專利名稱：一種蒲公英均一多糖及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及ー種蒲公英均一多糖及其制備方法和用途，屬于中藥技術領域。
背景技術：
蒲公英(Herba Taraxaci )是菊科多年生草本,別名黃花地丁,黃花三七。具有清熱解毒，消腫散結，利尿通淋，用于疔瘡腫毒，乳癰，瘰疬，目赤，咽痛，肺癰，腸癰，濕熱黃疸，熱淋澀痛。現代藥理研究表明，蒲公英具有利膽保肝，抗內毒素，抗癌，降血糖，抗凝血，利尿，健脾胃，益生元，廣譜抑菌和免疫促進等作用。蒲公英作為藥用植物在國內外研究已有很久的歷史，蒲公英有豐富的營養價值， 含有蛋白質、脂肪、碳水化合物及維生素等。(許丹等，蒲公英的化學研究，中國中藥雜志，2004，29 (3) : 229-230)。迄今為止，已見報道的蒲公英化學成分主要有黃酮類、三萜類、植物甾醇類、香豆素類、長鏈脂肪族類、倍半萜內酯類、色素類、揮發油、膽堿、こ酰酯類、酚酸類、綠原酸、咖啡酸、有機酸、氨基酸以及礦物質等(袁瑾等，野生植物蒲公英營養成分的研究，氨基酸和生物資源，2006，28 (2) : 22-23)，具體如蒲公英留醇(Taraxasterol)、膽堿(Choline)、菊糖(Inulin)、果膠(Pectin);蒲公英醇(Taraxol)、豆甾醇(Stigmasterol)、β-香樹脂醇(β-Amyrin)、β-谷甾醇(β-Sitosterol)、蒲公英賽醇(taraxerol)、蒲公英素(Taraxacerin)、蒲公英苦素(Taraxacin)和維生素A、B、C等。補體系統是人體重要的免疫防御系統之一。補體系統的正常激活在消滅外來微生物、清除肌體內損傷或死亡的細胞和組織以及維持機體的平衡等生理過程中起著重要作用。然而該系統的非正常激活會引起人體免疫系統的過度反應，導致人體自身正常組織的損傷和炎癥反應，是炎癥反應的重要介質。研究表明，與補體過度激活相關的疾病涉及類風濕性關節炎、老年性癡呆、急性呼吸窘迫綜合征以及系統性紅斑狼瘡等多種疾病。有報道，重癥非典型肺炎(SARS)和由H5N1型病毒感染引起的禽流感，臨床上可發現免疫系統的過度反應癥狀，如ARDS，敗血癥休克及Reyes綜合征等，上述反應癥狀被人與細胞免疫、體液免疫過度激活有夫。鑒于補體過度激活在引發人類許多危重疾病中的重要作用，因此，對補體系統激活的抑制性治療具有十分重要的臨床意義。天然藥物中廣泛存在具有抗補體作用的活性成分，國內外已完成部分天然藥物如麻黃、人參、杜仲等的篩選，發現自然界中廣泛存在的某些多糖、蛋白質、多肽、留類、萜類和生物堿等化學物具有顯著的抗補體活性，其中以糖基化蛋白和多聚糖化合物為多。肝素是有糖醛酸和氨基葡萄糖聚合而成的ー個硫酸化多糖，是研究較早、較成熟的補體抑制齊U。但由于肝素具有抗凝血作用，在生物體內需較高濃度才能發揮藥效，且副作用大，限制了其臨床用途。申請號為200710046222. 7的中國專利文獻公開了ー種具有抗補體活性的植物多糖，采用五種多糖的雜多糖，由魚腥草、野菊花、茵陳、佩蘭和草果制備，作用于補體Clq, Clr, Cls, C2、C3、C4、C5、C9組分，且不具有抗凝血作用。申請號為200710044099. 5的中國專利文獻公開了ー種自杜仲提取的木制素在制備抗補體藥物的用途。申請號為200910201362.6的中國專利文獻公開了ー種自苦參提取的黃酮類在制備抗補體藥物的用途，所得的黃酮類化合物對補體系統的經典途徑和旁路途徑均有較強的抑制作用。但至今未見蒲公英及其多糖的抗補體活性的相關研究報道。

發明內容
