專利名稱：表達巢蛋白的腎源干細胞或祖細胞的制作方法
技術領域：
本發明屬于干細胞與組織工程領域，涉及一種表達巢蛋白(Nestin)的腎源干細胞或祖細胞(Nestin+RSPCs)、分離該腎源干/祖細胞的方法，以及該腎源干/祖細胞的用途。本發明特別涉及巢蛋白-綠色突光蛋白(Nestin-Green Fluorescent Protein,Nestin-GPF)轉基因小鼠通過流式分選技術分離Nestin+腎源干/祖細胞(Nestin+RSPCs)，并驗證其自我更新能力和增殖能力；隨后細胞移植到腎缺血損傷動物模型體內，鑒定Nestin+RSPCs在體內的分化特性和損傷修復的功能。
背景技術：
腎源干細胞的研究起步較晚，對其生物學特性的認識有很大局限性。近幾年研究報道了成體腎組織分離具有干/祖細胞潛能細胞的方法，但大多數屬于回顧性研究，分離得到的細胞很難鑒定是否真正的干細胞。有研究報道發現腎小管(tubules)和腎乳頭間質(interstitium of renalpapilla)中的一些低更新率(slow-cycling)的細胞,存在某些干/祖細胞特性(Hong KU,Reynolds SDj Giangreco A, et al. Clara cell secretory protein-expressing cellsof the airway neuroepithelial body microenvironment include a label-retainingsubset and are critical for epithelial renewal after progenitor cell depletion.Am J Respir Cell Mol Biol. 2001. 24: 671-681 )，但后來被證實它們只是具有某些干/ 袓細胞特性的已分化的細胞(Maeshima A, Yamashita S，Nojima Y. Identificationof renal progenitor-like tubular cells that participate in the regenerationprocesses of the kidney. J Am Soc Nephrol. 2003. 14: 3138-3146)。該類細胞與腎其它不同更新速率細胞的分化程度沒有區別(Bruno S，Bussolati B，Grange C，et al. Isolation and characterization of resident mesenchymal stem cells inhuman glomeruli. Stem Cells Dev. 2009. 18: 867-880)，并且成體分化了的上皮細胞(epithelial cell)也有形成克隆和自我更新的能力(Cicero SAj Johnson D，ReyntjensS， et al. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmentedciliary epithelial cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2009. 106:6685-6690)。 ImaiN等在特定培養條件下獲的類似干細胞的細胞，但該細胞卻不能修復缺血再灌注損傷的腎組織(Imai N，Hishikawa K，Marumo Tj et al. Inhibition of histone deacetylaseactivates side population cells in kidney and partially reverses chronic renalinjury. Stem Cells. 2007. 25: 2469-2475)。Thiery JP 等研究提不，Imai N 等得到的細胞可能是由于體外培養導致上皮細胞產生上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymaltransitions, EMT)而產生的，這種狀態下的細胞表現出某些袓細胞樣的特性，但不產生相應的袓細胞功能(Thiery JPj Acloque H，Huang RYj et al. Epithelial-mesenchymaltransitions in development and disease. Cell. 2009.139: 871-890)。