一種特異抑制腫瘤細胞轉移的新型靶向肽tmtp1-kla的制備與應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種特異抑制腫瘤細胞轉移的新型靶向肽TMTP1-KLA的制備與應用，其技術特征在于：制備一種能夠同時識別高轉移潛能腫瘤細胞并可抑制腫瘤細胞生長與轉移的多肽TMTP1-GG-D(KLAKLAK)2，該多肽可將抗菌肽特異性地輸送到惡性腫瘤組織及轉移灶局部，以選擇性的殺傷具有高轉移潛能的腫瘤細胞，而沒有明顯的毒副作用，有效抑制腫瘤的生長與轉移，有望成為一種抗腫瘤新藥，可以解決目前腫瘤分子靶向治療技術和實踐中關鍵的不足之處。本發明的目的，在于提供一種能夠同時特異性識別和抑制具有高轉移潛能傾向的腫瘤細胞的多肽，從而克服現有靶向性藥物存在副作用大、特異性不強等問題，以期在臨床治療中發揮高效、特異的腫瘤抑制和殺滅作用，使這一新的多肽可達到更大程度上靶向性殺滅腫瘤細胞的治療目的，此外，本發明也將為后繼其他分子治療提供一種新的設計模式。
【專利說明】一種特異抑制腫瘤細胞轉移的新型靶向肽TMTP1-KLA的制備與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種特異抑制腫瘤細胞轉移的新型靶向肽TMTP1-KLA的制備與應用，其技術特征在于:制備一種能夠同時識別高轉移潛能腫瘤細胞并可抑制腫瘤細胞轉移的多肽TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2，該多肽可以選擇性的殺傷具有高轉移潛能的腫瘤細胞，而沒有明顯的毒副作用，有效抑制腫瘤的生長與轉移。
【發明內容】
屬于蛋白質多肽領域。
【背景技術】
[0002]惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的一類疾病。確切證據表明，90%以上的惡性腫瘤患者最終死于腫瘤轉移或復發。近年來，腫瘤治療取得了長足進步，特別是對白血病、惡性淋巴瘤等的治療有了突破，但對危害人類生命健康最嚴重的、占惡性腫瘤大多數的實體瘤(如卵巢癌、胃癌、肝癌等)的治療未能達到滿意的效果。傳統的惡性腫瘤治療模式(手術、放療、化療)雖然是目前腫瘤治療的主要手段，但尚無法做到從根本上清除腫瘤，且由于缺乏特異性，在取得療效的同時也往往帶來較大的毒副作用。隨著生物技術的革命性進展和對惡性腫瘤發生發展分子機制的深入研究，臨床醫學包括腫瘤學發生了重大變革，具有較低不良反應和良好療效的分子靶向治療越來越受到國內外學者的重視，代表了腫瘤治療的未來趨勢。
[0003]腫瘤分子靶向治療是利用具有一定特異性的載體，將藥物或其他殺傷腫瘤細胞的活性物質選擇性地運送到腫瘤部位，把治療作用或藥物效應盡量限定在特定的靶細胞、組織或器官內，而不影響正常細胞、組織或器官的功能，從而提高療效、減少毒副作用的一種方法，又稱為“導彈治療”。目前腫瘤分子靶向治療的手段主要有兩類:單克隆抗體和靶向性多肽(Homing peptide)。癌癥治療性抗體目前已有近10年歷史,第一種應用此技術制備的抗體在美國已通過FDA的認證。我們知道，單鏈抗體(ScFv)在臨床應用中具有巨大的潛力，然而快速的血漿清除及大量生產的困難限制了它的實際應用。Afanasieva TA等利用噬菌體抗體庫篩選并獲得了一種抗VEGF的單鏈抗體(ScFv — V65)。動物實驗證明，這種抗體在荷瘤鼠體內可以明顯抑制腫瘤生長，與對照組比較達50%。之后，他們對腺病毒進行改造，使之能編碼、合成ScFv - V65，這樣表達出來的ScFv — V65融合蛋白其半衰期明顯延長，血漿清除率降低。當給荷瘤小鼠應用這種重組病毒后，其腫瘤生長明顯受到限制；當重復多次系統給藥時，這種抑制作用更為明顯。實驗證明，ScFv作為一種新的基因治療方法，克服了傳統抗體治療的許多局限性，具有廣闊的應用前景。針對腫瘤抗原設計的單克隆抗體，業已成為腫瘤導向治療中最常用的載體，但這些單克隆抗體的種類卻非常有限，并且在實際應用中還存在以下缺點:①體積較大，在腫瘤組織、細胞中穿透力較弱，并可被肝臟及網狀內皮系統非特異性攝取、吞噬對肝臟、骨髓的劑量相關毒性作用免疫原性強。
