專利名稱：一種連續(xù)梯度復(fù)合支架及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料及其制備領(lǐng)域，具體涉及用于骨軟骨缺損修復(fù)的連續(xù)梯度復(fù)合支架 及其制備方法。
背景技術(shù)：
天然骨軟骨為軟骨層、鈣化層和軟骨下骨層的多層次結(jié)構(gòu)，采用骨軟骨組織工程的方法修復(fù)骨軟骨缺損經(jīng)歷了單層支架、雙層支架和三層支架三個階段。單層支架的設(shè)計(jì)僅考慮到上層的軟骨層，忽略了下層的骨層，難以滿足天然骨軟骨的結(jié)構(gòu)要求，因此，構(gòu)建雙層支架修復(fù)骨軟骨缺損成為必然。雙層支架考慮到仿生模擬上層的軟骨結(jié)構(gòu)和下層的骨結(jié)構(gòu)，在治療骨軟骨缺損方面取得了一定的療效，但忽略了中間層一 I丐化層，雙層支架缺少了鈣化層這一中間層，很容易使軟骨和軟骨下骨分層，甚至使軟骨從軟骨下骨的骨面脫落，嚴(yán)重影響治療效果。為了進(jìn)一步完善支架的設(shè)計(jì)，研究者隨即開始了三層支架的研究，三層支架更精確的模擬了軟骨層-鈣化層-軟骨下骨層的結(jié)構(gòu)，向生物仿生的方向又邁進(jìn)了一
止/J/ O雙層支架和三層支架的構(gòu)建方法相似，各層支架分別制備，隨后采用膠粘、縫合等方式結(jié)合在一起。由于支架層間存在物理界面的缺陷，支架不是一個連續(xù)的整體，難以承受關(guān)節(jié)運(yùn)動時所產(chǎn)生的較大負(fù)荷，易使支架層間產(chǎn)生裂紋、剝落，進(jìn)而影響支架的整體力學(xué)性能和界面的生物功能，最終影響支架與周圍宿主組織之間的融合。因此，如何從根本上克服層間存在的界面問題是當(dāng)今多層支架面臨的共同問題。聚乙烯醇(PVA)水凝膠具有與關(guān)節(jié)軟骨相似的力學(xué)性能。但聚乙烯醇與周圍軟骨組織的整合性較差，制約了聚乙烯醇水凝膠的單獨(dú)應(yīng)用。羥基磷灰石(HAP)是骨組織中的主要無機(jī)成分，具有良好的骨傳導(dǎo)性和生物活性，能夠與骨組織形成骨鍵合，被廣泛應(yīng)用于骨軟骨和骨修復(fù)。與羥基磷灰石(HAP)相比，納米羥基磷灰石(nHAP)具有溶解度較高、表面能較大、吸附性更強(qiáng)、斷裂韌性和力學(xué)性能增強(qiáng)以及更佳的成骨活性等優(yōu)點(diǎn)。公開號為CN 101020083A的中國發(fā)明專利申請公開了一種具有仿生功能界面骨軟骨復(fù)合組織一體化工程支架，從上至下由軟骨層、鈣化層和軟骨下骨層組成，軟骨層由11型膠原和殼聚糖組成，II型膠原/殼聚糖以共價鍵形式連接，鈣化層由II型膠原和羥基磷灰石組成，II型膠原/羥基磷灰石以共價鍵形式連接，軟骨下骨層由I型膠原和羥基磷灰石組成，I型膠原/羥基磷灰石以共價鍵形式連接，在軟骨層和軟骨下骨層內(nèi)都設(shè)置有一個以上的空隙，空隙的孔徑為100 μ πΓ500 μ m,雖然該技術(shù)方案中軟骨層材料具有較好的生物相容性，軟骨下骨層中羥基磷灰石可以具有較好的機(jī)械強(qiáng)度，鈣化層的材料加強(qiáng)了組織間的連接強(qiáng)度，但是II型膠原、殼聚糖、I型膠原均沒有較好的力學(xué)性能，單純地依靠羥基磷灰石以及層中組分的相應(yīng)設(shè)置來增加力學(xué)強(qiáng)度，其仿生功能界面骨軟骨復(fù)合組織一體化工程支架仍然會存在強(qiáng)度不佳的缺點(diǎn)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種連續(xù)梯度復(fù)合支架，解決了傳統(tǒng)多層支架的界面缺陷問題，能夠使得支架具備高強(qiáng)度和較好生物相容性的同時，更好地滿足骨軟骨天然結(jié)構(gòu)的多層次要求。