有研究人員利用⑶133、⑶24、干細胞抗原-I (Sca-I)和受體酪氨酸蛋白激酶等表面標志物，在腎間質(interstitium)和腎小球囊的泌尿極中分離鑒定干細胞(Lazzeri Ej CrescioliC， Ronconi E, et al. Regenerative potential of embryonic renal multipotentprogenitors in acute renal failure. J Am Soc Nephrol. 2007. 18: 3128-3138)。但進一步研究發現，這些表面標志物在分化的上皮細胞中均有很高的表達。因而，利用這些非特異性的表面標志物得到的細胞，很難區分是真正的干細胞，還是有某些祖細胞特性的上皮細胞，或者是間質/基質細胞(mesenchymal stromal cell)。因而，利用特異表面標志是尋找分離腎源干細胞的最有效方法。Dekel B等比較人胚胎腎細胞和小兒腎惡性Wilms’瘤的表達譜，鑒定的胚胎腎源干細胞表面標志基因包括神經細胞粘附分子I (neural cell adhesion molecule I, NCAM1, CD56),聚唾液酸神經細胞粘附分子 I (poly-sialated neural cell adhesion molecule 1PSA-NCAM1)，FZD7, FZD2, DLKl, ACVRIIB 和 NTRK2 (Dekel B, Metsuyanim S, Schmidt-Ott KM, etal. Multiple imprinted and sternness genes provide a link between normal andtumor progenitor cells of the developing human kidney. Cancer Res. 2006. 66:6040-6049)。Metsuyanim S等根據Dekel B等的研究結果,利用NCAMl成功定位并分離了人胚胎的腎干細胞(Metsuyanim S，Harari-Steinberg O, Buzhor E, et al. Expressionof stem cell markers in the human fetal kidney. Plos One. 2009. 4: e6709)o 然而，由于本發明人對成體腎源干細胞生物學特性以及基因表達特點認識的匱乏，迄今仍無法利用特異表面標志物對其進行直接高效的分離。這也限制了成體腎源干細胞在腎疾病治療研究的開展。巢蛋白(Nestin)作為中間絲蛋白家族成員之一，在胚胎發育過程中廣泛表達，最早的表達時間出現在胚胎發育第7. 5天(E7. 5)的單細胞神經外胚層上(Kawaguchi A,Miyata T, Sawamoto K, et al. Nestin-EGFP transgenic mice: visualization ofthe self-renewal and multipotency of CNS stem cells. Mol Cell Neurosci. 2001.17: 259-273),隨后在體節前胚胎中胚層(presomitic mesoderm)和肌節層(myotomelayer)也有表達(Sejersen T, Lendahl U. Transient expression of the intermediatefilament nestin during skeletal muscle development. J Cell Sci. 1993. 106:1291-1300)。但是，巢蛋白表達最豐富的區域仍然是在神經系統。此外，巢蛋白在中腎間質細胞、胰腺上皮祖細胞、視網膜米勒細胞、新生血管內皮細胞、肝卵圓細胞等組織細胞中也有分布。在早期胚胎發育階段，大多數巢蛋白陽性細胞代表了增殖旺盛的干/祖細胞群。而這群細胞一旦開始分化或者停止分裂，巢蛋白表達開始下降并逐漸被其它組織特異性的中間絲蛋白所取代。