專利名稱：一種胎盤造血干細胞及其制備方法和胎盤造血干細胞注射劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是涉及一種胎盤造血干細胞及其制備方法和胎盤造血干細胞注射劑。
背景技術(shù)：
造血干細胞，是指具有自我更新和多向分化能力的一類細胞。它的基本特性是具有自我更新能力，即經(jīng)過一個細胞周期活動之后，可以產(chǎn)生兩個與分裂前性質(zhì)相同的造血干細胞，同時又具有多向分化能力，即在一定的環(huán)境條件下，造血干細胞具有向各系血細胞 分化的能力。造血干細胞移植目前廣泛應(yīng)用于惡性血液病(如急性白血病、慢性粒細胞白血病等)、非惡性難治性血液病(如再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征等)遺傳性疾病(先天性免疫缺陷病、地中海貧血等)和某些實體瘤治療。造血干細胞移植是指對病人進行全身照射、化療和免疫抑制預(yù)處理后，將正常供體或自體的造血干細胞經(jīng)血管輸注給病人，使重建正常的造血和免疫功能。一般來說，造血干細胞存在于三個部位，分別是骨髓、外周血和臍帶血，根據(jù)其來源分別稱之為骨髓造血干細胞、外周血造血干細胞和臍帶血造血干細胞。隨著醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展，近年來發(fā)現(xiàn)胎盤里含有大量的造血干細胞，與上述三種來源的造血干細胞相t匕，胎盤中所含造血干細胞的數(shù)量很高，而且移植胎盤造血干細胞的配型要求不需要很嚴格，且移植后反應(yīng)較輕且不需要采用藥物。此外，作為胎盤造血干細胞來源-胎盤，來源廣泛，孕婦生產(chǎn)后往往成為廢棄物，其采集不會引起母親和新生兒任何不適的感覺或產(chǎn)生任何不良的影響。諸多優(yōu)點使胎盤造血干細胞有望取代骨髓造血干細胞、外周血造血干細胞和臍帶血造血干細胞用于造血干細胞移植中。目前從胎盤分離制備造血干細胞的技術(shù)還不成熟，現(xiàn)有技術(shù)中有采用研磨法和酶法制備胎盤造血干細胞的報道。但是，研磨法較為粗糙，細胞不能從組織中完全分離，數(shù)量少，而且研磨的方法對細胞有傷害，影響活力。而酶法多是采用單一酶來進行酶解制備，其中絕大部分為IV型膠原酶，如申請?zhí)枮?1131190. 8的中國專利“從胎盤組織中提取造血干細胞用于建立造血干細胞庫的新方法”，其中記載了利用單一膠原酶制備胎盤造血干細胞的方案，但并未公開造血干細胞數(shù)量和活力。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種胎盤造血干細胞及其制備方法和胎盤造血干細胞注射劑，使得所述制備方法能夠提高所制備的胎盤造血干細胞的數(shù)量和活力。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案一種胎盤造血干細胞的制備方法，包括以下步驟步驟I、將胎盤預(yù)處理后，用IV型膠原酶消化液和II型膠原酶消化液消化，然后洗滌、過濾，分別收集第一濾液和第一濾渣，所述IV型膠原酶消化液中IV型膠原酶質(zhì)量百分比為0. 02-0. 2%，所述II型膠原酶消化液中II型膠原酶質(zhì)量百分比為0. 01-0. 1% ；步驟2、將所述第一濾渣用I型膠原酶消化液和步驟I所述II型膠原酶消化液消化，然后洗滌、過濾，分別收集第二濾液和第二濾渣，所述I型膠原酶消化液中I型膠原酶質(zhì)量百分比為0. 02-0. 2% ；步驟3、合并第一濾液和第二濾液并離心，棄上清后重懸沉淀，將得到的重懸液加至人淋巴細胞分離液中，然后密度梯度離心，收集中間一層的白膜層細胞液并離心，棄上清后即得胎盤造血干細胞。其中，作為優(yōu)選，所述胎盤與IV型膠原酶消化液的體積比為6:1，所述胎盤與II型 膠原酶消化液的體積比為6:1，所述胎盤與I型膠原酶消化液的體積比為6:1。本發(fā)明所述IV型膠原酶消化液、I型膠原酶消化液和II型膠原酶消化液均優(yōu)選用DMEM/F12 (gibco)培養(yǎng)液溶解配制，除此之外也可用本領(lǐng)域其他常規(guī)培養(yǎng)液溶解配制。