[0004]而靶向性多肽是目前認為比較理想的一種腫瘤靶向性治療的載體，它們具有:①血漿清除速度快、高親和力、高特異性；②良好的組織穿透性，能被腫瘤細胞攝??；③易于化學合成并且低免疫原性的特點，可減少、避免上述單克隆抗體的不足。因而近年來，許多學者將目光轉向應用肽庫技術尋找能與腫瘤細胞、腫瘤血管內皮細胞特異性結合的短肽，以達到靶向腫瘤的目的。肽庫技術是將基因型、表型及分子結合活性與噬菌體/細菌的可擴增性結合在一起，是一種高效的篩選技術。目前已成功的應用于抗原表位分析、單抗篩選、蛋白質功能拮抗多肽或模擬多肽的確定等方面。Arap W等對乳腺癌荷瘤小鼠進行肽庫篩選后獲得一系列與腫瘤血管特異性結合的短肽，其中的R⑶序列被證實可與α V整合素結合。將RGD序列與阿霉素交聯后應用于荷瘤小鼠，發現藥物的抗腫瘤療效顯著增加而毒性作用明顯減少。Laakkonen P等利用噬菌體肽庫篩選獲得靶向乳腺癌腫瘤及其淋巴結轉移灶的導向性多肽LyP-Ι，為早期診斷腫瘤及其轉移灶靶向性治療奠定了基礎。KarassevaN等發現了可與上皮生長因子受體一 2 (ErbB-2)特異性結合的6肽KCCYSL，它可特異性與乳腺癌及前列腺癌細胞系結合，而與正常細胞則無結合。另外，Noda K等利用噬菌體肽庫技術篩選并獲得了能與腫瘤細胞表面碳水化合物抗原(carbohydrate antigens)特異性結合的肽段。Peletskaya EN等報道了利用肽庫技術篩選與Thomsen-Friedenreich (TF)腫瘤相關抗原特異性結合的肽段。TF抗原在大約90%的原發癌灶、淋巴瘤以及它們的轉移灶細胞表面表達，并與腫瘤轉移能力增強有關。而Landon LA等則通過一系列的改造，大大增強了篩選獲得的肽段與TF抗原的親和力及其水溶性。
[0005]抗菌肽是一種天然免疫系統中的小分子多肽，具有抗腫瘤活性，熱穩定性好、水溶性好、選擇性強、毒副反應低、無免疫原性、作用迅速、抗菌譜廣、不易產生耐藥性等優點，不僅可以抑殺細菌、真菌、病毒和寄生蟲，對多種癌細胞、轉化細胞和實體瘤也有明顯的抑制作用，在腫瘤的分子靶向治療中具有重要意義。目前已發現98種抗菌肽具有抗腫瘤活性，這些抗菌肽一般由12~55個氨基酸殘基組成。與傳統的抗腫瘤化療藥物相比，抗菌肽可以選擇性作用于腫瘤細胞，對正常細胞損傷小，對人體幾乎沒有毒性，而且不易產生耐藥性，其為人們獲得一種理想的化療藥物帶來了希望。利用腫瘤的表面分子為靶點，將特異性分子與抗菌肽結合，由其介導抗菌肽與腫瘤細胞結合，可達到特異性殺傷腫瘤的效應。Warren等針對前列腺腫瘤特異性抗原PSMA設計出被2個Y谷氨酰修飾的穿孔肽，對PSMA陽性的前列腺細胞有高度的溶細胞活性，對PSMA陰性的細胞沒有作用。β LH的片段與horl4的復合物，可以選擇性殺傷卵巢癌細胞。蛋白轉運體也可用來轉運抗菌肽，Jeffrey等將抗菌肽1)(1(1^1(1^1()2與載體2?1025結合，經注射后對實體瘤產生了很好的抑制效果。Ellerby等人將抗菌肽序列d(KLAKLAK)2與血管定位序列組合，該定位抗菌肽通過線粒體途徑誘導血管生成性內皮細胞凋亡,體內裸鼠實驗`表明該抗菌肽引起腫瘤細胞凋亡和壞死，Chen等報道了 RGD-tachyplesin誘導腫瘤細胞和內皮細胞的凋亡，該凋亡受Fas死亡受體途徑和線粒體途徑共同調控，Mai等人將抗菌肽序列d(KLAKLAK)2與蛋白轉導序列PTD結合，該抗菌肽在體外可迅速誘導一系列腫瘤細胞凋亡，并且可以通過定位注射引起體內實體瘤的凋亡，因此認為該抗菌肽可用于臨床治療可觸及的實體瘤，并可用于放療、免疫治療和基礎化學治療的聯合輔助治療。