—種連續(xù)梯度復(fù)合支架，由水凝膠和磁性復(fù)合納米粒子組成，其中，所述的磁性復(fù)合納米粒子在所述連續(xù)梯度復(fù)合支架的頂部和底部的重量百分含量分別為0%和109Γ70%，所述的磁性復(fù)合納米粒子的重量百分含量從所述連續(xù)梯度復(fù)合支架的頂部至底部逐漸增多形成連續(xù)梯度分布；所述的水凝膠為聚乙烯醇與天然多糖兩者的水凝膠；所述的磁性復(fù)合納米粒子為納米羥基磷灰石/鐵的氧化物的磁性復(fù)合納米粒子(m-nHAP)ο所述的鐵的氧化物為三氧化二鐵(即氧化鐵)或四氧化三鐵。·
當(dāng)磁性復(fù)合納米粒子在連續(xù)梯度復(fù)合支架的底部的重量百分含量小于10%時，骨中的成骨細(xì)胞的粘附和增殖會明顯降低，不利于成骨細(xì)胞的生長，當(dāng)磁性復(fù)合納米粒子在連續(xù)梯度復(fù)合支架的底部的重量百分含量大于70%時，連續(xù)梯度復(fù)合支架的壓縮強(qiáng)度會明顯下降，孔徑過大，不利于成骨細(xì)胞的生長。所述連續(xù)梯度復(fù)合支架的頂部是指距離其頂面小于等于其高度15%的部分，所述連續(xù)梯度復(fù)合支架的底部是指距離其底面小于等于其高度15%的部分。殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、藻酸鹽、甲殼素、葡聚糖等天然多糖是理想的細(xì)胞外基質(zhì)材料，在組織工程支架中添加天然多糖的成分，有利于提高本發(fā)明連續(xù)梯度復(fù)合支架的細(xì)胞相容性。作為優(yōu)選，所述的天然多糖為殼聚糖(Chitosan，CH)、透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid,HA)、硫酸軟骨素(Chondroitin sulfate,CS)、藻酸鹽(Alginate,Alg)、甲殼素(Chitin, Chi)、葡聚糖(Dextran, Dex)中的一種或兩種以上,可以明顯提高本發(fā)明連續(xù)梯度復(fù)合支架的細(xì)胞相容性。本發(fā)明連續(xù)梯度復(fù)合支架從另一個角度出發(fā)，跳出了多層支架傳統(tǒng)的構(gòu)建思路，使磁性復(fù)合納米粒子在本發(fā)明連續(xù)梯度復(fù)合支架內(nèi)部形成連續(xù)梯度分布的結(jié)構(gòu)。聚乙烯醇力學(xué)性能較佳，天然多糖具有較好的生物相容性以及促軟骨活性，所述的磁性復(fù)合納米粒子由具有較佳成骨活性的納米羥基磷灰石(nHAP)與具有較好生物相容性和生物安全性的鐵的氧化物(三氧化二鐵或四氧化三鐵)復(fù)合形成。本發(fā)明連續(xù)梯度復(fù)合支架以力學(xué)性能較好的聚乙烯醇為支架材料，添加了天然多糖，提高生物相容性，同時引入具有連續(xù)梯度分布的磁性復(fù)合納米粒子共同構(gòu)建骨軟骨組織工程支架，使得本發(fā)明連續(xù)梯度復(fù)合支架在保持支架具備較好力學(xué)性能和較好生物相容性的同時，更好地滿足了骨軟骨天然結(jié)構(gòu)(軟骨層-鈣化層-軟骨下骨層)的多層次要求。