針對現有技術存在的上述問題，本發明的目的是提供ー種蒲公英均一多糖及其制備方法和用途，以拓寬蒲公英多糖的應用。為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下ー種蒲公英均一多糖，由蒲公英全草經水提醇沉、透析截取分子量大于10000道爾頓的組分，然后經陰離子交換柱層析分離，再經葡聚糖凝膠層析柱純化而得；所述均一多糖的分子量為I. 6X IO4道爾頓，其單糖組成為D-阿拉伯糖占25. 4wt%、D-葡萄糖占 17. 7wt%、D-半乳糖占44. 5wt%、D-木糖占4. lwt%、D-鼠李糖占3wt%、D_甘露糖占5. 3wt%。一種所述蒲公英均一多糖的制備方法，包括如下步驟a)首先將蒲公英全草用こ醇回流脫脂，然后過濾，揮干藥渣中的こ醇；加水浸泡、煎煮提取；合并提取液，濃縮，離心，收集上清液；加入こ醇進行沉析；離心得沉淀，并揮干其中的こ醇；用水溶解沉淀，所得溶液用截留分子量為10000道爾頓的透析袋在水中透析24 72小時；濃縮透析液，冷凍干燥，得蒲公英多糖提取物粗品；b)將上述蒲公英多糖提取物粗品加水溶解，離心；將沉淀再加水加熱溶解，離心；合并兩次離心所得上清液，上樣于ニこ胺基こ基(DEAE)陰離子交換柱，依次用蒸餾水、O. 2、
O.5,0. 8、I. Omol/L的NaCl溶液洗脫，收集由I. Omol/L的NaCl溶液洗脫的洗脫液；減壓濃縮，然后用截留分子量為3500道爾頓的透析袋進行流水透析24小時；上樣于凝膠層析柱，以O. 2mol/L的NaCl溶液為洗脫液，流速I. lmL/min，示差折光檢測，蛋白純化系統在線成像，根據凝膠分離圖譜收集均一多糖，再用截留分子量為3500道爾頓的透析袋進行去離子水透析48小時，濃縮透析液，冷凍干燥，即得所述的蒲公英均一多糖。作為進ー步優選方案，所述回流脫脂的操作如下向蒲公英全草中加入體積百分含量為95%的こ醇，加入的こ醇體積為蒲公英全草質量的2 4倍；然后進行回流I 3小時。作為進ー步優選方案，所述提取的操作如下向藥渣中加入去離子水，于室溫浸泡I 3小時，然后加熱煮沸進行煎煮2 4小時，過濾，對所得藥渣再重復上述操作I 3次；每次加水體積為藥渣質量的8 10倍。作為進ー步優選方案，將提取液濃縮到在60 80°C的相對密度為I. O I. 5。作為進ー步優選方案，所述沉析的操作如下在不斷攪拌下向上清液中加入體積百分含量為95%的こ醇，こ醇的加入體積為上清液體積的2 4倍；加畢，在O 5°C靜置12 24小時。本發明所述的蒲公英均一多糖的ー種用途，是以所述蒲公英均一多糖作為抗補體活性成分用于制備保健食品或藥物制劑。本發明所述的蒲公英多糖提取物的另ー種用途，是以所述蒲公英均一多糖作為抗氧化活性成分用于制備保健食品或藥物制劑。所述的藥物制劑可以是任何一種適合于臨床使用的劑型，包括固體制劑(如膠囊、片劑、顆粒劑等)、半固體制劑(如軟膏等)、液體制劑(如□服液、混懸劑、乳劑等)、注射劑等。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果藥效學實驗表明本發明所提供的蒲公英均一多糖經典途徑抗補體活性的CP5tl值是O. 0126mg/mL，與陽性藥肝素O. 0206mg/mL相比，表現出非常好的抗補體活性；旁路途徑抗補體活性的AP5tl值是O. 05885mg/mL，與陽性藥肝素O. 0887mg/mL相比也表現出非常好的抗補體活性；其抗補體活性靶點為Clq、Clr、Cls、C2、C3、C4和C5 ;另外，本發明所提供的蒲公英均一多糖對DPPH自由基有效清除率高達63%。因此，本發明所述的蒲公英均一多糖可望作為抗補體活性成分或/和抗氧化活性成分用于制備保健食品或藥物制劑，使用安全，無副作用之憂，且制備エ藝簡單，質量穩定，適于規模化生產，具有廣闊的應用前景和市場價值。