[0006]在前期研究工作中，我們利用細菌鞭毛肽庫對具有不同轉移潛能的前列腺癌細胞進行正負篩選，獲得一段5肽序列，命名為“TMTP1”;令人驚喜的是，TMPl肽對高轉移前列腺癌腫瘤、高轉移潛能的乳腺癌具有很好的靶向能力；此外，TMTPl肽對前列腺癌的自發肝轉移灶即使直徑僅有Imm亦有很好的識別能力。實驗結果表明，我們通過肽庫技術篩選獲得的TMTPl是一種靶向性良好的腫瘤導向肽，有望應用于惡性腫瘤及其轉移灶的早期診斷及治療。本發明在前期工作基礎上將特異性殺傷腫瘤的抗菌肽序列d(KLAKLAK)2與TMTPl融合，可將抗菌肽特異性地輸送到惡性腫瘤組織及轉移灶局部，靶向性地殺滅腫瘤細胞，減輕對正常組織的毒副作用，有望成為一種抗腫瘤新藥，迄今尚未見有相關報道。
[0007]本發明的目的，在于提供一種能夠同時特異性識別和抑制具有高轉移潛能傾向的腫瘤細胞的多肽，從而克服現有靶向性藥物存在副作用大、特異性不強等問題，以期在臨床治療中發揮高效、特異的腫瘤抑制和殺滅作用。

【發明內容】

[0008]基于以上技術背景和重大的醫療需求，本發明提供了一種嵌合的促進高轉移潛能腫瘤細胞凋亡的靶向性多肽，其含有與一種抗微生物肽連接的高轉移潛能腫瘤細胞導向肽。通過該方案獲得的靶向性多肽具有高效靶向抑制高轉移潛能腫瘤生長與增殖、可有效抑制其轉移等明顯優勢，而對正常的細胞或組織沒有明顯的毒副作用，可以解決目前腫瘤分子靶向治療技術和實踐中關鍵的不足之處。
[0009]本發明的技術方案是:一種嵌合的促進高轉移潛能腫瘤細胞凋亡的靶向性多肽，其特征是:它是由一個具有靶向高轉移潛能傾向的腫瘤導向肽TMTP1、兩個甘氨酸GG和一個抗菌肽D (KLAKLAK)2組成。
[0010]與現有的抗腫瘤多肽相比，本發明達到了以下效果:
I本靶向性多肽是由一個具有靶向高轉移潛能傾向的腫瘤導向肽TMTPl及抗菌肽d(KLAKLAK)2構建而成，在理論和實際上達到了抗微生物肽殺傷效應的同時盡可能提高腫瘤導向肽TMTPl靶向特性的效果。由于這種全新的設計，使這一新的多肽可達到更大程度上靶向性殺滅腫瘤細胞的治療目的，此外，本發明也將為后繼其他分子治療提供一種新的設計模式。
[0011]2對腫瘤細胞系及正常對照細胞體外實驗結果表明，該靶向性多肽對正常細胞無明顯影響，而對于有高轉移潛能的腫瘤細胞，包括前列腺癌和胃癌，有顯著的抑制增殖和誘導凋亡的效應。
[0012]3對腫瘤動物模型的體內研究證實，通過腹腔注射的用藥途徑，該靶向性多肽對受試的所有腫瘤動物模型均具顯著的治療作用，并可有效抑制腫瘤轉移，且對動物無明顯的治療相關毒性。
[0013]4制備出腫瘤導向肽與抗菌肽的靶向性多肽，作為一種有效的抗腫瘤藥物，可發揮抗腫瘤的協同作用，使其既具有抗菌肽高效毒性效應的優點，又能在高轉移潛能腫瘤組織富集，從而進一步降低新型抗腫瘤多肽的臨床用藥量，提高量效比，降低毒副作用。應用于研究在體外和體內對細胞增殖、分化、轉移和凋亡的影響，以及具有易發生轉移的惡性腫瘤如前列腺癌、胃癌的輔助治療。
[0014]四、【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1、抗腫瘤多肽的構建示意圖；
圖2、抗腫瘤多肽體內外對腫瘤細胞的靶向識別作用；
圖3、抗腫瘤多肽抑制腫瘤細胞的增殖；
圖4、抗腫瘤多肽鏡下誘導腫瘤細胞凋亡的形態學改變；
圖5、抗腫瘤多肽流式細胞儀檢測誘導腫瘤細胞凋亡的作用；圖6、抗腫瘤多肽抑制腫瘤細胞侵襲與轉移的作用；
圖7、抗腫瘤多肽體內抗腫瘤生長作用；
圖8、抗腫瘤多肽體內對腫瘤轉移的抑制作用