作為優(yōu)選，所述的連續(xù)梯度復(fù)合支架上有孔徑為I μ m 50 μ m的孔，合適的孔徑適合細(xì)胞生長，所述的連續(xù)梯度復(fù)合支架的吸水率為50% 90%。本發(fā)明連續(xù)梯度復(fù)合支架中，由上至下，磁性復(fù)合納米粒子從無到有，由少增多，形成連續(xù)梯度分布，其余為水凝膠，作為優(yōu)選，所述的磁性復(fù)合納米粒子在所述連續(xù)梯度復(fù)合支架的頂部和底部的重量百分含量分別為0%和359Γ55%，能夠具有較佳的力學(xué)性能和孔徑，并且非常有利于成骨細(xì)胞的生長，在滿足了骨軟骨天然結(jié)構(gòu)的多層次要求下，使得本發(fā)明連續(xù)梯度復(fù)合支架具有高強(qiáng)度的力學(xué)性能。本發(fā)明還提供了一種連續(xù)梯度復(fù)合支架的制備方法，避免了多層支架的傳統(tǒng)構(gòu)建方法導(dǎo)致的界面缺陷問題，采用磁場誘導(dǎo)的方法使納米羥基磷灰石/鐵的氧化物的磁性復(fù)合納米粒子在本發(fā)明連續(xù)梯度復(fù)合支架內(nèi)部形成連續(xù)的梯度分布。一種連續(xù)梯度復(fù)合支架的制備方法，包括以下步驟I)將聚乙烯醇與天然多糖溶解于水中，得到聚 合物溶液；2)將納米羥基磷灰石/鐵的氧化物(三氧化二鐵或四氧化三鐵)的磁性復(fù)合納米粒子分散在水中，經(jīng)超聲分散得到磁性復(fù)合納米粒子懸浮液；3)將步驟I)中的聚合物溶液和步驟2)中的磁性復(fù)合納米粒子懸浮液混合均勻，得到混合液，將混合液注入模具，在凝膠化以前通過磁場誘導(dǎo)方法將混合液中的納米羥基磷灰石/鐵的氧化物的磁性復(fù)合納米粒子呈連續(xù)梯度分布，之后采用循環(huán)冷凍解凍的方法使混合液凝膠化，得到連續(xù)梯度復(fù)合支架。步驟I)中，作為優(yōu)選，所述的聚合物溶液中聚乙烯醇的重量百分含量為29TlO%，能夠有效提高連續(xù)梯度復(fù)合支架的力學(xué)強(qiáng)度。所述的聚合物溶液中天然多糖的重量百分含量為O. 05°/Γ2%，可以明顯提高生物相容性。在使用時，殼聚糖有兩種，一種是直接可以用水溶解，另一種是需要水以及少量酸輔助溶解，甲殼素需要水以及少量酸輔助溶解，本發(fā)明的制備方法中，天然多糖都需溶解，形式聚合物溶液，可以根據(jù)需要加少量的酸，一般可選用酸與水的質(zhì)量比為I廣3:100。步驟2)中，納米羥基磷灰石/鐵的氧化物的磁性復(fù)合納米粒子(m-nHAP)可參照現(xiàn)有公開文獻(xiàn)“開發(fā)釕-羥基磷灰石封裝的Y-Fe2O3的納米晶作為一種有效的分子氧氧化催化劑”制備([l]Mori K, Kanai S，Hara T, Mizugaki T, Ebitani K, Jitsukawa K, etal. Development of ruthenium-hydroxyapatite-encapsulated superparamagneticgamma-Fe203nanocrystallites as an efficient oxidation catalyst by molecularoxygen. Chem Mater. 2007; 19:1249-56.),可以通過控制反應(yīng)溫度的方式，將鐵的氧化物控制生成為三氧化二鐵或四氧化三鐵，得到納米羥基磷灰石/三氧化二鐵的磁性復(fù)合納米粒子(Y-Fe2O3AiHAP)或者納米羥基磷灰石/四氧化三鐵的磁性復(fù)合納米粒子(Fe3O4AiHAP )。作為優(yōu)選，所述的磁性復(fù)合納米粒子懸浮液中納米羥基磷灰石/鐵的氧化物的磁性復(fù)合納米粒子的重量百分含量為39Γ8%，從而非常有利于納米羥基磷灰石/鐵的氧化物的磁性復(fù)合納米粒子呈連續(xù)梯度分布。步驟3)中，所述的聚合物溶液與磁性復(fù)合納米粒子懸浮液的質(zhì)量比為0. Γ1. 5