本發(fā)明所用胎盤由某醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，選取肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病檢測陰性且無產(chǎn)科并發(fā)癥的胎盤，術(shù)前經(jīng)得產(chǎn)婦知情同意并簽署知情同意書。術(shù)前準備無菌聚苯乙烯儲液瓶作為運送瓶，內(nèi)裝市售細胞培養(yǎng)液，采集后4°C條件下12小時內(nèi)送到制備處分離制備胎盤造血干細胞。現(xiàn)有技術(shù)通常采用單一的膠原酶(主要是IV型膠原酶)來進行酶解消化胎盤，進而制備出胎盤造血干細胞，但是單一的膠原酶無法充分酶解消化胎盤的各種組織，使得制備的胎盤造血干細胞的數(shù)量較少，而且活力也不高。因此，本發(fā)明采用IV型膠原酶和II型膠原酶聯(lián)合、I型膠原酶和II型膠原酶聯(lián)合進行兩次消化胎盤組織，利用不同類型膠原酶的特性，高度消化組織，釋放出更多的造血干細胞。膠原酶主要水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分，當擬消化的組織內(nèi)含較多結(jié)締組織或膠原成分時，可采用膠原酶解離細胞法，而胎盤正屬于這一類組織。I型膠原酶用于上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細胞的分離，用于消化組織中連接部分使其成為單個細胞；IV型膠原酶包含至少7種蛋白酶成分，它能消化多種組織；II型膠原酶適用于肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織細胞的分離。各種膠原酶對膠原的酶切位點不同，選擇恰當類型的膠原酶聯(lián)合起來消化胎盤組織效果會提高。作為優(yōu)選，所述消化在37°C恒溫條件下消化20_60mino在本發(fā)明所述制備方法的起始階段，需要對胎盤進行預(yù)處理，這一措施屬于本領(lǐng)域公知，即對胎盤進行消毒、除去胎盤包膜以及洗滌的步驟，在酶解消化胎盤之前，本領(lǐng)域技術(shù)人員均知曉這些預(yù)處理步驟。為了能夠提高酶解消化的效果，本發(fā)明還可以將胎盤剪成l-2mm3的小塊。在本發(fā)明所述制備方法中，所有洗滌和重懸均優(yōu)選為采用生理鹽水洗滌和重懸。另外，在步驟I和步驟2中，所述過濾均優(yōu)選為采用50-300目的篩網(wǎng)過濾。為了進一步提高最后獲得的胎盤造血干細胞的數(shù)量，作為優(yōu)選，在步驟I之后、步驟2之前還包括以下步驟將所述第一濾渣洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合并至所述第一濾液。同時，在步驟2之后、步驟3之前還包括以下步驟將所述第二濾渣洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合并至所述第二濾液。
上述對濾渣的重復(fù)洗滌可以最大程度上避免殘留在未消化胎盤組織(即濾渣)上的細胞損失。在本發(fā)明所述制備方法步驟3中，需要利用人淋巴細胞分離液對兩次的濾液進行分離，在這之前優(yōu)選用500-1000g離心力對合并的濾液離心，然后棄上清重懸沉淀。在密度梯度離心時，由于人淋巴細胞分離液密度小于紅細胞、大于單個核細胞，離心后處于中間的白膜層就是單個核細胞的細胞液，其中包含有造血干細胞，所述密度梯度離心的離心力優(yōu)選為500-800g，離心時間優(yōu)選為10-20min。白膜層細胞液處于中間一層，在分離過程中難免帶有一些人淋巴細胞分離液，而且白膜層細胞液較為粘稠，因此離心的時候需要較大的離心力。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述白膜層細胞液的離心具體為將所述白膜層細胞液先用400_700g的離心力離心5_10min,棄上清重懸沉淀,接著將重懸液用300-500g的離心力離心5-10min。此外，本發(fā)明還提供一種由本發(fā)明所述制備方法制備的胎盤造血干細胞，經(jīng)流式細胞儀檢測其表面標志物⑶34和⑶45，結(jié)果顯示⑶34陽性，⑶45陰性細胞含量為I. 5-1. 8%，表明含有較高量的造血干細胞。在與研磨法、單一膠原酶法制備的胎盤造血干細胞的對比試驗中，本發(fā)明制備方法制備的造血干細胞活力明顯高于其余兩種方法制備的造血干細胞的活力，而且在造血干細胞數(shù)量上也較高。