專利名稱：α干擾素融合蛋白的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥技術領域，涉及一種干擾素融合蛋白。
背景技術：
干擾素(IFN)是一類非常重要的細胞因子，它可以抵抗病毒感染，抑制腫瘤生長和調節機體免疫功能的作用。IFN蛋白家族基于它們的基因序列、染色體定位和受體特異性分為三型1型包括IFN-a，-0，-e，-gj，-k等亞型；II型干擾素由單基因家族IFN-Y構成，又稱為免疫干擾素；111型是一種新發現的細胞因子，稱為IFN-X。其中IFN-a的 抗病毒活性最強，a干擾素(IFN-a )分子的不同亞型由165 172個氨基酸組成，分子量約在19kDa左右。隨著基因工程技術的發展，IFN-a在上個世紀80年代就成為第一個用于臨床的基因重組細胞因子，被美國FDA批準廣泛應用于病毒性肝炎、癌癥及多發性硬化癥等多種疾病的臨床治療。但是干擾素由于其相對分子質量較小，在患者體內不穩定，易被腎小球過濾，易被血清蛋白酶降解，藥物半衰期較短而治療周期較長，因此需要頻繁注射給藥。目前人們對重組IFN-a的長效型改造主要集中在以下幾個方面。首先最為常用的就是聚乙二醇修飾，FDA目前批準的PEG化干擾素為PEG-Intron和Pegasys，分別是PEG修飾的IFN- a 2b和IFN- a 2a，用于慢性丙型肝炎和慢性乙型肝炎的治療。這兩種藥物的給藥間隔為每周一次，半衰期也延長到50個小時左右，因而目前廣泛的應用于臨床治療中。其次，就是融合表達重組IFN-a，人類基因科學公司和諾華公司將IFN-a與人血清白蛋白融合表達，合作開發出長效IFN- a 2b藥物——ZALBIN,動物實驗及臨床實驗表明，ZALBIN的半衰期比IFN-a 2b提高了 18倍左右，給藥間隔也可以提高到2_4周一次。再次，對IFN-a進行定點突變，Nautilus公司的產品Belerofon就是將天然干擾素IFN-a的一個氨基酸突變，降低了其對血液和組織中蛋白酶的敏感性，進而延長了藥物在體內的半衰期。同時，人們也開發出了一些緩釋給藥系統，Biolex公司和OctoPlus公司
合作開發一種產品-Locteron,用可生物降解得聚醚酯為載體制成的由水生植物表達
系統表達的重組IFN-a 2b的新型緩控釋微球，在臨床I期實驗中檢測到半衰期明顯增長，幾乎是 PEG-Intron 的兩倍，(Bioconjugate Chem, 2008, 19(1) :299-305, BioconjugateChem,2007,18(1):61-76, JH epatol,2006,44(4) :671-678, Acta Pharm acolSin,2008，29(11):1370-1375，J Interferon Cytokine Res, 2008, 28(2):113-122, DrugTarget, 2008, 16(3):243-249, Adv Drug Deliv Rev,2002, 54(4):459-476, Biotechnol,2007，131 (3) :245-252，Pharm Res,2005，22(8):1374-1386)。雖然目前對干擾素的長效型改造方法挺多，也取得了不錯的效果，但是也有一些弊端和限制。PEG修飾會產生產品不均一性，生物活性大幅下降，同時質量控制較難；人血清白蛋白由于分子量較大，直接連接導致生物活性下降，而且，安全性沒有得到證實；緩釋給藥系統也存在包封率低，突釋和釋放不完全以及在制備過程強烈的物理、化學變化導致的IFN變性失活等問題。