巢蛋白陽性細胞在成體組織中也有一定分布，例如中樞神經系統的側腦室下區(Subventricular zone, SVZ)、海馬齒狀回顆粒細胞層下區(HippocampalSubgranual Zone, SGZ)、嗅球神經上皮祖細胞等，在一定條件下這些細胞可以增殖、分化和遷移，具有成體干細胞的特性。值得關注的是，在組織損傷發生時，可以觀察到部分巢蛋白陰性細胞可重新表達巢蛋白并進入細胞增殖和遷移狀態。值得關注的是，有研究發現在小鼠腎發育過程中有巢蛋白表達，而且出生后小鼠腎中仍有一定量的巢蛋白表達，這提示巢蛋白可能是尋找腎源性干細胞的重要標志物(Chen J, Boyle S，Zhao M, etal.Differential expression of the intermediate filament protein nestin duringrenal development and its localization in adult podocytes. J Am Soc Nephrol.2006 . 17:1283-1291)。目前尚未見研究報道以巢蛋白為標記物分離和鑒定腎源干細胞的相關研究。

發明內容
本發明的第一個方面是提供一種分離腎源干細胞或祖細胞的方法，其中所述細胞表達巢蛋白。該方法是基于所述細胞產生受巢蛋白增強子控制的綠色熒光蛋白來分離獲得的。本發明所述的分離腎源干細胞或祖細胞的方法，其中所述細胞表達巢蛋白，所述方法包括提供一種以C57BL/6為遺傳背景的巢蛋白-綠色熒光蛋白(Nestin-GFP)轉基因小鼠模型；飼養所述轉基因小鼠模型的小鼠至I周齡或以上，分離小鼠腎，用膠原酶IV和胰蛋白酶消化，過濾消化后的細胞懸液，篩除腎結締組織、腎小管和細胞團塊，獲得單個細胞，所述細胞產生受巢蛋白增強子控制的增強型綠色突光蛋白(Enhanced Green FluorescentProtein，EGFP);將上述單個細胞通過流式細胞儀進行分選，用C57B/6小鼠細胞做陰性對照細胞，收集表達綠色熒光蛋白的熒光強度是陰性對照細胞的熒光強度的10倍或以上的細胞，從而分離出所述表達巢蛋白的腎源干細胞或祖細胞。 根據本發明所述的方法的進一步特征，所述巢蛋白-綠色熒光蛋白轉基因小鼠模型包含以巢蛋白啟動子驅動表達增強型綠色熒光蛋白的質粒，其中，包括上游翻譯位點的啟動子區域長2. 5kb，包含第二個外顯子3’到第三個內含子5’的增強子區域長I. 8kb，多聚腺苷化位點與增強型綠色熒光蛋白cDNA連接。根據本發明所述的方法的進一步特征，該方法進一步包括在培養基中培養所述分離的腎源干細胞或祖細胞以致產生自我更新和增殖的細胞。經實驗表明，單純在DMEM/F12基礎培養基培養分離的Nestin+RSPCs細胞不增殖，容易分化，在第四代細胞即不能傳代。因此，本發明在DMEM/F12基礎培養基的基礎上進行改良，優選的培養基為無血清培養基，其成分包括DMEM/F12基礎培養基、10X濃度的1%(v/v) N-2添加物、5 X濃度的2% (v/v) B27增殖添加物、25ng/ml純化EGF、40ng/ml牛重組bFGF和10U/ml青霉素/鏈霉素。實驗表明，將該培養用于本發明所述的腎源干/祖細胞的培養，細胞增殖效果非常好。本發明的第二個方面是提供一種分離的腎源干細胞或祖細胞，所述細胞表達巢蛋白。所述細胞是基于巢蛋白的表達來分離的，所述細胞產生受巢蛋白增強子控制的綠色熒光蛋白。本發明所述的分離的腎源干細胞或祖細胞，是根據本發明所述的上述方法分離的腎源干細胞或祖細胞。本發明進一步提供了所述的腎源干細胞或祖細胞在培養基中培養獲得的自我更新和增殖的細胞。所述的培養基優選為無血清培養基，其成分包括DMEM/F12基礎培養基、IOX濃度的1% &八)^2添加物、5父濃度的2% (v/v)B27增殖添加物、25ng/ml純化EGF、40ng/ml牛重組bFGF和10U/ml青霉素/鏈霉素。本發明的第三個方面是提供了所述的腎源干細胞或祖細胞的用途，具體是將本發明所述的分離的腎源干細胞或祖細胞用于制備治療腎損傷修復的組合物，以及進一步將本發明所述的在培養基中培養獲得的自我更新和增殖的細胞用于制備治療腎損傷修復的組合物。本發明不僅提供了小鼠成體腎的取材和消化方法，以及基于綠色熒光蛋白(GFP)表達情況的流式分選方法，而且提供了表達巢蛋白(Nestin)的腎源干細胞或祖細胞(Nestin+RSPCs)的培養方法和條件。