本發(fā)明還提供一種胎盤造血干細胞注射劑，由本發(fā)明所述胎盤造血干細胞和含質(zhì)量百分比為10-30%血清白蛋白的生理鹽水組成，所述注射劑可根據(jù)不同細胞數(shù)來決定含血清白蛋白的生理鹽水的添加量，做成不同規(guī)格的產(chǎn)品。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明采用IV型膠原酶和II型膠原酶聯(lián)合、I型膠原酶和II型膠原酶聯(lián)合，利用不同類型膠原酶的特性充分消化胎盤制備胎盤造血干細胞，由此提高了所制備的胎盤造血干細胞的數(shù)量和活力。
具體實施例方式本發(fā)明實施例公開了一種胎盤造血干細胞及其制備方法和胎盤造血干細胞注射 齊U。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品及方法已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的產(chǎn)品及方法進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的一種胎盤造血干細胞及其制備方法和胎盤造血干細胞注射劑進行詳細說明。實施例I :本發(fā)明所述制備方法制備胎盤造血干細胞選取肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病檢測陰性且無產(chǎn)科并發(fā)癥的胎盤，術(shù)前經(jīng)得產(chǎn)婦知情同意并簽署知情同意書。術(shù)前準備無菌聚苯乙烯儲液瓶作為運送瓶，內(nèi)裝市售細胞培養(yǎng)液，采集后4°C條件下12小時內(nèi)送到制備處分離制備胎盤造血干細胞。在無菌超凈臺內(nèi)，取l_2ml胎盤采集液做無菌檢測，然后將胎盤包膜除去剪取胎盤組織，將剪碎的胎盤組織放入燒杯中用生理鹽水反復(fù)沖洗1-3次，洗去殘留在胎盤組織表面的血液，然后用手術(shù)剪將胎盤組織剪成l_2mm3大小。將剪碎的胎盤轉(zhuǎn)移到試劑瓶內(nèi)，按胎盤與膠原酶體積比6:1相繼加入質(zhì)量百分比為0. 1%的IV型膠原酶消化液和質(zhì)量百分比為0. 05%的II型膠原酶消化液，擰緊瓶蓋用封口膜封住瓶口，放入37 °C恒溫水浴鍋中消化45min。消化完畢加入100_500ml生理鹽水洗滌、用50-300目篩網(wǎng)過濾，收集第一濾液和第一濾渣，第一濾渣用生理鹽水(每次100-500ml)洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合
并至第一濾液中備用。將第一濾渣收集到試劑瓶內(nèi)，同樣按胎盤與膠原酶體積比6:1的比例相繼加入質(zhì)量百分比為0. 1%的I型膠原酶消化液和質(zhì)量百分比為0. 05%的II型膠原酶消化液，擰緊瓶蓋用封口膜封住瓶口，放入37°C恒溫水浴鍋中消化30min。
消化完畢加入100_500ml生理鹽水洗滌、用50-300目篩網(wǎng)過濾，收集第二濾液和第二濾渣，第二濾渣用生理鹽水(每次100-500ml)洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合
并至第二濾液中。合并第一濾液和第二濾液，以800g離心力離心lOmin，棄去上清，收集細胞(沉淀部分)。將收集的細胞用生理鹽水懸浮，將重懸液加到人淋巴細胞分離液中，650g密度梯度離心15min，收集中間一層的白膜層細胞液。將收集的白膜層細胞液先用400g的離心力離心5min，棄上清重懸沉淀，接著將重懸液用300g的離心力離心lOmin，棄上清后即得胎盤造血干細胞(沉淀部分)。將最后得到的細胞用流式細胞儀檢測其表面標志物⑶34和⑶45，結(jié)果顯示⑶34陽性，⑶45陰性細胞含量為I. 5-1. 8%，表明含有較高量的造血干細胞。實施例2 :細胞數(shù)量和活力的對比用與實施例I相同來源、體積的胎盤分別用現(xiàn)有的研磨法、單一膠原酶法來制備胎盤造血干細胞，其中涉及到重懸、洗滌、離心等步驟的地方均與實施例I中一致，在單一膠原酶法中，所采用的單一膠原酶消化液的量和膠原酶質(zhì)量百分比均與實施例I中對應(yīng)的膠原酶消化液的量和膠原酶質(zhì)量百分比相同，最后對這幾種方法制備出的胎盤造血干細胞的數(shù)量和活力進行檢測，結(jié)果見表I。表I細胞數(shù)量和活力