利用融合蛋白基因工程重組來延長蛋白質藥物的體內半衰期是目前常用的技術之一，其中以人IgG抗體的Fe片段融合蛋白技術最為成功，已經有數種Fe融合蛋白得到臨床應用。人IgG抗體是由兩條輕鏈和兩條重鏈通過二硫鍵結合而形成的四聚體，IgG抗體經木瓜蛋白酶裂解后，形成兩個Fab片段和一個Fe片段。Fe片段由相同的兩條多肽鏈通過二硫鍵結合而成，每條多肽鏈的結構 分別由鉸鏈區、CH2和CH3功能區組成。IgG抗體是血液中最為豐富的蛋白之一，占血清中免疫球蛋白的70-75%。IgG抗體在五種免疫球蛋白中體內半衰期最長，可達到21天。因此，Fe融合蛋白可以顯著地延長體內半衰期，達到臨床使用中長效化的目的。但Fe融合蛋白技術也存在著缺陷，一是Fe片段分子較大，常使其融合分子的生物學活性減低；二是Fe為糖基化分子，其重組表達需要在哺乳動物細胞中實現，從而導致其工藝復雜、生產成本過高、生產周期過長等弊端。噬菌體肽庫技術發現一種十三個氨基酸的抗體結合肽(ABP，antibody-binding-peptide),該ABP肽在體內可以與抗體Fe片段特異性結合。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種a干擾素融合蛋白。本發明的第二個目的是提供一種a干擾素融合蛋白基因。本發明的第三個目的是提供一種重組表達載體。本發明的第四個目的是提供一種含有重組表達載體的工程菌株。本發明的第五個目的是提供a干擾素融合蛋白在制備抗病毒藥物或抗腫瘤藥物的應用。本發明的技術方案概述如下一種a干擾素融合蛋白，所述融合蛋白包括a干擾素和ABP，所述ABP為能與人IgG抗體Fe片段結合的小肽，所述a干擾素的氨基酸序列由序列表SEQ ID NO. I所示或序列表SEQ ID NO. 2所示；所述ABP的氨基酸序列由序列表SEQ ID NO. 3所示，所述a干擾素的的肽鏈C末端與ABP的N末端直接連接，或a干擾素的肽鏈C末端與ABP的肽鏈N末端之間通過(Gly-Gly-Gly-Ser)n連接,所述n為1-100。一種a干擾素融合蛋白的編碼基因，由序列表SEQ ID NO. 4、序列表SEQ ID NO. 5、序列表SEQ ID NO. 6、序列表SEQ ID NO. 7、序列表SEQ ID NO. 8、序列表SEQ ID NO. 9、序列表SEQ ID NO. 10或序列表SEQ ID NO. 11所示。一種重組表達載體，是大腸桿菌表達載體pBV中包含了由序列表SEQ ID NO. 4所不的a干擾素融合蛋白基因，用pYW-1表不；或大腸桿菌表達載體pBV中包含了由序列表SEQ IDN0. 5所示的a干擾素融合蛋白基因，用pYW_2表示；或大腸桿菌表達載體pBV中包含了由序列表SEQ ID NO. 6所不的a干擾素融合蛋白基因,用pYW_3表不；或大腸桿菌表達載體pBV中包含了由序列表SEQ ID NO. 7所示的a干擾素融合蛋白基因，用pYW_4表示；或大腸桿菌表達載體PBV中包含了由序列表SEQ ID N0.8所示的a干擾素融合蛋白基因，用pYW-5表示；或大腸桿菌表達載體pBV中包含了由序列表SEQ ID NO. 9所示的a干擾素融合蛋白基因，用PYW-6表示；或大腸桿菌表達載體pBV中包含了由序列表SEQ ID NO. 10所示的a干擾素融合蛋白基因，用PYW-7表示；或大腸桿菌表達載體pBV中包含了由序列表SEQ ID NO. 11所示的a干擾素融合蛋白基因，用pYW_8表示。一種含有重組表達載體的工程菌株，將pYW-1、pYff-2、pYff-3、pYff-4、pYff-5、pYff-6、pYW-7或pYW-8分別轉入大腸桿菌DH5 a中。一種a干擾素融合蛋白在制備抗病毒藥物或抗腫瘤藥物的應用。本發明利用ABP肽和IFN融合表達，不影響IFN的活性，同時又延長IFN在人體內的半衰期，實驗證明，可以作為一種新型的長效干擾素而用于一些腫瘤類疾病以及病毒性疾病的治療。