五、【具體實施方式】:
以下結合附圖和實施例對本發明作進一步的詳細描述。
[0015]依照本發明的技術方案制備的一種嵌合的促進高轉移潛能腫瘤細胞凋亡的靶向性多肽，它是由一個具有靶向高轉移潛能傾向的腫瘤導向肽TMTPl、兩個甘氨酸GG和一個抗菌肽D (KLAKLAK)2組成。
[0016](一)TMTPl-GG-D (KLAKLAK)2 多肽的設計與合成:
在TMTPl的N端和C端分別加上一個甘氨酸和一個半胱氨酸，并利用兩個半胱氨酸氧化成二硫鍵，形成環肽結構，序列如下:GCGNVVRQGC-GG- (KLAKLAK-KLAKLAK) d。cys 二硫鍵環化，使TMPl具有更穩定的空間構象；(KLAKLAK-KLAKLAK) d用右旋氨基酸。用無菌水溶解合成的TMTP1-GG-d(KLAKLAK)2多肽，分裝后一 20°C保存。
[0017](二)TMTPl-GG-D(KLAKLAK)2多肽對多種高轉移性腫瘤細胞靶向識別效應的體內外研究
1.細胞培養
I)用棉手套從液氮內取出保種的PC-3M-1E8，MKN-45，小鼠成纖維細胞NIH 3T3細胞，人正常肝細胞系L02，人正常乳腺細胞MCF-10A，HEK293細胞，迅速放入37°C水浴鍋內搖動，快速解凍。
[0018]2)待細胞完全解凍為懸液后，800rpm，室溫離心5分鐘，用75%乙醇噴灑消毒，超凈細胞臺內用Iml加樣槍小心吸棄凍存液，加新鮮RPMI1640培養基重懸細胞沉淀，轉入細胞培養瓶內，補RPMI1640培養基至總體積約6ml。置37°C，5%C02培養箱培養。
[0019]3)次日在倒置顯微鏡下觀察，可見細胞貼壁良好，只有少許死亡細胞懸浮在培養液中，吸棄陳舊培養基，進行首次換液，置培養箱繼續培養。
[0020]4)48小時后再次觀察，可見復蘇細胞融合已達80%_90%，準備傳代。吸棄舊培養基，用經高壓滅菌過的PBS輕柔洗2遍，加37 °C預熱了的0.25%胰酶，覆蓋培養瓶底，擰緊蓋子在顯微鏡下觀察，細胞界限變清楚，細胞開始變圓時，吸棄培養瓶內胰酶，擰好培養瓶的蓋子，放置I分鐘后，用吸管輕輕吹打細胞懸液使消化下來的細胞充分分散。并按1:3傳代，補足培養液，吹均勻后置37°C培養箱培養。
[0021]5) 2-3天換培養液一次。
[0022]6)選擇處于對數生長細胞進行體外效應實驗。
[0023]2.TMTP1-GG-d(KLAKLAK)2多肽的靶向識別效應的體外研究
1)1 μ I FITC標記的TMTPl-GG-D(KLAKLAK)2和FITC-錯序肽分別與PC-3M-lE8，MKN-45，小鼠成纖維細胞NIH 3T3細胞，人正常肝細胞系L02，人正常乳腺細胞MCF-10A，HEK293細胞孵育4小時，此后洗去未結合的多肽溶液，固定細胞，激光共聚焦顯微鏡下觀察。
[0024]可見FITC-GG-D(KLAKLAK)2與PC-3M-1E8，MKN_45細胞結合，顯示強膜熒光染色；而錯序肽與PC-3M-1E8細胞，MKN-45細胞無結合，僅顯示為背景染色；此外，FITC-TMP1與小鼠成纖維細胞NIH 3T3細胞，人正常肝細胞系L02，人正常乳腺細胞MCF-10A，HEK293細胞亦無結合，僅顯示為背景染色(圖2)。
[0025]3.原代裸鼠皮下瘤模型的建立
1)取處于對數生長期的PC-3M-1E8前列腺癌細胞和MKN-45胃癌細胞，用0.25%胰酶消化，800rpm離心5分鐘收集細胞，無菌PBS重懸細胞，通過計數板計數后調整細胞濃度。
[0026]2)將雄性裸鼠固定后，拿棉簽蘸碘伏消毒裸鼠左側大腿根部皮膚，用Iml注射器取200 μ 1PC-3M-1E8前列腺癌細胞懸液(濃度為1.5 X 101°/!)，注射到消毒過的皮下。即每只裸鼠接種3X IO6個細胞。共注射雄性裸鼠3只。