IV型膠原酶 II型膠原酶 I型膠原酶研磨法實施例I法
法法法
造血干細胞
3.21 X IO6 6.34 X IO6 4.32 x IO6 5.21 乂 IO6 2.50 x IO7
數(shù)量(個)______
造血干細跑
65°/o83%78%80%92%
活力(％) _____由上表可以看出，采用本發(fā)明多種膠原酶聯(lián)合消化法制備的胎盤造血干細胞的數(shù)量均高于其他幾種方法制備的細胞數(shù)量，而且在細胞活力上也比較高。
實施例3 :本發(fā)明所述制備方法制備胎盤造血干細胞選取肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病檢測陰性且無產(chǎn)科并發(fā)癥的胎盤，術(shù)前經(jīng)得產(chǎn)婦知情同意并簽署知情同意書。術(shù)前準備無菌聚苯乙烯儲液瓶作為運送瓶，內(nèi)裝市售細胞培養(yǎng)液，采集后4°C條件下12小時內(nèi)送到制備處分離制備胎盤造血干細胞。在無菌超凈臺內(nèi)，取l_2ml胎盤采集液做無菌檢測，然后將胎盤包膜除去剪取胎盤組織，將剪碎的胎盤組織放入燒杯中用生理鹽水反復(fù)沖洗1-3次，洗去殘留在胎盤組織表面的血液，然后用手術(shù)剪將胎盤組織剪成l_2mm3大小。將剪碎的胎盤轉(zhuǎn)移到試劑瓶內(nèi)，按胎盤與膠原酶體積比10:1相繼加入質(zhì)量百分比為0. 2%的IV型膠原酶消化液和質(zhì)量百分比為0. 1%的II型膠原酶消化液，擰緊瓶蓋用封口膜封住瓶口，放入37 °C恒溫水浴鍋中消化35min。 消化完畢加入100_500ml生理鹽水洗滌、用50-300目篩網(wǎng)過濾，收集第一濾液和第一濾渣，第一濾渣用生理鹽水(每次100-500ml)洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合
并至第一濾液中備用。將第一濾渣收集到試劑瓶內(nèi)，同樣按胎盤與膠原酶體積比10:1的比例相繼加入質(zhì)量百分比為0. 2%的I型膠原酶消化液和質(zhì)量百分比為0. 1%的II型膠原酶消化液，擰緊瓶蓋用封口膜封住瓶口，放入37°C恒溫水浴鍋中消化25min。消化完畢加入100-500ml生理鹽水洗滌、用50-300目篩網(wǎng)過濾，收集第二濾液和第二濾渣，第二濾渣用生理鹽水(每次100-500ml)洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合
并至第二濾液中備用。合并第一濾液和第二濾液，以IOOOg離心力離心lOmin，棄去上清，收集細胞(沉淀部分)。將收集的細胞用生理鹽水懸浮，將重懸液加到人淋巴細胞分離液中，500g密度梯度離心20min，收集中間一層的白膜層細胞液。將收集的白膜層細胞液先用700g的離心力離心lOmin，棄上清重懸沉淀，接著將重懸液用500g的離心力離心5min，棄上清后即得胎盤造血干細胞(沉淀部分)。將最后得到的細胞用流式細胞儀檢測其表面標志物⑶34和⑶45，結(jié)果顯示⑶34陽性，⑶45陰性細胞含量為I. 5-1. 8%，表明含有較高量的造血干細胞。按照實施例2的方法進行對比試驗，檢測結(jié)果顯示，本實施例制備方法制備的胎盤造血干細胞數(shù)量在IO7數(shù)量級，活力高于92%，而其他制備方法的細胞數(shù)量在IO6數(shù)量級，細胞活力低于85%。實施例4 :本發(fā)明所述制備方法制備胎盤造血干細胞選取肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病檢測陰性且無產(chǎn)科并發(fā)癥的胎盤，術(shù)前經(jīng)得產(chǎn)婦知情同意并簽署知情同意書。術(shù)前準備無菌聚苯乙烯儲液瓶作為運送瓶，內(nèi)裝市售細胞培養(yǎng)液，采集后4°C條件下12小時內(nèi)送到制備處分離制備胎盤造血干細胞。在無菌超凈臺內(nèi)，取l_2ml胎盤采集液做無菌檢測，然后將胎盤包膜除去剪取胎盤組織，將剪碎的胎盤組織放入燒杯中用生理鹽水反復(fù)沖洗1-3次，洗去殘留在胎盤組織表面的血液，然后用手術(shù)剪將胎盤組織剪成l_2mm3大小。將剪碎的胎盤轉(zhuǎn)移到試劑瓶內(nèi)，按胎盤與膠原酶體積比3:1相繼加入質(zhì)量百分比為0. 02%的IV型膠原酶消化液和質(zhì)量百分比為0. 01%的II型膠原酶消化液，擰緊瓶蓋用封口膜封住瓶口，放入37 °C恒溫水浴鍋中消化60min。