圖I為序列表SEQ ID NO. 8所示a干擾素融合蛋白基因的重組PCR產物電泳檢測結果。M為Marker，I泳道為所述融合蛋白基因的PCR產物電泳結果，空為空白泳道，負為 陰性對照。圖2為含SEQ ID NO. 8所示a干擾素融合蛋白基因的pYW_5載體的轉化子菌液PCR產物的瓊脂糖電泳檢測結果。M為Marker，I泳道為陰性對照，2_6泳道為陽性轉化子的菌液PCR結果。圖3為轉入pYW-5載體的大腸桿菌工程菌YW-IFNa2-ABP_E001的誘導表達的SDS-PAGE檢測結果。M為Marker，I泳道為誘導表達前全菌，2泳道為誘導表達后全菌。圖4為由SEQ ID NO. 8所表達的a干擾素融合蛋白——IFNa2_ABP蛋白變性復性及純化后的SDS-PAGE檢測結果。M為Marker，I泳道為誘導表達前全菌，2泳道為誘導表達后全菌，3泳道為融合蛋白變性復性后上清，4泳道為純化后的融合蛋白——IFNa2-ABP。圖5為由SEQ ID NO. 8所表達的a干擾素融合蛋白——IFNa2_ABP蛋白的WesternBlot分析結果。M為Marker, I為融合蛋白的Western Blot結果,2為負對照。圖6為由SEQ ID NO. 4所表達的a干擾素融合蛋白的Western Blot分析結果。M為Marker, 1、2為融合蛋白的Western Blot結果。圖7為含SEQ ID NO. 10所示a干擾素融合蛋白基因的pYW_7載體的轉化子菌液PCR結果。M為Marker，I為融合蛋白的菌液PCR結果。
具體實施例方式實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下面實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。序列表SEQ ID NO. 4是指IFNa2b及ABP基因直接融合。序列表SEQ ID NO. 5是指IFNa2a及ABP基因直接融合。序列表SEQ ID NO. 6是指IFNa2b與ABP基因之間通過表達Gly-Gly-Gly-Ser的
基因融合。序列表SEQ ID NO. 7是指IFNa2a與ABP基因之間通過表達Gly-Gly-Gly-Ser的
基因融合。序列表SEQ ID NO. 8是指IFNa2b與ABP基因之間通過表達(Gly-Gly-Gly-Ser) 3的基因融合。序列表SEQ ID NO. 9是指IFNa2a與ABP基因之間通過表達(Gly-Gly-Gly-Ser) 3的基因融合。序列表SEQ ID NO. 10是指IFNa2b與A BP基因之間通過表達(Gly-Gly-Gly-Ser)
100的基因融合。序列表SEQ ID NO. 11是指IFNa2a與A BP基因之間通過表達(Gly-Gly-Gly-Ser)100的基因融合。實施例I
一種融合基因IFN2b_ABP(SEQ ID NO. 8)的構建。包括如下步驟(I)以pBV-IFN (此質粒含有IFNa2b編碼基因序列)為模板，通過PCR (用高保真Taq酶)，獲得IFN2b_ABP基因的前一部分片段。實驗所用的PCR引物是根據IFNa2b及ABP的序列設計的Pl:5' -ATGGGATCCATGTGTGATCTGCCGCAAAC~3/ (SEQ ID NO. 12)下劃線部分為BamH I酶切位點。P2:5' -ACCGGAGCCACCGCCAGAACCTTCCTTACTTCTTAAACTTTCT-3' (SEQ ID NO. 13)(2)采用重組PCR的方法，獲得IFN2b_ABP基因片段(圖I)。所需要的引物序列如下P3:5' -GTTCTGGCGGTGGCTCCGGTGGCGGTTCTGACTGCGCGTGGCACCTGGGTGA-3' (SEQ ID NO. 14)P4:5' -GCTCTGCAGTTAGGTGCACCAAACCAGTTCACCCAGGTGCCACGCGCA-3' (SEQ ID NO. 15)下劃線部分為Pst I酶切位點。