[0027]3)將雌性裸鼠固定后，拿棉簽蘸碘伏消毒裸鼠左側大腿根部皮膚，用Iml注射器取200 μ I MKN-45胃癌細胞懸液(濃度為I X 101°/!),注射到消毒過的皮下。即每只裸鼠接種2 X 106/L個細胞。共注射雌性裸鼠3只。
[0028]4)放入SPF環境中繼續飼養，每天觀察注射部位的腫瘤形成情況，待10天左右皮下腫瘤已經明顯形成后，隔天觀察腫瘤生長情況并用游標卡尺測量腫瘤最大徑及最小徑的值。
[0029]4.TMTP1-GG-d(KLAKLAK)2多肽的靶向識別效應的體內研究
1)PC-3M-1E8前列腺癌皮下瘤荷瘤小鼠尾靜脈注入FITC標記的TMTP1_GG_D (KLAKLAK)220 μ M，并于不同時段處死小鼠，左心室注射5ml PBS沖洗后，取腫瘤組織，行冰凍切片，冰無水乙醇:丙酮(I: I)固定，激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。
[0030]結果顯示:TMTP1-GG-D(KLAKLAK)2 20 μ M在荷瘤小鼠體內循環24h后，在腫瘤部位聚集，腫瘤組織切片可見較強熒光信號，結果說明:FITC- TMTP1-GG-d(KLAKLAK)2在體內亦有很好的腫瘤導向性，可靶向高轉移潛能的PC-3M-1E8前列腺癌和MKN-45胃癌。(圖2)。
[0031](三)TMTP1-GG-d(KLAKLAK)2多肽對多種高轉移性腫瘤細胞靶向殺傷效應的體外研
究
1.MTT (噻唑藍)實驗操作步驟:
I)消化上述對數生長期細胞，細胞計數板計數細胞懸液的濃度，調整細胞濃度，接種到96孔板，8000個/孔。
[0032]2)置37°C，5%C02溫箱培養培養過夜。
[0033]3)加入以下濃度的無菌多肽TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2: 5、10、15、20 μ M，每個濃度設3個復孔，同時各設3孔未加多肽的空白對照組及調零孔(無細胞，只有等體積的培養基)。置37°C，5%C02溫箱培養過夜。
[0034]4)24小時后，用加樣槍小心吸棄孔內上清，加入90 μ IRPMI1640培養液，接著加入10 μ g MTT 溶液(5mg/ml)。37。。，5%C02 溫箱培養 4h。
[0035]5)將96孔板置離心機內，常溫800rpm離心5分鐘。
[0036]6)加樣槍小心吸棄孔內液體。加入150 μ I 二甲基亞颯(DMSO)，置搖床上避光輕柔搖蕩巧分鐘，充分溶解結晶物。
[0037]7)上酶標儀檢測490nm波長處各孔的吸光值。
[0038]8)結果的處理，所有吸光值均以平均值士 SD表示。以各株細胞的空白對照孔吸光值為對照，計算不同多肽濃度作用下的平均細胞存活率(即處理組平均值:空白對照組平均值)。
[0039]實驗結果顯示:如圖3所示，TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2抗腫瘤多肽在不同作用濃度下(5-20 μ M)，劑量依賴性的顯著抑制腫瘤細胞的增殖，增加腫瘤細胞凋亡；20μΜTMTP1-GG-d(KLAKLAK)2引起95%的PE-3M-1E8細胞凋亡，幾乎100%MKN_45細胞凋亡，但是正常小鼠成纖維細胞NIH 3T3沒有明顯凋亡(約10%凋亡)。即TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2對前列腺癌PE-3M-1E8細胞劑量依賴性地發揮了劇烈的毒性作用，對胃癌MKN-45細胞也發揮了顯著的殺傷效應，而對小鼠成纖維細胞NIH 3T3沒有明顯的細胞毒性。
[0040]2.倒置顯微鏡及流式細胞儀檢測細胞凋亡 實驗步驟:
1)消化處于對數生長期的細胞，接種到6孔板內，調整細胞密度，使孔板內細胞融合度約 60%。
