨著濃度升高和時間的增長，提取物對H印G2肝癌細胞的存活率影響變大；5 u g/mL的提取物處理24h后，HepG2的細胞活性就發生明顯變化，細胞存活率明顯降低；5 u g/mL的提取物處理48h后，HepG2的細胞的存活率降低到約60% ;而處理72h后，I u g/mL的提取物處理條件下，HepG2細胞的生存力也發生明顯降低(如圖2)。
4. 2酵母轉化子表達產物對SMMC7721肝癌細胞的藥理學作用檢測4. I. 1SMMC7721肝癌細胞的培養SMMC7721肝癌細胞用含10 %小牛血清的DMEM培養基培養，于37 °C、飽和濕度、5 %CO2的培養箱中培養，2-3d傳代I次。4. I. 2對SMMC7721肝癌細胞的處理(I)取對數生長期的貼壁細胞，PBS沖洗并消化，用含10%小牛血清的培養基配制成2. 5 XlO4. mじ1的細胞懸液；(2)實施例3中獲得的酵母轉化子提取的浸膏用甲醇溶解，
(3)將細胞接種于96孔培養板中，每孔200 U L ;分別加入用甲醇配制的酵母轉化子提取物，使提取物的終濃度為0. 5,1, 5,10, 25, 50, 75,100 ii g/mL ;加入甲醇的細胞組為對照組；正常生長的細胞組作空白組；每個濃度3組，實驗重復3次。4. I. 3SMMC7721肝癌細胞形態變化和存活率觀察分別在12h，24h，48h，72h在顯微鏡下觀察肝癌細胞的形態變化，統計其存活率。4. I. 4結果統計分析結果發現與正常組和溶劑對照組相比，GsAS的酵母表達產物的處理對SMMC7721肝癌細胞形態的影響與對HepG2肝癌細胞的形態影響類似，1,5,10, 25 u g/mL的處理組與對照組SMMC7721肝癌細胞的細胞形態相比有變化，10 u g/mL處理組的細胞形態變化明顯；GsAS的酵母表達產物處理對SMMC7721肝癌細胞的存活率也有明顯影響。1，5，10，25 y g/mL麻花艽P -amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產物處理72h后，SMMC7721肝癌細胞存活率分別為74%，68. 8%,49. 5%,47. 8% (見附圖 3)。
權利要求
1.麻花究^-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產物在制備抗肝癌藥物中的應用。
2.如權利要求I所述的應用，其特征是所述肝癌細胞是H印G2肝癌細胞或SMMC7721肝癌細胞。
3.如權利要求I或2所述的應用，其特征是有效抑制H印G2肝癌細胞或SMMC7721肝癌細胞生長的麻花艽P -amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產物濃度為I 25 y g/mL。
4.如權利要求3所述的應用，其特征是有效抑制H印G2肝癌細胞或SMMC7721肝癌細胞生長的麻花究^ -amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產物的濃度為10 u g/mL。
全文摘要
本發明公開了一種麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產物在制備抗肝癌細胞藥物中的應用；其中有效抑制肝癌細胞HepG2和SMMC7721生長的麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產物的濃度為1～25μg/mL。本發明提供的麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產物與從中草藥中直接提取的三萜化合物相比，產物較純，特定三萜化合物的獲得更方便，為抗肝癌藥物的制備提供了一種新的方法和資源，為研發抗肝癌藥物奠定了基礎。
文檔編號A61P35/00GK102657879SQ20121013243
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月28日 優先權日2012年4月28日
發明者劉艷玲, 向鳳寧, 呂欣, 李碩, 趙忠娟 申請人:山東大學