將步驟(I)中得到的IFN2b_ABP基因的前一部分片段做為模板，用P1、P3、P4三條引物進行重組PCR,反應過程中使用高保真Taq酶。體系為50yL。體系液中包含2 ii L步驟(I)中的IFN2b-ABP基因的前端片段，PU P3和P4引物各I u L, 5 u LlOXbuffer, I U LTaq 酶，I u L10mmol/L dNTP，38 u L ddH20。PCR 反應條件為94°C 預變性 5 分鐘；94°C 30秒，61°C 30秒，72°C I分鐘，循環30次；72°C延伸10分鐘，4°C保溫。獲得少量融合基因IFN2b-ABP。用上述融合基因IFN2b-ABP繼續進行2次PCR反應。此PCR反應過程中使用Pl和P4引物。反應體系為50ii L。混合液中包含上一步驟中獲得的融合基因IFN2b-ABP2u L,5u L 10Xbuffer, I u L Taq 酶，I y L IOmmoI/L dNTP, I u L Pl 弓丨物，Iii L P4 引物，39 u L ddH20。PCR反應條件為94°C預變性5分鐘；94°C 30秒，60°C 30秒，72°C I分鐘，循環30次；72°C延伸10分鐘，4°C保溫。獲得融合基因IFN2b-ABP(SEQ ID NO. 8)(圖I)。實施例2一種含有IFN2b_ABP融合基因的大腸桿菌表達載體pYW_5的構建。用BamH I和Pst I消化IFN2b_ABP基因片段。質粒pBV亦用BamH I和Pst I雙酶切得到載體大片段。將酶切后的載體大片段和基因片段進行連接。挑取陽性轉化子即為本發明中所用的表達載體——含有IFN2b-ABP(SEQ ID NO. 8)融合基因的大腸桿菌表達載體pYW-5 (圖2)。實施例3大腸桿菌工程菌YW-IFN2b-ABP-E001的誘導表達及IFN2b_ABP的純化。將實施例2獲得的含有IFN2b_ABP(SEQ ID NO. 8)融合基因的大腸桿菌表達載體pYW-5轉化入大腸桿菌DH5 a中，得到YW-IFN2b-ABP_E001菌株，30°C、200rpm搖瓶培養到006(|(|為0. 6時瞬間升溫至42°C，然后200rpm誘導表達4小時。離心取菌體，SDS-PAGE電泳檢測證明成功表達IFN2b-ABP (圖3)。菌體進行超聲破碎，得到沉淀進行包涵體變性復性處理，復性后的上清液進行疏水層析和離子交換層析純化處理，獲得高純度的IFN2b-ABP(圖4)。Western blot結果(圖5)表明，構建的大腸桿菌已成功表達IFN2b_ABP。實施例4Western Blot 實驗。本實驗的目的是證實本發明的a干擾素融合蛋白能和人IgG抗體的Fe片段結將經過疏水層析和離子交換層析純化得到的高純度IFN2b_ABP進行WesternBlot實驗。15%SDS-PAGE電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜(200mA，40min)，脫脂奶粉封閉I小時，加入人免疫球蛋白IgG作為一抗4°C孵育過夜。一抗處理結束后，加入HRP(辣根過氧化物酶)標記的二抗室溫處理I. 5小時，DAB顯色液進行顯色反應。結果(圖5)顯示，膜上的IFN2b-ABP融合蛋白處有明顯的顏色反應，即該蛋白與人免疫球蛋白IgG的Fe片段產生特異性結合反應。實施例5抗腫瘤細胞增殖實驗。將DAUDI細胞以適當濃度接種于含有10%滅活小牛血清的細胞培養液中(180iiL)，在37°C，5%C02，飽和濕度下培養一天，第二天在細胞培養液中加入純化后的INF2b-ABP蛋白及對照樣品(從原液開始用PBS緩沖液以10倍、20倍、40倍、80倍、160倍、320倍、640倍、1280倍、2560倍稀釋)，37 °C，5%C02，飽和濕度下培養六天，然后加入20 y L濃度為5mg/mL的MTT，37°C孵育4小時，繼而加入三聯液，37°C過夜，用酶標儀測A570nm吸光值來表示細胞增殖水平。結果證明INF2b-ABP蛋白可以有效抑制腫瘤細胞的增值，見表I。表I