本發明將Nestin+ RSPCs與早期干細胞和重編程特異標志0ct4、特異性胚胎抗原-I、特異性胚胎抗原_4，生后腎原基細胞特異標志成對盒蛋白，細胞增殖相關特異標志PH3和內皮細胞特異標志CD31的抗體，分別與巢蛋白的抗體對克隆球進行免疫熒光染色，從分子水平分析巢蛋白陽性細胞的自我更新能力和細胞干性的分子生物學特點，從而對該種干細胞進行鑒定。本發明還進行了 Nestin+ RSPCs的克隆形成實驗,結果表明，Nestin+ RSPCs呈球狀克隆生長，并有較強的GFP熒光。本發明還進行了 CCK8細胞增殖實驗，用CCK8試劑盒檢測細胞增殖情況。本發明進一步利用小鼠缺血性腎損傷模型，觀察Nestin+ RSPCs在小鼠腎損傷組 織中的修復作用。所述小鼠腎損傷模型是用C57小鼠為實驗對象，對其進行腎缺血再灌注的方式造模，并靜脈注射Nestin+ RSPCs，利用測血肌酐濃度、冰凍切片免疫熒光染色的方法來觀察Nestin+ RSPCs移植對小鼠腎損傷的修復作用。


在這里，僅通過與實施例結合附圖的方式來描述本發明的內容，與以下的附圖有關
圖I是出生7天的Nestin-GFP小鼠腎中Nestin+ RSPCs細胞流式分選圖。左圖為對照C57小鼠陽性率，右圖為Nestin-GFP小鼠分選陽性率。圖2是通過熒光顯微鏡觀察到的流式分選后的細胞圖，左邊為白光圖，右邊為熒光圖。PO代表原代細胞，P20代表第20代細胞。圖3是Nestin+RSPCs球巢蛋白與干細胞增殖重新編程有關的標志物的免疫熒光共染色圖。第一排為巢蛋白陽性細胞；第二排為干細胞增殖重新編程有關的各種標志物的單獨染色，其中腎病蛋白(Nephrin),波形蛋白(Vimentin),特異性胚胎抗原-I (SSEA-I),特異性胚胎抗原-4 (SSEA-4)和堿性磷酸酶3 (PH3)表達陽性，受體酪氨酸蛋白激酶(c-kit),成對盒蛋白2 (Pax2)和0ct4不表達；第三排為共染色(Merged)
圖4是Nestin+RSPCs克隆球形成情況圖。其中，圖4A顯示I X IO3個單細胞形成克隆球的數量，直徑為40-79um的克隆球將近400個，直徑為80_150um的克隆球將近100個。圖4B顯示克隆球的形態。圖5是CCK - 8細胞增殖活性檢測結果圖。圖6是腎缺血再灌注后血肌酐的測定圖。圖7是腎損傷組織中PKH26陽性細胞與巢蛋白，腎病蛋白和波形蛋白免疫熒光染色圖。第一排為PKH26陽性細胞表達巢蛋白；第二排為PKH26陽性細胞表達腎病蛋白；第三排為PKH26陽性細胞表達波形蛋白。
具體實施例方式實施例一小鼠成體腎巢蛋白陽性細胞的分離本實施例選擇從小鼠成體腎中分離獲得表達巢蛋白(Nestin)的腎源干細胞或祖細胞，也就是，從小鼠成體腎中分離巢蛋白陽性細胞。巢蛋白-GFP小鼠本實驗的轉基因小鼠是來自于日本京都大學醫學院生理學教研室構建的特異性標記巢蛋白-綠色熒光蛋白(Nestin-GFP)轉基因小鼠模型(YamaguchiMj Saito H，Suzuki Mj Mori K. Visualization of neurogenesis in the centralnervous system using nestin promoter—GFP transgenic mice. Neuroreport 2000.11:1991-1996.)。但也可選用其他巢蛋白-GFP小鼠，它們的共同特征是包含以Nestin啟動子驅動表達GFP的質粒，包括上游的翻譯位點的啟動子區域長2. 5kb，包含第二個外顯子3’到第三個內含子5’的增強子區域長I. 8kb，多聚腺苷化位點與增強型GFP (EGFP) cDNA連接。本發明對該動物模型的研究發現，不同年齡小鼠腎中存在巢蛋白陽性細胞(即表達受巢蛋白增強子控制的綠色熒光蛋白)，主要分布在腎小球區。本發明進一步利用流式分選技術，成功分離得到腎源性的Nestin+細胞。分離方法具體如下