Io步驟3)中，所述的磁場誘導(dǎo)方法為在磁場強(qiáng)度600(Tl0000高斯的磁場下誘導(dǎo)0. Ih 240h，可以有效控制梯度水凝膠呈梯度的程度。所述的循環(huán)冷凍解凍的方法中，冷凍的溫度為_40°C _5°C，冷凍的時間為5h 24h，解凍的溫度為4°C 37°C，解凍的時間為5h 24h，循環(huán)冷凍解凍的次數(shù)為3次 15次，形成凝膠化的同時從而可以提高本發(fā)明連續(xù)梯度復(fù)合支架的力學(xué)強(qiáng)度。經(jīng)循環(huán)冷凍解凍即可形成孔，孔徑為I μ m 50 μ m。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明連續(xù)梯度復(fù)合支架跳出了多層支架傳統(tǒng)的構(gòu)建思路，使磁性復(fù)合納米粒子在本發(fā)明連續(xù)梯度復(fù)合支架內(nèi)部形成連續(xù)梯度分布的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明連續(xù)梯度復(fù)合支架以力學(xué)性能較好的聚乙烯醇為支架材料，添加了殼聚糖(CH)、透明質(zhì)酸(HA)、硫酸軟骨素(CS)、藻酸鹽(Alg)、甲殼素(Chi)、葡聚糖(Dex)等天然多糖中的一種或兩種以上，提高生物相容性，同時引入具有連續(xù)梯度分布的磁性復(fù)合納米粒子共同構(gòu)建骨軟骨組織工程支架，使得本發(fā)明連續(xù)梯度復(fù)合支架在保持支架具備較好的力學(xué)性能和較好的生物相容性的同時，更好的滿足了骨軟骨天然結(jié)構(gòu)(軟骨層-鈣化層-軟骨下骨層)的多層次要求。本發(fā)明連續(xù)梯度復(fù)合支架的制備方法，該方法與多層支架的傳統(tǒng)構(gòu)建方法不同，避免了多層支架的傳統(tǒng)構(gòu)建方法導(dǎo)致的界面缺陷問題，采用磁場誘導(dǎo)的方法使納米羥基磷灰石/鐵的氧化物的磁性復(fù)合納米粒子在本發(fā)明連續(xù)梯度復(fù)合支架內(nèi)部形成連續(xù)的梯度分布，其易于實(shí)施和控制，有利于工業(yè)化生產(chǎn)，并具有廣闊的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式以下通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡釋。實(shí)施例中的聚乙烯醇簡寫為PVA，殼聚糖簡寫為CH，透明質(zhì)酸簡寫為HA，硫酸軟骨 素簡寫為CS，藻酸鹽簡寫為Alg，納米羥基磷灰石/鐵的氧化物的磁性復(fù)合納米粒子簡寫為m-nHAP, m-nHAP 為 Y -Fe2O3AiHAP 或者 Fe304/nHAP,納米輕基磷灰石簡寫為 nHAP。制備例Iy -Fe2O3MiAP納米粒子的制備采用N2吹泡的方法將30ml去離子水中溶解的氧氣去除，然后將I. 85mmol FeCl2 · 4H20和3. 7mmol FeCl3 · 6H20加入上述無氧的去離子水中至其完全溶解，形成鐵鹽水溶液，將鐵鹽水溶液加入至IOml NH4OH中，90°C水浴并持續(xù)磁力攪拌300r/min，lh后生成部分為Y-Fe2O3納米粒子的原溶液。