消化完畢加入100_500ml生理鹽水洗滌、用50-300目篩網(wǎng)過濾，收集第一濾液和第一濾渣，第一濾渣用生理鹽水(每次100-500ml)洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合
并至第一濾液中備用。將第一濾渣收集到試劑瓶內(nèi)，同樣按胎盤與膠原酶體積比3:1的比例相繼加入質(zhì)量百分比為0. 02%的I型膠原酶消化液和質(zhì)量百分比為0. 01%的II型膠原酶消化液，擰緊瓶蓋用封口膜封住瓶口，放入37 °C恒溫水浴鍋中消化40min。消化完畢加入100_500ml生理鹽水洗滌、用50 -300目篩網(wǎng)過濾，收集第二濾液和第二濾渣，第二濾渣用生理鹽水(每次100-500ml)洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合
并至第二濾液中備用。合并第一濾液和第二濾液，以600g離心力離心lOmin，棄去上清，收集細胞(沉淀部分)。將收集的細胞用生理鹽水懸浮，將重懸液加到人淋巴細胞分離液中，600g密度梯度離心18min，收集中間一層的白膜層細胞液。將收集的白膜層細胞液先用600g的離心力離心lOmin，棄上清重懸沉淀，接著將重懸液用400g的離心力離心lOmin，棄上清后即得胎盤造血干細胞(沉淀部分)。將最后得到的細胞用流式細胞儀檢測其表面標志物⑶34和⑶45，結(jié)果顯示⑶34陽性，⑶45陰性細胞含量為I. 5-1. 8%，表明含有較高量的造血干細胞。按照實施例2的方法進行對比試驗，檢測結(jié)果顯示，本實施例制備方法制備的胎盤造血干細胞數(shù)量在IO7數(shù)量級，活力高于92%，而其他制備方法的細胞數(shù)量在IO6數(shù)量級，細胞活力低于85%。實施例5 :本發(fā)明所述制備方法制備胎盤造血干細胞選取肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病檢測陰性且無產(chǎn)科并發(fā)癥的胎盤，術(shù)前經(jīng)得產(chǎn)婦知情同意并簽署知情同意書。術(shù)前準備無菌聚苯乙烯儲液瓶作為運送瓶，內(nèi)裝市售細胞培養(yǎng)液，采集后4°C條件下12小時內(nèi)送到制備處分離制備胎盤造血干細胞。在無菌超凈臺內(nèi)，取l_2ml胎盤采集液做無菌檢測，然后將胎盤包膜除去剪取胎盤組織，將剪碎的胎盤組織放入燒杯中用生理鹽水反復(fù)沖洗1-3次，洗去殘留在胎盤組織表面的血液，然后用手術(shù)剪將胎盤組織剪成l_2mm3大小。將剪碎的胎盤轉(zhuǎn)移到試劑瓶內(nèi)，按胎盤與膠原酶體積比7:1相繼加入質(zhì)量百分比為0. 15%的IV型膠原酶消化液和質(zhì)量百分比為0. 07%的II型膠原酶消化液，擰緊瓶蓋用封口膜封住瓶口，放入37 °C恒溫水浴鍋中消化40min。消化完畢加入100-500ml生理鹽水洗滌、用50-300目篩網(wǎng)過濾，收集第一濾液和第一濾渣，第一濾渣用生理鹽水(每次100-500ml)洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合
并至第一濾液中備用。將第一濾渣收集到試劑瓶內(nèi)，同樣按胎盤與膠原酶體積比7:1的比例相繼加入質(zhì)量百分比為0. 15%的I型膠原酶消化液和質(zhì)量百分比為0. 07%的II型膠原酶消化液，擰緊瓶蓋用封口膜封住瓶口，放入37°C恒溫水浴鍋中消化30min。消化完畢加入100-500ml生理鹽水洗滌、用50-300目篩網(wǎng)過濾，收集第二濾液和第二濾渣，第二濾渣用生理鹽水(每次100-500ml)洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合