a.選取巢蛋白-GFP小鼠和C57BL/6J小鼠，分離I周齡小鼠腎，用生理鹽水沖洗干凈。將腎剪碎，加膠原酶IV (collagenase IV)和DNase I，37°C震蕩水浴消化30分鐘，轉移上清液，下層組織中加O. 05%胰蛋白酶(trysin)，37°C震蕩水浴消化10分鐘。 b.消化后的細胞懸液分別用100 μ m和40 μ m的濾網進行過濾，篩除腎結締組織、腎小管和細胞團塊等，最終獲得單個細胞。c. C57BL/6J小鼠的細胞做陰性對照，通過流式細胞儀分選獲得巢蛋白陽性細胞。巢蛋白-GFP小鼠細胞的熒光強度是C57BL/6J小鼠細胞10倍或以上的細胞收集，即為目的Nestin+ 細胞。圖I是出生7天的巢蛋白-GFP小鼠腎中Nestin+ RSPCs細胞流式分選圖。如圖I所示，用C57B/6小鼠細胞做陰性對照細胞，巢蛋白-GFP小鼠腎中細胞熒光強度是對照的10倍或以上時收集細胞，為Nestin+ RSPCs，從圖I中可以看出陽性率為4.67%。如圖2所示，通過熒光顯微鏡可觀察到，流式分選后的細胞在未完全貼壁時有強GFP熒光，被視為原代細胞(PO )，細胞在無血清培養基中，可以克隆球的形態懸浮生長，在第20代的細胞中仍具有較強的GFP熒光(P20)，在圖2中，左邊為白光圖，右邊為熒光圖。其他哺乳類動物的表達巢蛋白(Nestin)的腎源干細胞或祖細胞，也可根據本實施例所揭示的原理和方法來獲得。實施例二 巢蛋白陽性細胞自我更新和增殖能力的鑒定
本實施例是在實施例一的基礎上，對所獲得的巢蛋白陽性細胞自我更新和增殖能力進行鑒定。a.巢蛋白陽性細胞自我更新能力的鑒定
將從小鼠成體腎中分選獲得的單個巢蛋白陽性細胞分別置于6孔板的各個單孔中進行培養。培養液成分包括DMEM/F12基礎培養基，1%&八別-2添加物(10\濃度)，2%(v/v)B27增殖添加物(5X濃度)(25ng/ml),牛重組bFGF (40ng/ml)和青霉素/鏈霉素(10U/ml)。觀察細胞克隆的形成情況，當細胞克隆大小達到50um以上、密度達到70%，用370C的O. 05%胰蛋白酶-EDTA對細胞消化30秒，進行傳代。應用免疫熒光染色的方法進行包括0ct4、Nanog、特異性胚胎抗原_1、特異性胚胎抗原_4、成對盒蛋白和⑶24、⑶133、⑶31、增殖相關標志物PH3和腎小球足細胞標志物腎病蛋白，波形蛋白以及腎干細胞標志物成對盒蛋白等表面標志物的染色，細胞切片用4%多聚甲醛固20 min, PBS緩沖液中浸洗5 minX3次，O. 2% Triton-X-IOO穿透30分鐘，正常山羊血清室溫孵育20分鐘，加一抗，濕化盒中4°C過夜，加二抗，室溫孵育I小時，熒光顯微鏡觀察結果。圖3顯示了 Nestin+RSPCs球巢蛋白與上述干細胞增殖重新編程有關的標志物的免疫熒光共染色結果。結果表明，表達巢蛋白的Nestin+RSPCs球與腎病蛋白、波形蛋白、SSEAl和SSEA4共定位，但并沒有⑶31、成對盒蛋白、受體酪氨酸蛋白激酶和0ct4的表達。b.巢蛋白陽性細胞增殖能力的鑒定
將CCK8試劑按1:10的比例加入細胞培養基，37°C繼續培養細胞兩小時后用酶聯免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值。繪制細胞生長曲線，計算DT值。圖4顯示了 Nestin+RSPCs克隆球形成情況。如圖4所示,Nestin+RSPCs可以形成較均一的克隆球，圖4A顯示I X IO3個細胞形成克隆球的數量，圖4B顯示克隆球的形態。結果表明，Nestin+RSPCs具有較強的自我更新能力。圖5顯示了 CCK-8細胞增殖活性檢測結果。結果表明，Nestin+RSPCs具有較強的細胞增殖能力。實施例三觀察巢蛋白陽性細胞在腎損傷修復中作用
a.小鼠缺血性腎損傷模型的建立
將28只小鼠根據處理不同隨機分為正常對照組(n=4)、缺血組(n=12)、細胞組(n=12).小鼠術前8 12 h禁食，應用三溴乙醇溶液(200 mg/kg)經腹腔內注射麻醉。實驗組沿腹正中線做I. 5^2. O cm的切口，逐層分離皮膚、腹膜，進入腹腔，將腸道推向一側，找到腎蒂后用無損傷微型動脈夾迅速阻斷左右腎蒂，可見腎臟由鮮紅變紫黑色，表示夾閉成功，持續夾閉腎蒂15分鐘，去除動脈夾，恢復血流灌注，可見腎臟迅速由紫黑色變為鮮紅，恢復原來顏色，術畢分層縫合關閉腹腔。術后小鼠于24 29°C的環境保暖，補充水與飼料。術中應用生理鹽水使小鼠保持充分的水化。正常對照組同法打開腹并找到腎蒂，但不夾閉腎蒂。細胞組在手術第二天，靜脈緩慢注射PKH26標記的2X IO6細胞/200 μ I PBS,注射一次。缺血組和正常對照組靜脈給予200 μ I PBS。術后分別在O天，2天，4天，7天采血，取腎組織進行組織化學分析。b.分別于零、二、四、七天時取出外周血，分離血清，觀察兩組小鼠的腎功能的生化指標，檢測血肌酐(Cr)濃度，評判腎功能的恢復程度；同時分離相應時間段小鼠的腎，進行冰凍切片，觀察其組織，特別是腎小球的損傷修復情況。