專利名稱：一種采用雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混生物材料及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料、高分子化學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種采用雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混生物材料及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
明膠作為自然界來源豐富的蛋白質(zhì)類的天然高分子和生物大分子材料，它具有良好的生物相容性、無毒、可生物降解，可被人體吸收以及價格低廉等優(yōu)點(diǎn)在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，尤其明膠的氨基酸組成和比例與人體皮膚接近，因此在生物敷料，傷口愈合劑和人工皮膚等皮膚組織工程方面具有很好的應(yīng)用前景[功能材料，2004，35:2310-2313]，然而明膠膜脆性大、易破碎，易滋生感染細(xì)菌等缺點(diǎn)限制了其應(yīng)用。因此，改善明膠的機(jī)械性能和抗菌性能以擴(kuò)展其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用具有十分重要的意義。殼聚糖是甲殼素的N-脫乙酰化產(chǎn)物，也是一種自然界中來源豐富的生物多糖類的天然高分子和生物大分子材料，具有很好的成膜性、生物相容性、可降解性，來源廣泛性并具有獨(dú)特的廣譜抗菌性能[International Journal of Food Microbiology, 2000, 62(1-2):139-148]。因此，將明膠和殼聚糖共混可以形成材料各組分之間的優(yōu)勢互補(bǔ)，不僅有利于提高明膠基材料的機(jī)械性能，特別是有利于改善明膠基材料易滋生和感染細(xì)菌的缺點(diǎn)。明膠和殼聚糖共混材料的制備過程中，往往需要進(jìn)行交聯(lián)來提高共混材料的機(jī)械性能和穩(wěn)定性[Food Chemistry, 2007, 103: 295 - 300]。然而，傳統(tǒng)的化學(xué)交聯(lián)雖然可以有效改善材料的機(jī)械性能和穩(wěn)定性，但是由于常用的化學(xué)交聯(lián)劑例如醛類(甲醛，戊二醛和甘油醛)，環(huán)氧化合物組分和碳化二亞胺等往往具有細(xì)胞毒性，這將會導(dǎo)致化學(xué)交聯(lián)方法制備的生物材料在植入體內(nèi)以后，影響受體正常組織的生長。鑒于上述原因，在材料的制備過程中使用天然的和無毒性的修飾劑，對于制備生物相容性良好的生物材料具有十分重要的意義。酶作為生物催化劑，具有一系列的優(yōu)點(diǎn)酶是一種生物催化劑，沒有副反應(yīng)，不會產(chǎn)生毒性問題；反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)步驟簡單；催化效率高，專一性強(qiáng)，而被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療檢驗、生物制造等行業(yè)。因此，是否能夠找到合適的酶對明膠和殼聚糖共混材料進(jìn)行修飾成為本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種采用雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混生物材料及其制備方法與應(yīng)用，明膠與殼聚糖共混材料經(jīng)過雙生物酶修飾后，材料的穩(wěn)定性和力學(xué)機(jī)械性能提高，并且該材料具有良好的抗菌活性。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為
一種采用雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混生物材料，其特征在于，所述雙生物酶分別為微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和酪氨酸酶。采用雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混生物材料的制備方法，其特征在于，它包括如下具體步驟
1)溶液的配制
按明膠去離子水=2 6g:50 lOOmL，選取明膠和去離子水，備用；將明膠加入到去離子水中，在40 60°C的水浴中攪拌I 2小時至明膠充分溶解后得到明膠溶液；
按殼聚糖1% (體積百分比)乙酸溶液=1 2g:50 IOOmL,選取殼聚糖和乙酸溶液，備用；將殼聚糖加入到乙酸溶液中，室溫下攪拌3 5小時至殼聚糖充分溶解，然后向溶液中滴加O. 5 I. Omol/L氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH為5. O 6. 0，得到殼聚糖溶液；