權利要求
1.一種a干擾素融合蛋白，其特征是所述融合蛋白包括a干擾素和ABP，所述ABP為能與人IgG抗體Fe片段結合的小肽，所述a干擾素的氨基酸序列由序列表SEQ ID NO. I所示或序列表SEQ ID NO. 2所示；所述ABP的氨基酸序列由序列表SEQ ID N0.3所示，所述a干擾素的肽鏈C端與ABP的肽鏈N端直接連接，或a干擾素的肽鏈C端與ABP的肽鏈N端之間通過(Gly-Gly-Gly-Ser)n連接,所述n為1-100。
2.—種a干擾素融合蛋白的編碼基因，其特征是由序列表SEQ ID NO. 4、序列表SEQID NO. 5、序列表 SEQ ID NO. 6、序列表 SEQ ID NO. 7、序列表 SEQ ID NO. 8、序列表 SEQ IDNO. 9、序列表SEQ ID NO. 10或序列表SEQ ID NO. 11所示。
3.—種重組表達載體,其特征是大腸桿菌表達載體pBV中包含了權利要求2所述由序 列 表SEQ ID NO. 4所示的a干擾素融合蛋白基因，用pYW_l表示；或大腸桿菌表達載體pBV中包含了權利要求2所述由序列表SEQ ID NO. 5所示的a干擾素融合蛋白基因，用pYW_2表示；或大腸桿菌表達載體PBV中包含了權利要求2所述由序列表SEQ ID NO. 6所示的a干擾素融合蛋白基因，用PYW-3表示；或大腸桿菌表達載體pBV中包含了權利要求2所述由序列表SEQ ID NO. 7所不的a干擾素融合蛋白基因,用pYW_4表不；或大腸桿菌表達載體pBV中包含了權利要求2所述由序列表SEQ ID N0.8所示的a干擾素融合蛋白基因，用pYff-5表示；或大腸桿菌表達載體pBV中包含了權利要求2所述由序列表SEQ ID NO. 9所不的a干擾素融合蛋白基因，用pYW-6表不；或大腸桿菌表達載體pBV中包含了權利要求2所述由序列表SEQ ID NO. 10所示的a干擾素融合蛋白基因，用pYW_7表示；或大腸桿菌表達載體pBV中包含了權利要求2所述由序列表SEQ ID NO. 11所示的a干擾素融合蛋白基因，用pYW-8表示。
4.一種含有重組表達載體的工程菌株，其特征是將權利要求3所述的pYW-1、pYW-2、pYW-3、pYW-4、pYW-5、pYW_6、pYff-7 或 pYW_8 分別轉入大腸桿菌 DH5 a 中。
5.權利要求I的一種a干擾素融合蛋白在制備抗病毒藥物或抗腫瘤藥物的應用。
全文摘要
本發明公開了一種α干擾素融合蛋白，融合蛋白包括α干擾素和ABP，ABP為能與人IgG抗體Fc片段結合的小肽，α干擾素的氨基酸序列由序列表SEQ ID NO.1所示或序列表SEQ ID NO.2所示；ABP的氨基酸序列由序列表SEQ ID NO.3所示，α干擾素的肽鏈C端與ABP的肽鏈N端直接連接，或α干擾素的肽鏈C端與ABP的肽鏈N端之間通過(Gly-Gly-Gly-Ser)n連接，n為1-100。本發明利用ABP肽和IFN融合表達，不影響IFN的活性，同時又延長IFN在人體內的半衰期，實驗證明，本發明的α干擾素融合蛋白可以作為一種新型的長效干擾素而用于一些腫瘤類疾病以及病毒性疾病的治療。
文檔編號A61K38/21GK102775502SQ20121029276
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月16日 優先權日2012年8月16日
發明者劉汝萃, 劉錫潛, 衛一鳴, 張建全, 杜勇, 范書琴, 逄鍵濤 申請人:天津禹王生物醫藥科技有限公司, 山東禹王制藥有限公司