通過免疫熒光染色檢測PKH26陽性細胞與腎病蛋白、波形蛋白、CD31和巢蛋白共定位情況，觀察在體內PKH26陽性細胞的分化與修復中起到的作用。圖6顯示了腎缺血再灌注后血肌酐的測定結果。如圖6所示，損傷引發血清肌酐水平明顯增加，在第4天達高峰，而Nestin+RSPCs移植組小鼠血清肌酐水平明顯降低。圖7顯示了腎損傷組織中PKH26陽性細胞與巢蛋白，腎病蛋白和波形蛋白免疫熒光染色結果。如圖7所示，PKH26陽性細胞與足細胞標記物腎病蛋白和Vementi共表達，而不與巢蛋白共定位，說明Nestin+RSPCs細胞在體內可分化為足細胞。本實施例的實驗結果表明，對于產生腎損傷修復的疾病來說，可以考慮將本發明 所述的表達巢蛋白的腎源干細胞或祖細胞用于干細胞治療，具體是將包含本發明所述的細胞的組合物用于制備治療腎損傷修復的組合物。
權利要求
1.一種分離腎源干細胞或祖細胞的方法，其中所述細胞表達巢蛋白，所述方法包括 提供一種以C57BL/6為遺傳背景的巢蛋白-綠色熒光蛋白轉基因小鼠模型； 飼養所述轉基因小鼠模型的小鼠至I周齡或以上，分離小鼠腎，用膠原酶IV和胰蛋白酶消化，過濾消化后的細胞懸液，篩除腎結締組織、腎小管和細胞團塊，獲得單個細胞，所述細胞產生受巢蛋白增強子控制的增強型綠色熒光蛋白； 將上述單個細胞通過流式細胞儀進行分選，用C57B/6小鼠細胞做陰性對照細胞，收集表達綠色熒光蛋白的熒光強度是陰性對照細胞的熒光強度的10倍或以上的細胞，從而分離出所述表達巢蛋白的腎源干細胞或祖細胞。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述巢蛋白-綠色熒光蛋白轉基因小鼠模型包含以巢蛋白啟動子驅動表達增強型綠色熒光蛋白的質粒，其中，包括上游翻譯位點的啟動子區域長2. 5kb，包含第二個外顯子3’到第三個內含子5’的增強子區域長1.8kb，多聚腺苷化位點與增強型綠色熒光蛋白cDNA連接。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于進一步包括在培養基中培養所述分離的腎源干細胞或祖細胞以致產生自我更新和增殖的細胞。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的培養基為無血清培養基，其成分包括DMEM/F12基礎培養基、IOX濃度的1% (v/v) N-2添加物、5X濃度的2% (v/v)B27增殖添加物、25ng/ml純化EGF、40ng/ml牛重組bFGF和10U/ml青霉素/鏈霉素。
5.根據權利要求I所述的方法分離的腎源干細胞或祖細胞，所述細胞表達巢蛋白。
6.根據權利要求5所述的腎源干細胞或祖細胞進一步在培養基中培養獲得的自我更新和增殖的細胞。
7.根據權利要求6所述的細胞，其特征在于，所述的培養基為無血清培養基，其成分包括DMEM/F12基礎培養基、IOX濃度的1% (v/v) N-2添加物、5X濃度的2% (v/v)B27增殖添加物、25ng/ml純化EGF、40ng/ml牛重組bFGF和10U/ml青霉素/鏈霉素。
8.根據權利要求5所述的分離的腎源干細胞或祖細胞在制備治療腎損傷修復的組合物中的用途。
9.根據權利要求6所述的細胞在制備治療腎損傷修復的組合物中的用途。
全文摘要
本發明涉及一種表達巢蛋白的腎源干細胞或祖細胞、分離該細胞的方法，以及該細胞的用途。本發明所述的方法包括提供一種以C57BL/6為遺傳背景的巢蛋白-綠色熒光蛋白轉基因小鼠模型；飼養小鼠至1周齡或以上，分離腎，用膠原酶IV和胰蛋白酶消化，過濾消化后的細胞懸液，篩除腎結締組織、腎小管和細胞團塊，獲得單個細胞；通過流式細胞儀進行分選，收集表達綠色熒光蛋白的熒光強度是陰性對照細胞的熒光強度的10倍或以上的細胞，從而分離出所述表達巢蛋白的腎源干細胞或祖細胞。本發明提供了根據上述方法分離的腎源干/祖細胞，以及進一步在培養基中培養獲得的自我更新和增殖的細胞，并且提供了將這些細胞用于制備治療腎損傷修復的組合物的用途。
文檔編號A61K35/23GK102864124SQ201210331539
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月10日 優先權日2012年9月10日
發明者項鵬, 姜美花 申請人:廣東江源生物科技有限公司