按微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶去離子水=10 20U:5 10mL，選取微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和去離子水，備用；將微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶加入到去離子水中，室溫下攪拌15 30分鐘充分 溶解，再過濾得到微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶溶液；
按酪氨酸酶pH為7. O的PBS緩沖溶液=5000 10000U: 5 10mL，選取酪氨酸酶和pH為7. O的PBS緩沖溶液，備用；將酪氨酸酶溶于所述pH為7. O的PBS緩沖溶液中，室溫下攪拌2 5分鐘至酪氨酸酶充分溶解后得到酪氨酸酶溶液；
2)明膠與殼聚糖的共混
按明膠溶液殼聚糖溶液=50 IOOmL:50 IOOmL,選取上述配制的明膠溶液和殼聚糖溶液，備用；將明膠溶液和殼聚糖溶液等體積混合，40 60°C下攪拌15 30分鐘，使溶液混合均勻，得到明膠與殼聚糖共混溶液；
3)雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混材料的制備
按明膠與殼聚糖共混溶液微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酪氨酸酶=50 100mL:3 8U:3000 7000U，選取上述明膠與殼聚糖共混溶液、微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和酪氨酸酶，備用；向明膠與殼聚糖共混溶液中加入上述微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和酪氨酸酶，在28 30°C下攪拌反應(yīng)10 20分鐘，將反應(yīng)液倒入培養(yǎng)皿中，在室溫下通風(fēng)干燥48 72小時，得到雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混材料膜片，然后將膜片在0. I 0. 5mol/L氫氧化鈉溶液中浸泡0. 5 I小時，再用去離子水沖洗膜片，30 40°C下干燥12 24小時，得到所述采用雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混生物材料。采用雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混生物材料在皮膚敷料、傷口愈合劑，或人工皮膚方面的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是
I)本發(fā)明采用雙生物酶(微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和酪氨酸酶)對明膠與殼聚糖共混材料進(jìn)行修飾，不僅具有生物酶修飾方法的優(yōu)點(diǎn)，并且由于本材料采用兩種酶的協(xié)同修飾作用，與單獨(dú)使用一種生物酶作為修飾劑相比還具有如下優(yōu)點(diǎn)微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可以使明膠分子中的Y-谷氨酸上的羥酰胺基和賴氨酸上的ε-氨基之間發(fā)生結(jié)合反應(yīng)從而形成網(wǎng)狀交聯(lián)，而酪氨酸酶通過將明膠分子中的酪氨酸殘基氧化成醌類殘基，然后和殼聚糖分子中的氨基反應(yīng)形成共價連接。因此，通過兩種生物酶的協(xié)同作用，不僅能夠?qū)⒚髂z分子與殼聚糖分子形成穩(wěn)定的共價連接，同時也形成穩(wěn)定的網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)，從而大大提高材料的穩(wěn)定性。此外，這種通過雙生物酶的協(xié)同修飾作用形成的共價連接和網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)，還能夠增強(qiáng)材料的力學(xué)機(jī)械性能，而材料的穩(wěn)定性能和力學(xué)機(jī)械性能提高，就能夠大大擴(kuò)展材料在生物醫(yī)用材料和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的用途和應(yīng)用范圍。并且，由于微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶價廉易得，因此采用雙生物酶(微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和酪氨酸酶)作為修飾劑可以在提高材料穩(wěn)定性能和力學(xué)性能的同時，還可以有效降低材料的生產(chǎn)成本。2)本發(fā)明所制備的生物材料全部由生物大分子構(gòu)成，其中共混主體材料采用的是明膠和殼聚糖，修飾劑采用的是生物酶，因此這種全部由生物大分子構(gòu)成的生物材料具有良好的生物相容性，且無細(xì)胞毒性。3)明膠是自然界來源豐富的蛋白質(zhì)類生物大分子材料，殼聚糖是自然界來源豐富的多糖類生物大分子材料，均具有良好的生物相容性、無毒、可生物降解、可被人體吸收以及價格低廉等優(yōu)點(diǎn)，殼聚糖還具有獨(dú)特的廣譜抗菌性能，這種由蛋白質(zhì)和生物多糖共混制備的材料，可以形成材料各組分之間的優(yōu)勢互補(bǔ)，不僅有利于提高明膠基材料的機(jī)械性能，特別是有利于改善明膠基材料易滋生和感染細(xì)菌的缺點(diǎn)。 