[0041]2)置37°C，5%C02溫箱培養培養過夜，使細胞貼壁。
[0042]3)加入工作濃度為 10 μ M 的 TMTPl-GG-D (KLAKLAK)2
4)為檢測TMTPl小分子多肽對細胞的毒性，另外分別加入3 μ g/mlTMTPl，同樣設不加處理因素的對照孔。
[0043]5)作用24小時后，在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態學變化。
[0044]6)用不含EDTA的胰酶小心消化收集細胞。
[0045]7)將消化收集的細胞37°C，800rpm離心5分鐘。棄上清，用磷酸鹽PBS重懸細胞調整濃度，收集I X IO5個細胞，再次800rpm離心5分鐘，用PBS重復洗細胞一次。
[0046]8)吸棄PBS，加凱基凋亡試劑盒中的Binding Buffer500 μ L重懸細胞。
[0047]9)加 Annexinv-FITC 5 μ L,輕柔混勻后，加 Propidium 1dide 5μ?,混勻。
[0048]10)常溫，避光反應10分鐘。
[0049]11) I小時內上流式細胞儀檢測。
[0050]12)調節流式細胞儀參數，將激發波長調到488nm;發射波長調到530nm。標記早期凋亡細胞的AnnexinV-FITC用FLIC通道檢測，標記壞死細胞的PI用FL3通道檢測。并用未加處理因素的空白對照細胞調節熒光補償，設定十字門，去除光譜重疊。
[0051]實驗結果顯示:如圖4所示，與未處理的對照組相比，10 μ M的TMTP1-GG-d(KLAKLAK)2作用后的MKN-45與PC-3M-1E8細胞明顯出現皺縮，體積變小，胞漿渾濁，染色質邊緣化，細胞間隙增大，體積縮小，細胞周緣模糊，細胞折光性整體減弱，胞漿濃縮，核染色質分布不均勻，偶見凋亡小體，細胞膜皺縮破裂等凋亡變化，作為對照的NIH 3T3細胞則沒有明顯光鏡下的變化。如圖5所示，與未處理的對照組相比，ΙΟμΜ的TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2顯著增加了 MKN-45與PC-3M-1E8細胞的凋亡率，并隨著作用時間的延長,凋亡率逐漸增加，48h達到高峰。
[0052]3.boyden 小室
1)消化處于對數生長期的細胞，接種到6孔板內，調整細胞密度，使孔板內細胞融合度約 60%。
[0053]2)置37°C，5%C02溫箱培養培養過夜，使細胞貼壁。
[0054]3)加入工作濃度為2 μ M的TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2，同樣設不加處理因素的對照孔。
[0055]4)作用12小時后，在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態學變化；用不含EDTA的胰酶小心消化收集細胞。
[0056]5)按 1:5無血清DMEM稀釋的基質膠Growth factor-reduced Matrigel 約 50 μ I/孔鋪于8 μ m孔徑的聚碳酸酯微孔濾膜上，37°C放置0.5h后轉置室溫下干燥過夜。
[0057]6) Boyden下室加入25 μ I的ΝΙΗ3Τ3細胞上清液，上室加入200 μ I細胞濃度為
2XlOVml的細胞懸液，每孔設3個復孔。
[0058]7)置37°C、5%C02溫箱中培養8h后，擦去上室上細胞，倒置膜片(膜朝上)，甲醇固定，蘇木素染色，計數侵過濾膜的細胞數。共計數中央和四周各5個視野(X200)，取平均值。
[0059]實驗結果顯示:如圖6所示，2μΜ的TMTPI _GG_D (KLAKLAK)2作用后的MKN-45與PC-3M-1E8細胞平均穿膜細胞數明顯低于對照組，提示遷移侵襲細胞數明顯減少，且差異有顯著性。