圖I為本發明中所述的蒲公英均一多糖的凝膠分離圖；圖2為本發明實施例I制得的蒲公英均一多糖的HPLC-GPC液相圖譜；圖3為本發明實施例I制得的蒲公英均一多糖的GC-MS圖；圖4為本發明實施例I制得的蒲公英均一多糖進行甲基化后的GC-MS圖；圖5為本發明實施例I制得的蒲公英均一多糖的經典途徑溶血活性曲線圖；圖6為本發明實施例I制得的蒲公英均一多糖的旁路途徑溶血活性曲線圖；圖7為本發明實施例I制得的蒲公英均一多糖的抗補體活性靶點分析結果圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進ー步詳細、完整地說明。實施例I取蒲公英全草置于提取器內，加入體積百分含量為95%的こ醇，加入的こ醇體積為蒲公英全草質量的2倍；進行回流脫脂2小時，過濾，揮干藥渣中的こ醇；向藥渣中加入去離子水，于室溫浸泡3小時，然后加熱煮沸進行煎煮4小吋，過濾，對所得藥渣再重復上述操作3次；每次加水體積為藥渣質量的10倍；合并提取液，將提取液濃縮到在80°C的相對密度為I. 2，離心，收集上清液；在不斷攪拌下向上清液中加入體積百分含量為95%的こ醇，こ醇的加入體積為上清液體積的4倍；加畢，置入4°C冰箱靜置12小時；離心得沉淀，并揮干其中的こ醇；用水溶解沉淀，所得溶液用截留分子量為10000道爾頓的透析袋在水中透析72小吋，以除去其中的小分子多糖、蛋白、こ醇及鹽和ー些水溶性雜質；濃縮透析液，冷凍干燥，得蒲公英多糖提取物粗品，得率約為全草質量的7. 13%。將上述蒲公英多糖提取物粗品加水溶解，于8500rpm離心IOmin ;將沉淀再加水加熱溶解，再次于8500rpm離心IOmin ;合并兩次離心所得上清液,上樣于ニこ胺基こ基(DEAE)陰離子交換柱，依次用蒸餾水、O. 2,0. 5,0. 8、I. Omol/L的NaCl溶液洗脫，收集由
I.Omol/L的NaCl溶液洗脫的洗脫液；減壓濃縮，然后用截留分子量為3500道爾頓的透析袋進行流水透析24小時；進ー步用凝膠層析柱superdex-200 (60cm, 26mm)分離純化，以O. 2mol/L的NaCl溶液為洗脫液，流速I. lmL/min, shodex示差折光檢測，蛋白純化系統Versatiler system在線成像，根據凝膠分離圖譜(見圖I所示)收集均一多糖，用截留分子量為3500道爾頓的透析袋進行去離子水透析48小時，濃縮透析液，冷凍干燥，即得所述的、蒲公英均一多糖，得率約為蒲公英多糖提取物粗品質量的5. 32%。一、進行純度和分子量檢測以高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)檢測，流動相為純水或者O. 2mol/L NaCl溶液，流速為O. 8mL/min,柱溫為40°C，檢測器為示差檢測器，色譜柱為Shodex KS-805和KS-804串聯。以不同分子量的葡聚糖標準品制作標準曲線，然后根據樣品的洗脫時間與標準曲線對照，用Agilent GPC軟件計算其分子量。圖2為所獲得的蒲公英均一多糖的HPLC液相圖譜，可見為單一對稱峰(以O. 2mol/L NaCl溶液為流動相)，表明其為均一多糖；Agilent GPC軟件測得所得均一多糖的分子量為I. 6X IO4道爾頓(以葡聚糖標準品為參考標準)。
ニ、單糖組成檢測I)儀器和試劑Thermo fisher DSQ 氣相色譜儀，(305mX0. 32mmX0. 5 μ m)色譜柱。こ醇、こ腈、氯仿、こ酸酐、無水硫酸鈉、三氯こ酸、三氟こ酸、4-甲基嗎啡硼烷均為分析純。2)對照品D-鼠李糖、L-巖操糖、D-木糖、D-阿拉伯糖，D-甘露糖、D-匍萄糖、D-半乳糖、對照品(sigma公司)。3)對照品溶液的制備用還原水解法進行糖組成分析精密稱定各單糖對照品I. Omg置于長試管中，カロ入新鮮配制的濃度為80mg/mL的4-甲基嗎啡啉硼燒水溶液50 μ L和3mol/L的三氟こ酸水溶液200 μ L，混勻后于80°C加入熱5分鐘；待溶液冷卻后再加入50 μ L 4-甲基嗎啡啉硼烷水溶液，120°C加熱I小時；待溶液冷卻后再加入100 μ L 4-甲基嗎啡啉硼烷水溶液，50°C蒸干，再加入3mLこ腈蒸干3次；然后加入醋酐和三氟こ酸各100 μ L，于50°C水浴中こ酰化10分鐘，加入蒸餾水2mL和氯仿2mL萃取，再用水洗三次，過無水硫酸鈉柱，進行GC-MS分析。