在部分為Y-Fe2O3納米粒子的原溶液中，先后加入 33. 7mmol Ca(NO3)2 · 4H20 (調(diào) pH=ll)和 20mmol (NH4)2HPO4 (調(diào)PH=II )，90°C水浴并持續(xù)磁力攪拌300r/min，2h后，再經(jīng)室溫陳化72h得到納米羥基磷灰石/三氧化二鐵的磁性復(fù)合納米粒子溶液。將磁鐵放在盛有納米羥基磷灰石/三氧化二鐵的磁性復(fù)合納米粒子溶液的燒杯的底部，利用磁場將Y -Fe2O3AiHAP吸于杯底，將含有未與Y -Fe2O3反應(yīng)的nHAP的上清液傾倒，并用去離子水將Y -Fe2O3AiHAP多次洗滌至中性，得到純m-nHAP。制備例2Fe3O4AiHAP納米粒子的制備采用N2吹泡的方法將30ml去離子水中溶解的氧氣去除，然后將I. 85mmol FeCl2 · 4H20和3. 7mmol FeCl3 · 6H20加入上述無氧的去離子水中至其完全溶解，形成鐵鹽水溶液，將鐵鹽水溶液加入至IOml NH4OH中，在常溫25°C下磁力攪拌300r/min，Ih后生成Fe3O4納米粒子原溶液。在Fe3O4納米粒子原溶液中，先后加入33. 7mmol Ca(NO3)2 · 4H20 (調(diào) pH=ll)和 20mmoI (NH4)2HPO4 (調(diào) pH=ll)，在常溫 25°C下磁力攪拌300r/min，2h后，再經(jīng)室溫陳化24h得到納米羥基磷灰石/四氧化三鐵的磁性復(fù)合納米粒子(Fe3O4AiHAP)溶液。將磁鐵放在盛有納米羥基磷灰石/四氧化三鐵的磁性復(fù)合納米粒子溶液的燒杯的底部，利用磁場將Fe3O4AiHAP吸于杯底，將含有未反應(yīng)的nHAP的上清液傾倒，并用去離子水將Fe3O4AiHAP多次洗滌至中性，得到純m-nHAP。實(shí)施例II)將5. Og PVA (聚合度1750±50，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司)溶解于40. Og去離子水中，加熱使之溶解，得到Al溶液，再將O. 5g CH溶解于25. Og去離子水中得到A2溶液，將Al溶液和A2溶液混合，得到70. 5g的聚合物溶液； 2)將制備例I制備的5. 5g純m-nHAP分散在134. 7g的去離子水中，經(jīng)超聲分散得到140. 2g的磁性復(fù)合納米粒子懸浮液； 3)將步驟I)中的聚合物溶液和步驟2)中的磁性復(fù)合納米粒子懸浮液混合均勻，得到混合液，將混合液注入模具，在凝膠化以前通過磁場強(qiáng)度為8000高斯的磁場誘導(dǎo)120h將混合液中的m-nHAP呈連續(xù)梯度分布，之后采用循環(huán)冷凍解凍的方法使混合液凝膠化，循環(huán)冷凍解凍的方法中，冷凍溫度為_5°C，冷凍時間為24h，解凍溫度為4°C，解凍時間為24h，循環(huán)冷凍解凍的次數(shù)為15次，混合液凝膠化后得到連續(xù)梯度復(fù)合支架，該連續(xù)梯度復(fù)合支架為圓柱形，直徑為8mm,高度為7_。該連續(xù)梯度復(fù)合支架上有孔徑為5 μ m 8 μ m的孔，吸水率為70%。 將步驟I)制備的聚合物溶液直接經(jīng)步驟3)中的循環(huán)冷凍解凍的方法使其凝膠化，制得聚乙烯醇水凝膠支架，用作對比。將本實(shí)施例制備的聚乙烯醇水凝膠支架和連續(xù)梯度復(fù)合支架用型號為Instron5567萬能材料試驗(yàn)機(jī)測試其壓縮強(qiáng)度,壓縮速度為lmm/min,最大壓縮形變?yōu)?8%，測得聚乙烯醇水凝膠支架的壓縮強(qiáng)度為8. 