[0060](四)TMTP1-GG-d(KLAKLAK)2腫瘤靶向治療的體內研究
1.前列腺癌和胃癌皮下瘤模型的建立
I)原代前列腺癌/胃癌皮下瘤生長至約IcmX Icm時，取皮下瘤生長狀態好的前列腺癌和胃癌裸鼠各2只，頸椎脫白術處死荷瘤裸鼠，在超凈工作臺內用鋒利的無菌剪刀及鑷子剝離瘤體，置無菌生理鹽水中，去除結締組織，用剪刀將瘤體剪成約2mm3大小的瘤塊。
[0061]2)在超凈工作臺內抓牢固定待移植裸鼠，碘伏消毒左側大腿根部，手術刀小心劃開一長約3mm消毒過的皮膚，鑷子小心鈍性分離皮下組織，選一剪碎的瘤塊置入其中，4.0號手術縫線縫合皮膚。前列腺癌移植20只裸鼠，胃癌移植16只裸鼠。
[0062]3)放回SFP級動物房繼續飼養，每天觀察移植部位的腫瘤形成情況，待7天左右皮下腫瘤已經明顯形成后，隔天觀察腫瘤生長`情況并用游標卡尺測量腫瘤最大徑及最小徑的值。
[0063]2.前列腺癌和胃癌皮下瘤裸鼠分組處理
O當前列腺癌/胃癌皮下移植瘤生長至約3mmX3mm時，將15只前列腺癌荷瘤裸鼠隨機分為3組，每組5只，每組為一籠，做好標記。將12只胃癌荷瘤裸鼠隨機分為3組，每組4只，每組為一籠，做好標記。
[0064]2)前列腺癌/胃癌皮下移植瘤荷瘤裸鼠分別接受以下處理(均為腹腔注射):第一組:50 μ M PBS (空白對照組)，第二組；50 μ M PBS TMTPI,第三組；50 μ MTMTP1-GG-d (KLAKLAK)2。
[0065]3.每3天按上述方式處理一次，并且每次處理前先用游標卡尺測量腫瘤最大徑及最小徑的值。
[0066]4.處理21天(治療8次)后，將各組前列腺癌皮下移植瘤裸鼠用乙醚麻醉后，相機拍照。并按公式V = 4/X (d/2) 2X (D/2)計算每次測量的腫瘤體積，d代表腫瘤最小徑的值，D代表腫瘤最大徑的值，繪制腫瘤體積增長曲線。拍照后停止處理，繼續飼養，每天觀察，直至第一次處理后第46天，觀察各組荷瘤裸鼠死亡情況，記錄死亡每天觀察，繪制各組裸鼠生存曲線。
[0067]5.處理21天(治療8次)后，將各組胃癌皮下移植瘤裸鼠用乙醚麻醉后處死，剝離腫瘤，將各組腫瘤先用相機拍照，再用PBS洗凈血跡后置3.7%多聚甲醛浸泡，固定液與瘤體的體積比為10:1，送武漢谷歌生物技術有限公司進行石蠟包埋，4μπι切片。并按公式V=4/31 X (d/2) 2X (D/2)計算每次測量的腫瘤體積，d代表腫瘤最小徑的值，D代表腫瘤最大徑的值，繪制腫瘤體積增長曲線。[0068]6.胃癌原位模型的建立
I)原代胃癌皮下瘤生長至約IcmX Icm時，取皮下瘤生長狀態好的裸鼠2只，頸椎脫臼術處死荷瘤裸鼠，在超凈工作臺內用鋒利的無菌剪刀及鑷子剝離瘤體，置無菌生理鹽水中，去除結締組織，用剪刀將瘤體剪成約Imm3大小的瘤塊。
[0069]2)將12只預備造模的雌性裸鼠禁食12小時后，腹腔注射速眠新麻醉，碘伏和75%酒精消毒裸鼠左側及中部腹部皮膚，鑷子夾起消毒過的皮膚，剪刀剪開腹壁，在正中旁的左側打開腹腔，將胃用鑷子小心拉出，用縫針小心反復輕刺胃大彎側前壁的漿膜層3-5次，選取一剪碎的新鮮胃癌皮下瘤瘤塊置于此處，然后用5-0可吸收縫線將瘤塊縫在刺傷的胃大彎漿膜層上。按正常解剖位置將胃放回腹腔，用1-0縫線縫合腹壁及皮膚。擦凈血潰，放回紫外線消毒的籠子繼續在SPF級動物房飼養。
[0070]7.胃癌原位腫瘤的處理
I)胃癌原位移植瘤術后第7天，15只術后裸鼠隨機分為3組，每組5只，通過剪耳朵做好標記。
[0071]2)移植瘤裸鼠分別接受以下處理(均為腹腔注射):第一組:50μΜ PBS(空白對照組)，第二組；50 μ M PBS TMTPl，第三組；50 μ M TMTPI_GG_D (KLAKLAK)2。