4)供試品溶液的制備用還原水解法進行單糖組成分析精密稱定所得均一多糖I. Omg置于長試管中，加入新鮮配制的濃度為80mg/mL的4-甲基嗎啡啉硼烷水溶液50 μ L和3mol/L的三氟こ酸水溶液200 μ L，混勻后于80°C加熱5分鐘；待溶液冷卻后再加入50 μ L 4-甲基嗎啡啉硼烷水溶液，120°C加熱I小時；待溶液冷卻后再加入100 μ L 4-甲基嗎啡啉硼烷水溶液，50°C蒸干，再加入3mLこ腈蒸干3次；然后加入醋酐和三氟こ酸各100 μ L，于50°C水浴中こ酰化10分鐘，加入蒸餾水2mL和氯仿2mL萃取，再用水洗三次，過無水硫酸鈉柱，進行GC-MS分析。5)氣相色譜條件GC-MS 分析條件為TR-5MS (Thermo)色譜柱(60mX0. 25mmX0. 25 μ m);程序升溫條件為從140°C柱溫開始，以2°C /min升溫至198°C,保溫4min,再以4°C /min升溫至214°C，然后以1°C /min升溫至217°C，保持4min，最后以3°C /min升溫至250°C，保持5min ；進樣ロ溫度為250°C ;載氣為He，流速為lmL/min。6)測定采用氣相色譜法分別測定各對照品與供樣試品溶液，得到的供樣試品圖譜與標準單糖的圖譜對照。通過保留時間的比較可知，所述均一多糖的單糖組成主要為D-阿拉伯糖和D-葡萄糖、D-半乳糖，此外含有少許D-木糖，D-鼠李糖，D-甘露糖。圖3為所述的蒲公英均一多糖的GC-MS圖，通過面積歸ー化法可知D_阿拉伯糖占25. 4wt%、D-葡萄糖占17. 7wt%、D-半乳糖占44. 5wt%、D-木糖占4. lwt%、D-鼠李糖占3wt%、D-甘露糖占 5. lwt%三、甲基化分析I)甲基化反應取所得均一多糖20mg放于25mL三角瓶中，在放有五氧化ニ磷的干燥器中干燥過夜，加入2mL ニ甲基亞砜(DMSO)攪拌溶解lOmin，如樣品不溶于DMS0，可在40KHz超聲頻率下超聲lOmin，再加入研成粉末的NaOH 200mg，超聲10min(40KHz)，25°C室溫攪拌反應I小時；逐滴加入CH3I I. 5mL,加完后放在暗處攬祥反應I小時；最后加入2mL蒸懼水分解殘留的CH3I,攪拌反應lOmin,用蒸懼水洗至60mL分液漏斗中，用氯仿萃取三次,合并萃取液,用蒸餾水洗三次，分出氯仿層，低溫旋干，然后干燥，重復上述甲基化反應3次，得到完全甲基化的均一多糖樣品。2)試樣品準備取完全甲基化的均一多糖樣品2mg,加入3mL 2mol/L的三氟こ酸水溶液中溶解，轉入IOmL安瓿瓶中，封ロ，121°C烘箱中水解反應2小時，取出，減壓蒸干，再加入甲醇蒸干三次，重復操作以完全除盡TFA ;水解后殘余物加入IOOmg NaBH4和2mL水，室溫還原反應過夜；加入冰醋酸反應以除去過量的NaBH4，于旋轉蒸發儀上濃縮至粘稠液體，加入甲醇-冰醋酸(體積比5:1) 3 5mL，蒸干三次，再加入甲醇蒸干兩次，得白色粉末，放入烘箱1050C 15min以除去水分，加入3mLこ酸酐，于101°C烘箱中こ酰化反應I小時，取出，多次加入甲苯50°C水浴減壓共沸蒸干至粉末狀；加入適量水溶解，加入氯仿萃取三次，合并氯仿層，用水洗滌三次，分出氯仿層，用無水硫酸鈉干燥、濃縮后進行GC-MS分析。3)色譜條件GC-MS 分析條件為TR-5MS (Thermo)色譜柱(60mX0. 25mmX0. 25 μ m);程序升溫條件為從140°C柱溫開始，以2°C /min升溫至180°C，再以1°C /min升溫至200°C，最后以30C /min升溫至250°C，保持5min ;進樣ロ溫度為250°C;載氣為He，流速為lmL/min。具體GC-MS圖譜見圖4所示。4)分析結果具體分析結果見表I所示。表I所述均一多糖的甲基化分析結果
連接方式甲基化的糖殘基摩爾比tR/min
I-Rha2，3，4-Me3-Rhap5.2121. 5
I-Ara2，3，5-Me3-Araf2.0418. 51
I，5-Ara2，3-Me2-Araf3. 4119. 權利要求