4)酶作為生物修飾劑，避免了采用傳統(tǒng)化學(xué)修飾劑存在的生物相容性差、毒性大的問題；不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)步驟簡單，并且酶具有高效性和專一性。5)本發(fā)明的制備方法簡單，易于控制，無毒副作用，制備條件溫和。6)本發(fā)明采用雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混生物材料，在生物醫(yī)用材料和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的用途，特別是在降低感染和炎癥反應(yīng)、抗菌、保護(hù)傷口、可生物降解的皮膚敷料和傷口愈合劑，以及人工皮膚等生物醫(yī)用材料和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景和十分廣泛的用途。


圖I是未采用生物酶修飾、單獨(dú)采用一種酶修飾、以及實施例I所得的采用微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和酪氨酸酶修飾的明膠與殼聚糖共混材料的拉伸強(qiáng)度的對比圖，其中G/CS代表未采用生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混材料，m-G/CS代表微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾的明膠與殼聚糖共混材料，t-G/CS代表酪氨酸酶修飾的明膠與殼聚糖共混材料，mt-G/CS代表雙生物酶(微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和酪氨酸酶)修飾的明膠與殼聚糖共混材料。圖2是明膠材料，以及實施例I得到的采用雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混材料對大腸桿菌的抑菌效果對比圖，其中Control代表未加入樣品的空白對照組，G代表未修飾的明膠材料，mt-G/CS代表雙生物酶(微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和酪氨酸酶)修飾的明膠與殼聚糖共混材料。圖3是明膠材料，以及實施例I得到的采用雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混材料對金黃色葡萄球菌的抑菌效果對比圖，其中Control代表未加入樣品的空白對照組，G代表未修飾的明膠材料，mt-G/CS代表雙生物酶(微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和酪氨酸酶)修飾的明膠與殼聚糖共混材料。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，當(dāng)然下述實施例不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。本發(fā)明提供一種采用雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混生物材料，它完全采用生物大分子材料作為共混材料及修飾劑構(gòu)成，共混主體材料采用的是明膠和殼聚糖，然后同時采用兩種生物酶，即微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和酪氨酸酶作為修飾劑，對明膠和殼聚糖共混生物材料進(jìn)行修飾后得到。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明制備方法作進(jìn)一步說明，但不限定本發(fā)明。實施例I :
一種采用雙生物酶修飾明膠與殼聚糖共混生物材料的制備方法，它包括如下具體步
驟
I)溶液的配制
稱取2g明膠加入到50mL去離子水中，在50°C的水浴中攪拌I小時至明膠完全溶解得到濃度為O. 04g/mL的明膠溶液；稱取Ig殼聚糖加入到50mL 1% (體積百分比v/v%)乙酸溶液中，室溫下攪拌3小時至殼聚糖充分溶解，得到濃度為O. 02g/mL的殼聚糖溶液，向殼聚糖溶液中緩慢滴加lmol/L氫氧化鈉溶液至溶液的pH為5. 5 ;將微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶加入到 去離子水中室溫下攪拌10分鐘，再過濾得到2U/mL的微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶溶液；將酪氨酸酶加入到PBS (pH7. O)緩沖溶液中，室溫下攪拌2分鐘，得到1000U/mL的酪氨酸酶溶液。2)明膠與殼聚糖的共混
分別量取50 mL上述配制的明膠溶液和殼聚糖溶液等體積混合，50°C下攪拌30分鐘，使溶液混合均勻，得到明膠與殼聚糖共混溶液。3)雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混材料的制備