8±2. OMPa，本發(fā)明連續(xù)梯度復(fù)合支架的壓縮強(qiáng)度為16. 0±1. 2MPa。將本實(shí)施例的連續(xù)梯度復(fù)合支架用熱失重(TGA)的方法測試在不同高度下測試其組成，具體方法采用梅特勒TGA/DSC1儀器，25°C 800°C，加熱速率20°C /min。將圓柱形連續(xù)梯度復(fù)合支架沿其軸向平均分成7份測試樣品，每份測試樣品大小直徑為8mm、高度為Imm,每份測試樣品在梅特勒TGA/DSC1儀器中煅燒，PVA被燒掉，只剩下m-nHAP的質(zhì)量，得到不同測試樣品中m-nHAP的質(zhì)量與每份測試樣品的總質(zhì)量之百分比。連續(xù)梯度復(fù)合支架整體上由水凝膠和納米羥基磷灰石/三氧化二鐵的磁性復(fù)合納米粒子組成，納米羥基磷灰石/三氧化二鐵的磁性復(fù)合納米粒子在連續(xù)梯度復(fù)合支架的頂部和底部的重量百分含量分別為0%和45%，納米羥基磷灰石/三氧化二鐵的磁性復(fù)合納米粒子的重量百分含量從該連續(xù)梯度復(fù)合支架的頂部至底部逐漸增多形成連續(xù)梯度分布。其他實(shí)施例在不同高度下測試其組成的方法同上。成骨細(xì)胞在連續(xù)梯度復(fù)合支架表面生長行為的定量評價方法成骨細(xì)胞采用hFOBl. 19人SV40轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，從37°C、5%C02的孵箱中取出鋪滿成骨細(xì)胞的培養(yǎng)瓶，吸出舊培養(yǎng)液，PBS緩沖液清洗2次，加入O. 25%胰酶(Gibco)后，在37°C、5%C02的孵箱中作用4min，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察，見大部分(約80%)細(xì)胞開始回縮成球形，立即加入適量的全液[全液由重量百分含量89%DMEM nutrientmixF12培養(yǎng)基(Gibco)、10%胎牛血清(Gibco)以及1%青霉素-鏈霉素(Gibco)組成]終止消化，吹打使細(xì)胞分散均勻，細(xì)胞記數(shù)板記數(shù)(細(xì)胞密度I. OX IO5個/ml)后，將2ml細(xì)胞懸液(第8代)接種于24孔板中的連續(xù)梯度復(fù)合支架表面(直徑8mm，厚度7mm)隨后將樣品放在37°C、5%C02的孵箱中培養(yǎng)7天后，將樣品換到新的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加2ml全液，再加200 μ 1CCK-8液(C008-3，上海七海復(fù)泰生物科技有限公司)，在37°C、5%C02的孵箱中孵化6h至溶液染色變深，每孔中取200 μ I反應(yīng)液于96孔培養(yǎng)板中，450nm波長下用酶標(biāo)儀(MDSpectra Max 190)測溶液的吸光度(0D)。實(shí)施例I制備的聚乙烯醇水凝膠支架的吸光度值為O. 47±0. 04，實(shí)施例I制備的連續(xù)梯度復(fù)合支架的吸光度值為I. 56±0. 03。其他實(shí)施例的連續(xù)梯度復(fù)合支架的吸光度值評價方法同上。