1.ー種蒲公英均一多糖，其特征在干由蒲公英全草經水提醇沉、透析截取分子量大于10000道爾頓的組分，然后經陰離子交換柱層析分離，再經葡聚糖凝膠層析柱純化而得；所述均一多糖的分子量為I. 6 X IO4道爾頓，其單糖組成為D-阿拉伯糖占25. 4wt%、D-葡萄糖占17. 7wt%、D-半乳糖占44. 5wt%、D-木糖占4. lwt%、D-鼠李糖占3wt%、D-甘露糖占5.3wt%0
2.—種權利要求I所述的蒲公英均一多糖的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 a)首先將蒲公英全草用こ醇回流脫脂，然后過濾，揮干藥渣中的こ醇；加水浸泡、煎煮提取；合并提取液，濃縮，離心，收集上清液；加入こ醇進行沉析；離心得沉淀，并揮干其中的こ醇；用水溶解沉淀，所得溶液用截留分子量為10000道爾頓的透析袋在水中透析24 72小時；濃縮透析液，冷凍干燥，得蒲公英多糖提取物粗品； b)將上述蒲公英多糖提取物粗品加水溶解，離心；將沉淀再加水加熱溶解，離心；合并兩次離心所得上清液，上樣于ニこ胺基こ基(DEAE)陰離子交換柱，依次用蒸餾水、O. 2,0. 5、O. 8、I. Omol/L的NaCl溶液洗脫，收集由I. Omol/L的NaCl溶液洗脫的洗脫液；減壓濃縮，然后用截留分子量為3500道爾頓的透析袋進行流水透析24小時；上樣于凝膠層析柱，以O.2mol/L的NaCl溶液為洗脫液，流速I. lmL/min，示差折光檢測，蛋白純化系統在線成像，根據凝膠分離圖譜收集均一多糖，再用截留分子量為3500道爾頓的透析袋進行去離子水透析48小時，濃縮透析液，冷凍干燥，即得所述的蒲公英均一多糖。
3.根據權利要求2所述的蒲公英均一多糖的制備方法，其特征在干，所述回流脫脂的操作如下向蒲公英全草中加入體積百分含量為95%的こ醇，加入的こ醇體積為蒲公英全草質量的2 4倍；然后進行回流I 3小時。
4.根據權利要求2所述的蒲公英均一多糖的制備方法，其特征在于，所述提取的操作如下向藥洛中加入去離子水，于室溫浸泡I 3小時,然后加熱煮沸進行煎煮2 4小時，過濾，對所得藥渣再重復上述操作I 3次；每次加水體積為藥渣質量的8 10倍。
5.根據權利要求2所述的蒲公英多糖提取物的制備方法，其特征在于將提取液濃縮到在60 80°C的相對密度為I. O I. 5。
6.根據權利要求2所述的蒲公英均一多糖的制備方法，其特征在干，所述沉析的操作如下在不斷攪拌下向上清液中加入體積百分含量為95%的こ醇，こ醇的加入體積為上清液體積的2 4倍；加畢，在O 5°C靜置12 24小吋。
7.—種權利要求I所述的蒲公英均一多糖的用途，其特征在于以所述蒲公英均一多糖作為抗補體活性成分用于制備保健食品或藥物制劑。
8.—種權利要求I所述的蒲公英均一多糖的用途，其特征在干以所述蒲公英均一多糖作為抗氧化活性成分用于制備保健食品或藥物制劑。
全文摘要
本發明公開了一種蒲公英均一多糖及其制備方法和用途。所述均一多糖是由蒲公英全草經水提醇沉、透析截取分子量大于10000道爾頓的組分，然后經陰離子交換柱層析分離，再經葡聚糖凝膠層析柱純化而得；所述均一多糖的分子量為1.6×104道爾頓，其單糖組成主要為阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和少許木糖、鼠李糖、甘露糖。藥效學實驗表明本發明所提供的蒲公英均一多糖經典途徑抗補體活性的CP50值是0.0126mg/mL，旁路途徑抗補體活性的AP50值是0.05885mg/mL，對DPPH自由基有效清除率高達63%；可望作為抗補體活性成分或/和抗氧化活性成分用于制備保健食品或藥物制劑，具有廣闊的應用前景和市場價值。
文檔編號A61P37/06GK102653568SQ20121016925
公開日2012年9月5日 申請日期2012年5月28日 優先權日2012年5月28日
發明者劉飛, 施松善, 王宏偉, 王崢濤, 王順春, 胡之璧, 范洪偉, 鮑斌 申請人:上海中醫藥大學