并至第二濾液中備用。合并第一濾液和第二濾液，以500g離心力離心lOmin，棄去上清，收集細胞(沉淀部分)。將收集的細胞用生理鹽水懸浮，將重懸液加到人淋巴細胞分離液中，700g密度梯度離心14min，收集中間一層的白膜層細胞液。將收集的白膜層細胞液先用550g的離心力離心lOmin，棄上清重懸沉淀，接著將重懸液用400g的離心力離心lOmin，棄上清后即得胎盤造血干細胞(沉淀部分)。將最后得到的細胞用流式細胞儀檢測其表面標志物⑶34和⑶45，結(jié)果顯示⑶34陽性，⑶45陰性細胞含量為I. 5-1. 8%，表明含有較高量的造血干細胞。按照實施例2的方法進行對比試驗，檢測結(jié)果顯示，本實施例制備方法制備的胎盤造血干細胞數(shù)量在IO7數(shù)量級，活力高于92%，而其他制備方法的細胞數(shù)量在IO6數(shù)量級，細胞活力低于85%。實施例6 :本發(fā)明所述制備方法制備胎盤造血干細胞
選取肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病檢測陰性且無產(chǎn)科并發(fā)癥的胎盤，術(shù)前經(jīng)得產(chǎn)婦知情同意并簽署知情同意書。術(shù)前準備無菌聚苯乙烯儲液瓶作為運送瓶，內(nèi)裝市售細胞培養(yǎng)液，采集后4°C條件下12小時內(nèi)送到制備處分離制備胎盤造血干細胞。在無菌超凈臺內(nèi)，取l_2ml胎盤采集液做無菌檢測，然后將胎盤包膜除去剪取胎盤組織，將剪碎的胎盤組織放入燒杯中用生理鹽水反復(fù)沖洗1-3次，洗去殘留在胎盤組織表面的血液，然后用手術(shù)剪將胎盤組織剪成l_2mm3大小。將剪碎的胎盤轉(zhuǎn)移到試劑瓶內(nèi)，按胎盤與膠原酶體積比4:1相繼加入質(zhì)量百分比為0. 06%的IV型膠原酶消化液和質(zhì)量百分比為0. 03%的II型膠原酶消化液，擰緊瓶蓋用封口膜封住瓶口，放入37 °C恒溫水浴鍋中消化50min。消化完畢加入100_500ml生理鹽水洗滌、用50-300目篩網(wǎng)過濾，收集第一濾液和第一濾渣，第一濾渣用生理鹽水(每次100-500ml)洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合
并至第一濾液中備用。將第一濾渣收集到試劑瓶內(nèi)，同樣按胎盤與膠原酶體積比4:1的比例相繼加入質(zhì)量百分比為0. 06%的I型膠原酶消化液和質(zhì)量百分比為0. 03%的II型膠原酶消化液，擰緊瓶蓋用封口膜封住瓶口，放入37°C恒溫水浴鍋中消化35min。消化完畢加入100_500ml生理鹽水洗滌、用50-300目篩網(wǎng)過濾，收集第二濾液和第二濾渣，第二濾渣用生理鹽水(每次100-500ml)洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合
并至第二濾液中備用。合并第一濾液和第二濾液，以750g離心力離心lOmin，棄去上清，收集細胞(沉淀部分)。將收集的細胞用生理鹽水懸浮，將重懸液加到人淋巴細胞分離液中，800g密度梯度離心lOmin，收集中間一層的白膜層細胞液。將收集的白膜層細胞液先用500g的離心力離心lOmin，棄上清重懸沉淀，接著將重懸液用300g的離心力離心lOmin，棄上清后即得胎盤造血干細胞(沉淀部分)。將最后得到的細胞用流式細胞儀檢測其表面標志物⑶34和⑶45，結(jié)果顯示⑶34陽性，⑶45陰性細胞含量為I. 5-1. 8%，表明含有較高量的造血干細胞。按照實施例2的方法進行對比試驗，檢測結(jié)果顯示，本實施例制備方法制備的胎盤造血干細胞數(shù)量在IO7數(shù)量級，活力高于92%，而其他制備方法的細胞數(shù)量在IO6數(shù)量級，細胞活力低于85%。實施例7 :胎盤造血干細胞注射劑的制備
用含20% (質(zhì)量百分比)人血白蛋白的生理鹽水懸浮實施例I制備的造血干細胞，調(diào)整細胞數(shù)為4 X IO7個/mL分裝到細胞保存袋內(nèi)，制成胎盤造血干細胞注射劑。實施例8 :胎盤造血干細胞注射劑的制備用含30% (質(zhì)量百分比)人血白蛋白的生理鹽水懸浮實施例4制備的造血干細胞，調(diào)整細胞數(shù)為2 X IO7個/mL分裝到細胞保存袋內(nèi)，制成胎盤造血干細胞注射劑。實施例9 :胎盤造血干細胞注射劑的制備用含10% (質(zhì)量百分比)人血白蛋白的生理鹽水懸浮實施例6制備的造血干細胞，調(diào)整細胞數(shù)為3 X IO7個/mL分裝到細胞保存袋內(nèi)，制成胎盤造血干細胞注射劑。