向IOOmL明膠與殼聚糖的共混溶液中加入4U微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和5000U酪氨酸酶，在28°C下攪拌反應(yīng)15分鐘，將反應(yīng)液倒入培養(yǎng)皿中，在室溫下通風(fēng)干燥72小時，得到雙生 物酶修飾的明膠與殼聚糖共混材料膜片，然后將膜片在O. lmol/L氫氧化鈉溶液中浸泡0. 5小時，再用大量去離子水沖洗膜片，30°C下干燥12小時，得到采用雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混生物材料。圖I是未采用生物酶修飾、單獨(dú)采用一種酶修飾、以及實施例I所得的采用微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和酪氨酸酶修飾的明膠與殼聚糖共混材料的拉伸強(qiáng)度的對比圖。測試過程為選取平整、潔凈、無缺陷的材料薄膜，將其裁成70mmX IOmm的橫條。測量薄膜厚度，每個試樣在標(biāo)距內(nèi)測量六個點(diǎn)，取其平均值，作為膜的厚度。將試樣置于相對濕度約為50%的干燥器中，放置于25°C條件下平衡24小時。然后采用萬能試驗機(jī)(CMT-6503，深圳新三思材料檢測有限公司)進(jìn)行力學(xué)性能測定，初始夾距設(shè)定為30mm，拉伸速率設(shè)定為40mm/min。不同樣品的力學(xué)性能都平行做6個樣，取6次結(jié)果的平均值。從圖I中可以看出，未采用生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混材料G/CS的拉伸強(qiáng)度為30. 75MPa，而單獨(dú)采用微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶修飾的明膠與殼聚糖共混材料m_G/CS的拉伸強(qiáng)度為43. 09MPa，單獨(dú)采用酪氨酸酶修飾的明膠與殼聚糖共混材料t_G/CS的拉伸強(qiáng)度為39. 97MPa，這說明單獨(dú)采用一種生物酶(微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或酪氨酸酶)修飾的明膠與殼聚糖共混材料的拉伸強(qiáng)度得到提高。采用雙生物酶(微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和酪氨酸酶)共同修飾的明膠與殼聚糖共混材料mt-G/CS的拉伸強(qiáng)度為50. 06MPa，與G/CS相比拉伸強(qiáng)度提高了 62. 80%,以上結(jié)果表明，本發(fā)明采用的雙生物酶修飾方法能夠明顯提高明膠與殼聚糖共混材料的力學(xué)性能。圖2是明膠材料，以及實施例I得到的采用雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混材料對大腸桿菌的抑菌效果對比圖。其測試過程參考中華人民共和國輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 2591-2003《抗菌塑料一抗菌性能測試方法和抗菌效果》。具體測試過程為將新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物(24小時內(nèi)轉(zhuǎn)接的)，加入培養(yǎng)液中，依次做10倍遞增稀釋，選擇菌液濃度為(5. O 10. 0)X105 CFU/mL的稀釋液作為試驗用菌液。在每個培養(yǎng)管中加入2mL菌液，分別加入I片明膠膜片和采用雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混膜片，而不加入膜片的培養(yǎng)管作為空白對照組，在37°C恒溫振蕩培養(yǎng)24小時后，用平板計數(shù)法計算出菌落數(shù)目。每組數(shù)據(jù)做兩次平行實驗，每個樣品做三個平行抗菌測試。其中抗菌率(％)=(空白對照樣品平均回收菌數(shù)-抗菌樣品平均回收菌數(shù))/空白對照樣品平均回收菌數(shù)X 100%。從圖2可以看出，Control代表的未加入樣品的空白培養(yǎng)基經(jīng)過過夜培養(yǎng)后大腸桿菌的濃度為6. 48 X 107CFU/mL,而G代表的加入未修飾的明膠材料經(jīng)過過夜培養(yǎng)后的大腸桿菌濃度為8. 22X 107CFU/mL，這說明未修飾的明膠基材料不僅不具有對大腸桿菌的抗菌活性，相反它能夠促進(jìn)大腸桿菌的生長和繁殖。mt-G/CS代表的加入雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混材料經(jīng)過過夜培養(yǎng)后的大腸桿菌濃度為5. 70X 107CFU/mL,與未修飾的明膠材料G相比，抗菌率提高了 30. 66%。以上結(jié)果表明，本發(fā)明所得到的雙生物酶修飾的明膠與殼 聚糖共混材料對大腸桿菌具有抗菌活性。圖3是明膠材料，以及實施例I得到的采用雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混材料對金黃色葡萄球菌的抑菌效果對比圖。其測試過程參考中華人民共和國輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 2591-2003《抗菌塑料一抗菌性能測試方法和抗菌效果》。具體測試過程為將新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物(12小時內(nèi)轉(zhuǎn)接的)，加入培養(yǎng)液中，依次做10倍遞增稀釋，選擇菌液濃度為(I. O 5. O) X 109CFU/mL的稀釋液作為試驗用菌液。