人臍帶間充質干細胞聯合腸促胰素為改善糖尿病胰島β細胞的功能提供了一種新方法
【專利摘要】人臍帶間充質干細胞聯合腸促胰素為改善糖尿病胰島β細胞的功能提供了一種新方法，內容包括：在應用人臍帶間充質干細胞治療1型及2型糖尿病的基礎上，聯合腸促胰素(GLP-1受體激動劑及DPP-4抑制劑)。本方法在促進胰島β細胞增生及再生，改善胰島β細胞功能，降低血糖及糖化血紅蛋白的同時，還會減輕胰島α增生，抑制胰高血糖素的分泌，從而起到協同作用。
【專利說明】人臍帶間充質干細胞聯合腸促胰素為改善糖尿病胰島β細胞的功能提供了一種新方法【技術領域】
[0001]本發明涉及一種治療糖尿病的方法，特別是涉及促進胰島β細胞增生，改善胰島功能，并能減少胰島α細胞增生，抑制胰高糖素分泌的方法。
【背景技術】
[0002]糖尿病是由遺傳和環境因素共同引起的一組以糖代謝紊亂為主要表現的臨床綜合征。全世界的糖尿病患病率迅速增加，發展中國家尤為明顯，糖尿病已成為臨床上的主要內分泌代謝病。糖尿病以I型和2型為主，特殊類型及妊娠糖尿病所占比例很小。I型糖尿病以免疫介導引起的胰島β細胞減少為主，2型糖尿病隨病情進展胰島β細胞數量逐漸減少。目前糖尿病治療以飲食調節、增加運動、口服降糖藥、注射胰島素或腸促胰素等方法為主。近年來，干細胞對糖尿病治療作用倍受關注，并在基礎及臨床上開展了一些研究。但是，干細胞在治療糖尿病的同時，有引起胰島α細胞增生，增加胰高血糖素分泌的可能。

【發明內容】

[0003]本發明的目的在于提供一種改善糖尿病胰島β細胞功能的新方法。
[0004]本發明所述的方法在促進胰島β細胞增生及再生，改善胰島β細胞功能，降低血糖及糖化血紅蛋白的同時，還會減輕胰島α增生，抑制胰高血糖素的分泌，從而起到協同作用，更好的治療糖尿病。
[0005]本發明所述的方法中人臍帶間充質干細胞采取靜脈或介入輸注的方式移植到體內，其中靜脈輸注的細胞數量為3X107，介入輸注，細胞數量:1.5X107，一個療程輸注兩次，間隔時間為I月。GLP-1受體激動劑采取皮下注射，DPP-4抑制劑采取口服的方法，劑量參考藥品說明書。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0006]圖1是各組2型糖尿病大鼠胰島HE染色、α、β細胞免疫組化圖片。
[0007]圖2是10周治療期間各組大鼠空腹血糖(FPG)變化。
[0008]圖3是10周時各組大鼠糖化血紅蛋白(GHbAlc)。
[0009]圖4是10周時各組大鼠C肽曲線下面積(C-p印tide AUC)。
[0010]圖5是10周時正常對照組、糖尿病對照組及人臍帶間充質干細胞組大鼠心肝腎HE染色圖片。
[0011]圖6是臨床研究中干細胞治療組C肽水平變化。
[0012]圖7是臨床研究中對照組C肽水平變化。
[0013]圖8是人臍帶間充質干細胞流式鑒定圖。
[0014]圖9是第3代臍帶間充質干細胞生長曲線。
[0015]圖10是各組hUCMSCs對PHA作用下T淋巴細胞增殖的影響。[0016]圖11是人臍帶間充質干細胞和單個核細胞混合培養(X200倍):①組I (對照組)②組II (低濃度組)③組III (高濃度組)④組IV(聯合組)。
[0017]圖12是流式細胞儀鑒定各組⑶4+、⑶8+T細胞的表達:圖12-1:組1(對照組)CD4+、CD8+T細胞；圖12-2:組11(低濃度組)CD4+、CD8+T細胞；圖12-3:組III (高濃度組)CD4+、CD8+T 細胞；圖 12-4:組 IV (聯合組)CD4+、CD8+T 細胞。
[0018]圖13是流式細胞儀鑒定各組⑶4+⑶25+T細胞的表達:圖13_1:組1(對照組)CD4+CD25+T細胞；圖13-2:組II (低濃度組)CD4+CD25+T細胞；圖13-3:組III (高濃度組)CD4+CD25+T 細胞；圖 13-4:組 IV (聯合組)CD4+CD25+T 細胞。
【具體實施方式】
[0019]本發明的技術方案是基于糖尿病的發病機制及干細胞、腸促胰素(GLP-1受體激動劑及DPP-4抑制劑)治療糖尿病的機理，從而提出了通過二者的聯合應用，改善胰島β細胞功能，降低血糖的同時，還能減少胰島α細胞增生，抑制胰高糖素的分泌。
[0020]本發明所述的方法中人臍帶間充質干細胞采取靜脈或介入輸注的方式移植到體內，其中靜脈輸注的細胞數量為3Χ107，介入輸注，細胞數量:1.5X107，一個療程輸注兩次，間隔時間為I月。GLP-1受體激動劑采取皮下注射，DPP-4抑制劑采取口服的方法，劑量參考藥品說明書。
[0021]為了更好的闡述本發明的試紙，下面將本發明的動物實驗、臨床研究、細胞研究來說明人臍帶間充質干細胞、以及聯合腸促胰素(GLP-1受體激動劑及DPP-4抑制劑)改善糖尿病胰島β細胞功能的作用。
[0022]一、本發明的動物研究
[0023]I實驗藥物