[0072]3 )每3天按上述方式處理一次。
[0073]4)處理10次后乙醚麻醉處理裸鼠，解剖裸鼠，取出原位瘤，肝臟，脾臟及腹壁轉移瘤，照相機拍照后，取原位瘤及各組織中肉眼可見的轉移瘤，PBS洗凈血跡后置3.7%多聚甲醛浸泡，固定液與瘤體的體積比為10:1，進行石蠟包埋，4 μ m切片，石蠟切片HE染色。
[0074]5)記錄各組裸鼠原位瘤及轉移瘤的發生率，統計數據。
[0075] 實驗結果顯示:如圖7所示，結果顯示TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2多肽顯著抑制了 PC-3M-1E8前列腺癌皮下瘤及MKN-45胃癌原位移植腫瘤的生長并且顯著延長了荷瘤裸鼠的生存期。TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2多肽處理后，荷瘤裸鼠的腫瘤體積明顯比對照組荷瘤裸鼠的腫瘤體積小(P〈0.05)。與PC-3M-1E8前列腺癌皮下瘤的治療效果相似，TMTP1-GG-d(KLAKLAK)2靶向多肽顯著抑制了 MKN-45胃癌原位抑制腫瘤的體積，而對照組無明顯影響。
[0076]如圖8所示:對照組裸鼠的胃組織可見巨大的原位腫瘤，除TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2多肽處理組外，肝臟或脾臟上也可見明顯的白色轉移灶，腹壁也有較大的轉移瘤。如圖8所示，對照組裸鼠胃原位均100%發生腫瘤，80%發生肝轉移，40%發生脾轉移，60%發生腹壁轉移，20%發生腎臟轉移，60%發生腸系膜淋巴結轉移，而TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2多肽處理組裸鼠無肉眼可見肝脾腎轉移灶、腹壁轉移灶、腸系膜淋巴結轉移灶。
[0077]以上數據顯示，新型抗腫瘤多肽TMTP1-GG-d (KLAKLAK)2具有顯著抑制腫瘤的發生發展及抑制腫瘤轉移的效應，有望成為一種新型抗腫瘤藥物。
[0078]一種嵌合的促進高轉移潛能腫瘤細胞凋亡的靶向性多肽包括氨基酸序列如下: Gly-Cys-Gly-Asn-Val-Val-Arg-Gln-Gly-Cys—Gly-Gly-
D (Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Ala-Lys)
【權利要求】
1.一種特異抑制腫瘤細胞轉移的新型靶向肽TMTP1-KLA的制備與應用，其特征是:一種嵌合的促進高轉移潛能腫瘤細胞凋亡、抑制其轉移的靶向性多肽，它是由一個具有靶向高轉移潛能傾向的腫瘤導向肽TMTP1、兩個甘氨酸GG和一個抗菌肽D(KLAKLAK)2組成。
2.根據權利要求1所描述的多肽，其特征在于所述對具有靶向高轉移潛能傾向的腫瘤導向妝為 Gly-Cys-Gly-Asn-Val-Val-Arg-Gln-Gly-Cys,抗菌妝為 D(Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Ala-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Ala-Lys)。
3.權利要求1所述的新型靶向性多肽在體外抑制腫瘤的增殖、侵襲能力及誘導腫瘤細胞凋亡中的應用。
4.權利要求1所述的新型靶向性多肽在抗腫瘤生長及抑制腫瘤轉移中的用途。
【文檔編號】A61K38/10GK103656666SQ201210340385
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月14日 優先權日:2012年9月14日
【發明者】馬丁, 王世宣, 周劍峰, 奚玲, 馬湘一 申請人:深圳市奧尼克斯基因技術有限公司