在每個培養(yǎng)管中加入3mL菌液，分別加入I片明膠膜片和采用雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混膜片，而不加入膜片的培養(yǎng)管作為空白對照組，在37°C恒溫振蕩培養(yǎng)12小時后，用平板計數(shù)法計算出菌落數(shù)目。每組數(shù)據(jù)做兩次平行實驗，每個樣品做三個平行抗菌測試。其中抗菌率(％)=(空白對照樣品平均回收菌數(shù)-抗菌樣品平均回收菌數(shù))/空白對照樣品平均回收菌數(shù)X100%。從圖3可以看出，Control代表的未加入樣品的空白培養(yǎng)基經(jīng)過過夜培養(yǎng)后金黃色葡萄球菌的濃度為2. 79X 10nCFU/mL，而G代表的加入未修飾的明膠材料經(jīng)過過夜培養(yǎng)后的金黃色葡萄球菌濃度為3. 71X10nCFU/mL，這說明未修飾的明膠基材料不僅不具有對金黃色葡萄球菌的抗菌活性，相反它能夠促進(jìn)金黃色葡萄球菌的生長和繁殖。mt-G/CS代表的加入雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混材料經(jīng)過過夜培養(yǎng)后的金黃色葡萄球菌濃度為2. 26X10nCFU/mL，與未修飾的明膠材料G相比，抗菌率提高了 39. 08%。以上結(jié)果表明，本發(fā)明所得到的雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混材料對金黃色葡萄球菌具有抗菌活性。實施例2
一種采用雙生物酶修飾明膠與殼聚糖共混生物材料的制備方法，它包括如下具體步
驟
I)溶液的配制
稱取3g明膠加入到50mL去離子水中，在40°C的水浴中攪拌I. 5小時至明膠完全溶解得到濃度為O. 06g/mL的明膠溶液；稱取I. 5g殼聚糖加入到50mL 1% ((體積百分比v/v%)乙酸溶液中，室溫下攪拌4小時至殼聚糖充分溶解，得到濃度為O. 03g/mL的殼聚糖溶液，向殼聚糖溶液中緩慢滴加O. 5mol/L氫氧化鈉溶液至溶液的pH為5. 5 ;將微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶加入去離子水中溫下攪拌15分鐘，再過濾得到2U/mL的微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶溶液；將酪氨酸酶加入PBS(pH7. O)緩沖溶液中，室溫下攪拌3分鐘，得到1000U/mL的酪氨酸酶溶液。2)明膠與殼聚糖的共混
分別量取50 mL上述配制的明膠溶液和殼聚糖溶液等體積混合，40°C下攪拌30分鐘，使溶液混合均勻，得到明膠與殼聚糖共混溶液。3)雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混材料的制備
向IOOmL明膠與殼聚糖的共混溶液中加入6U微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和3000U酪氨酸酶，在28°C下攪拌反應(yīng)20分鐘，將反應(yīng)液倒入培養(yǎng)皿中，在室溫下通風(fēng)干燥48小時，得到雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混材料膜片，然后將膜片在O. 2mol/L氫氧化鈉溶液中浸泡45分鐘，再用大量去離子水沖洗膜片，35°C下干燥18小時，得到一種采用雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混生物材料。實施例3
一種采用雙生物酶修飾明膠與殼聚糖共混生物材料的制備方法，它包括如下具體步
驟
I)溶液的配制
稱取6g明膠加入到IOOmL去離子水中，在60°C的水浴中攪拌I. 5小時至明膠完全溶解得到濃度為O. 06g/mL的明膠溶液；稱取2g殼聚糖加入到IOOmL 1% ((體積百分比v/v%)乙酸溶液中，室溫下攪拌5小時至殼聚糖充分溶解，得到濃度為O. 02g/mL的殼聚糖溶液，向殼聚糖溶液中緩慢滴加O. 8mol/L氫氧化鈉溶液至溶液的pH為5. 5 ;將微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶加入去離子水室溫下攪拌20分鐘，再過濾得到2U/mL的微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶溶液；將酪氨酸酶加入PBS (pH7. O)緩沖溶液中，室溫下攪拌5分鐘，得到1000U/mL酪氨酸酶溶液。
2)明膠與殼聚糖的共混
分別量取IOOmL上述配制的明膠溶液和殼聚糖溶液等體積混合，60°C下攪拌30分鐘，使溶液混合均勻，得到明膠與殼聚糖共混溶液。3)雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混材料的制備
向100 mL明膠與殼聚糖的共混溶液中加入8U微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和4000U酪氨酸酶，在30°C下攪拌反應(yīng)10分鐘，將反應(yīng)液倒入培養(yǎng)皿中，在室溫下通風(fēng)干燥60小時，得到雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混材料膜片，然后將膜片在0. 5mol/L氫氧化鈉溶液中浸泡I小時，再用大量去離子水沖洗膜片，40°C下干燥24小時，得到采用雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混生物材料。需要說明的是，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