以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種胎盤造血干細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟I、將胎盤預(yù)處理后，用IV型膠原酶消化液和II型膠原酶消化液消化，然后洗滌、過濾，分別收集第一濾液和第一濾渣，所述IV型膠原酶消化液中IV型膠原酶質(zhì)量百分比為0.02-0. 2%，所述II型膠原酶消化液中II型膠原酶質(zhì)量百分比為0. 01-0. 1% ； 步驟2、將所述第一濾渣用I型膠原酶消化液和步驟I所述II型膠原酶消化液消化，然后洗滌、過濾，分別收集第二濾液和第二濾渣，所述I型膠原酶消化液中I型膠原酶質(zhì)量百分比為 0. 02-0. 2% ； 步驟3、合并第一濾液和第二濾液并離心，棄上清后重懸沉淀，將得到的重懸液加至人淋巴細胞分離液中，然后密度梯度離心，收集中間一層的白膜層細胞液并離心，棄上清后即得胎盤造血干細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備方法，其特征在于，所述胎盤與IV型膠原酶消化液的體積比為6:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備方法，其特征在于，所述胎盤與II型膠原酶消化液的體積比為6:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備方法，其特征在于，所述胎盤與I型膠原酶消化液的體積比為6:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備方法，其特征在于，在步驟I之后、步驟2之前還包括以下步驟 將所述第一濾渣洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合并至所述第一濾液。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備方法，其特征在于，在步驟2之后、步驟3之前還包括以下步驟 將所述第二濾渣洗滌1-3次，收集每次洗滌后的沖洗液合并至所述第二濾液。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備方法，其特征在于，所述白膜層細胞液的離心具體為 將所述白膜層細胞液先用400-700g的離心力離心5-10min，棄上清重懸沉淀，接著將重懸液用300_500g的離心力離心5-10min。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述制備方法，其特征在于，步驟I和步驟2所述消化為在37°C恒溫條件下消化20-60min。
9.權(quán)利要求1-8任意一項所述制備方法制備的胎盤造血干細胞。
10.一種胎盤造血干細胞注射劑，其特征在于，由權(quán)利要求9所述胎盤造血干細胞和含質(zhì)量百分比為10-30%人血白蛋白的生理鹽水組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種胎盤造血干細胞及其制備方法和胎盤造血干細胞注射劑。該制備方法將胎盤預(yù)處理后，用Ⅳ型膠原酶消化液和Ⅱ型膠原酶消化液消化，然后洗滌、過濾，分別收集第一濾液和第一濾渣；將所述第一濾渣用Ⅰ型膠原酶消化液和步驟1所述Ⅱ型膠原酶消化液消化，然后洗滌、過濾，收集第二濾液；合并兩次濾液并離心，棄上清后重懸沉淀，將重懸液加至人淋巴細胞分離液中，然后密度梯度離心，收集中間一層的白膜層細胞液并離心，棄上清后即得胎盤造血干細胞。本發(fā)明采用Ⅳ型膠原酶和Ⅱ型膠原酶聯(lián)合、Ⅰ型膠原酶和Ⅱ型膠原酶聯(lián)合，利用不同膠原酶的特性充分消化胎盤制備造血干細胞，提高了所制備的造血干細胞的數(shù)量和活力。
文檔編號A61K35/50GK102660499SQ20121016240
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月23日
發(fā)明者呂康濤, 李春波 申請人:鄭州賽英科干細胞技術(shù)有限公司