[0024]磷酸西格列汀由中國默沙東制藥有限公司提供；高糖高脂飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司；鏈脲佐菌素購自西安沃爾森生物技術有限公司；hUCMSCs由青島大學醫學院附屬醫院中美干細胞中心提供。
[0025]2實驗動物
[0026]8周齡的健康雄性SPF級Wistar大鼠60只，體質量200土20g，實驗動物均購自山東魯抗醫藥股份有限公司，質量合格證號:SCXK(魯)20080002。飼養于青島大學醫學院附屬醫院動物實驗中心，清潔級飼養，整個飼養過程中保持溫度18-22°C，濕度40% -60%，人工光照，明暗各12h/d，自由攝食、攝水。
[0027]3實驗方法
[0028]3.12型糖尿病模型大鼠的建立、分組及治療
[0029]8周齡雄性Wistar大鼠60只(200±20g)，適應性飼養I周，隨機分為糖尿病組(52只)及正常對照組(8只)。正常對照組一直給予普通飼料喂養。糖尿病組先予高糖高脂飲食6周，然后予小劑量鏈脲佐菌素(30mg/kg)腹腔注射，10天后連續兩次檢測空腹血糖^ 11.lmmol/1，認為2型糖尿病造模型成功。隨后將成模后的2型糖尿病大鼠隨機分為糖尿病對照組、人臍帶間充質干細胞組、西格列汀組、人臍帶間充質干細胞聯合西格列汀組，每組8只。正常對照組及糖尿病對照組:不給予治療；人臍帶間充質干細胞組:造模成功后第I周及5周分別給予人臍帶間充質干細胞治療，劑量為1.0 X IO6/只，濃度為0.5 X IO6/ml (PBS稀釋)，方法采用尾靜脈注射；西格列汀組:造模成功后開始西格列汀治療，劑量為lOmg/kg.d，灌胃，時間為10周。人臍帶間充質干細胞聯合西格列汀組:給予人臍帶間充質干細胞、西格列汀治療，治療時間及劑量、方法同人臍帶間充質干細胞組與西格列汀組。
[0030] 3.2觀察及檢測指標
[0031]觀察各組大鼠精神狀況，攝水、攝食及尿量，每2周測體重I次。分別在第2、4、6、
8、10周，過夜禁食后，強生血糖儀檢測空腹血糖(FPG)。第10周時內眥靜脈采血檢測，采用大鼠ELISA檢測試劑盒測定糖化血紅蛋白及胰高血糖素。10周時，過夜禁食至少8h，給予葡萄糖2g/kg，灌胃，分別于0’、60’、120’內眥靜脈采血，同步檢測血糖、C肽，C肽測定采用ELISA檢測試劑盒。C肽曲線下面積(AUC)采用近似梯形的計算公式。
[0032]3.3心肝腎及胰島組織形態學檢查
[0033]10周后處死各組大鼠，分別取出心臟、肝臟、腎臟及胰腺，置于10%甲醛中，固定24小時，脫水并石蠟包埋切片。然后行心肝腎及胰腺HE染色，胰島免疫組化檢查，使用圖像分析系統在200倍視野下觀察形態學變化。
[0034]①心肝腎及胰腺HE染色步驟:
[0035](I)切片常規二甲苯脫蠟，經各級乙醇至水洗:二甲苯(I)5min—二甲苯
(II)5min — 100% 乙醇 2min 95% 的乙醇 Imin 80% 乙醇 Imin 75% 乙醇 Imin —蒸懼水洗2min。
[0036](2)蘇木素染色5min,自來水沖洗。
[0037](3)鹽酸乙醇分化30s (提插數下)。
[0038](4)自來水浸泡15min或溫水(約50°C ) 5min。
[0039](5)置伊紅液 2min。
[0040](6)常規脫水，透明，封片:95%乙醇(I)min —95%乙醇(II) Imin — 100%乙醇
(I)Imin — 100% 乙醇(II) Imin — 二甲苯石碳酸(3:1) Imin — 二甲苯(I) Imin — 二甲苯
(II)Imin —中性樹脂封固。
[0041]②胰島免疫組化染色步驟:
[0042]胰島素免疫組化染色:
[0043]
【權利要求】
1.人臍帶間充質干細胞聯合腸促胰素為改善糖尿病胰島β細胞的功能提供了一種新方法的研究，特征在于:在應用人臍帶間充質干細胞治療I型及2型糖尿病的基礎上，聯合GLP-1 (受體激動劑及DPP-4抑制劑)。
2.根據權利要求1所述人臍帶間充質干細胞聯合腸促胰素為改善糖尿病胰島β細胞的功能提供了一種新方法的研究，人臍帶間充質干細胞采取靜脈或介入輸注的方式移植到體內，GLP-1受體激動劑采取皮下注射，DPP-4抑制劑采取口服的方法。
3.根據權利要求2所述人臍帶間充質干細胞采取靜脈或介入輸注的方式移植到體內，其中靜脈輸注的細胞數量為3 X 107，介入輸注，細胞數量:1.5 X 107，一個療程輸注兩次，間隔時間為I月。
4.根據權利要求2所述GLP-1受體激動劑采取皮下注射，DPP-4抑制劑采取口服的方法，劑量參 考藥品說明書。
【文檔編號】A61K38/26GK103566358SQ201210268601
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月24日 優先權日:2012年7月24日
【發明者】王顏剛 申請人:青島大學醫學院附屬醫院