1.一種采用雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混生物材料，其特征在于，所述雙生物酶分別為微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和酪氨酸酶。
2.如權(quán)利要求I所述的采用雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混生物材料的制備方法，其特征在于，它包括如下具體步驟 1)溶液的配制 按明膠去離子水=2 6g:50 lOOmL，選取明膠和去離子水，備用；將明膠加入到去離子水中，在40 60°C的水浴中攪拌I 2小時至明膠充分溶解后得到明膠溶液； 按殼聚糖1% (體積百分比)乙酸溶液=1 2g:50 IOOmL,選取殼聚糖和乙酸溶液，備用；將殼聚糖加入到乙酸溶液中，室溫下攪拌3 5小時至殼聚糖充分溶解，然后向溶液中滴加O. 5 I. Omol/L氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH為5. O 6. 0，得到殼聚糖溶液； 按微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶去離子水=10 20U:5 10mL，選取微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和去離子水，備用；將微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶加入到去離子水中，室溫下攪拌15 30分鐘充分溶解，再過濾得到微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶溶液； 按酪氨酸酶pH為7. O的PBS緩沖溶液=5000 10000U: 5 10mL，選取酪氨酸酶和pH為7. O的PBS緩沖溶液，備用；將酪氨酸酶溶于所述pH為7. O的PBS緩沖溶液中，室溫下攪拌2 5分鐘至酪氨酸酶充分溶解后得到酪氨酸酶溶液； 2)明膠與殼聚糖的共混 按明膠溶液殼聚糖溶液=50 IOOmL:50 IOOmL,選取上述配制的明膠溶液和殼聚糖溶液，備用；將明膠溶液和殼聚糖溶液等體積混合，40 60°C下攪拌15 30分鐘，使溶液混合均勻，得到明膠與殼聚糖共混溶液； 3)雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混材料的制備 按明膠與殼聚糖共混溶液微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酪氨酸酶=50 100mL:3 8U:3000 7000U，選取上述明膠與殼聚糖共混溶液、微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和酪氨酸酶，備用；向明膠與殼聚糖共混溶液中加入上述微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和酪氨酸酶，在28 30°C下攪拌反應(yīng)10 20分鐘，將反應(yīng)液倒入培養(yǎng)皿中，在室溫下通風(fēng)干燥48 72小時，得到雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混材料膜片，然后將膜片在0. I 0. 5mol/L氫氧化鈉溶液中浸泡0. 5 I小時，再用去離子水沖洗膜片，30 40°C下干燥12 24小時，得到所述采用雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混生物材料。
3.如權(quán)利要求I所述的采用雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混生物材料在皮膚敷料、傷口愈合劑，或人工皮膚方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種采用雙生物酶修飾的明膠與殼聚糖共混生物材料及其制備方法與應(yīng)用。該共混生物材料包括作為共混主體的明膠和殼聚糖以及作為修飾劑的微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和酪氨酸酶。該共混生物材料的穩(wěn)定性增加，機(jī)械性能得到改善，并且該材料具有抗菌活性，在降低感染和炎癥反應(yīng)、抗菌、保護(hù)傷口、可生物降解的皮膚敷料和傷口愈合劑，以及人工皮膚等生物醫(yī)用材料和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景和十分廣泛的用途，同時該材料制備工藝簡單，易于控制，無毒副作用，制備條件溫和。
文檔編號A61L27/22GK102824654SQ20121033280
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月11日
發(fā)明者王藝峰, 王燕梅, 吳仲巋, 陳艷軍, 熊燕飛 申請人:武漢理工大學(xué)