此外，本發(fā)明采用DAPI (4’，6_ 二脒基_2_苯基吲哚)細(xì)胞核熒光染色的定性評價方法分別研究了成骨細(xì)胞在實(shí)施例I制備的聚乙烯醇水凝膠支架和連續(xù)梯度復(fù)合支架上培養(yǎng)3天的生長情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞在本發(fā)明連續(xù)梯度復(fù)合支架上粘附的數(shù)量明顯優(yōu)于在聚乙烯醇水凝膠支架上粘附的數(shù)量，可見本發(fā)明連續(xù)梯度復(fù)合支架具有較好的生物相容性。實(shí)施例2I)將lO.Og PVA (聚合度1750±50，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司)溶解于100. Og去離子水中，加熱使之溶解，得到Al溶液，再將O. Ig HA溶解于5. Og去離子水中得到A2溶液，將Al溶液和A2溶液混合，得到115. Ig的聚合物溶液；2)將制備例I制備的40. 4g純m_nHAP分散在990. 8g的去離子水中，經(jīng)超聲分散得到1031. 2g的磁性復(fù)合納米粒子懸浮液；
3)將步驟I)中的聚合物溶液和步驟2)中的磁性復(fù)合納米粒子懸浮液混合均勻，得到混合液，將混合液注入模具，在凝膠化以前通過磁場強(qiáng)度為6000高斯的磁場誘導(dǎo)240h將混合液中的m-nHAP呈連續(xù)梯度分布，之后采用循環(huán)冷凍解凍的方法使混合液凝膠化，循環(huán)冷凍解凍的方法中，冷凍溫度為_40°C，冷凍時間為5h，解凍溫度為37°C，解凍時間為5h，循環(huán)冷凍解凍的次數(shù)為3次，混合液凝膠化后得到連續(xù)梯度復(fù)合支架，該連續(xù)梯度復(fù)合支架為圓柱形，直徑為8mm,高度為7mm。該連續(xù)梯度復(fù)合支架上有孔徑為15 μ m 25 μ m的孔，吸水率為65%，壓縮強(qiáng)度為14. 0±1. 5MPa。將本實(shí)施例的連續(xù)梯度復(fù)合支架在不同高度下測試其組成，整體上由水凝膠和納米羥基磷灰石/三氧化二鐵的磁性復(fù)合納米粒子組成，納米羥基磷灰石/三氧化二鐵的磁性復(fù)合納米粒子在連續(xù)梯度復(fù)合支架的頂部和底部的重量百分含量分別為0%和70%，納米羥基磷灰石/三氧化二鐵的磁性復(fù)合納米粒子的重量百分含量從該連續(xù)梯度復(fù)合支架的頂部至底部逐漸增多形成連續(xù)梯度分布。實(shí)施例2制備的連續(xù)梯度復(fù)合支架通過成骨細(xì)胞定量評價方法得到的吸光度值為O. 83±0. 11。實(shí)施例3I)將lO.Og PVA (聚合度1750±50，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司)溶解于100. Og去離子水中，加熱使之溶解，得到Al溶液，再將O. Ig HA溶解于5. Og去離子水中得到A2溶液，將Al溶液和A2溶液混合，得到115. Ig的聚合物溶液；2)將制備例2制備的40. 4g純m_nHAP分散在990. 8g的去離子水中，經(jīng)超聲分散得到1031. 2g的磁性復(fù)合納米粒子懸浮液；3)將步驟I)中的聚合物溶液和步驟2)中的磁性復(fù)合納米粒子懸浮液混合均勻，得到混合液，將混合液注入模具，在凝膠化以前通過磁場強(qiáng)度為6000高斯的磁場誘導(dǎo)240h將混合液中的m-nHAP呈連續(xù)梯度分布，之后采用循環(huán)冷凍解凍的方法使混合液凝膠化，循環(huán)冷凍解凍的方法中，冷凍溫度為_40°C，冷凍時間為5h，解凍溫度為37°C，解凍時間為5h，循環(huán)冷凍解凍的次數(shù)為3次，混合液凝膠化后得到連續(xù)梯度復(fù)合支架，該連續(xù)梯度復(fù)合支架為圓柱形，直徑為8mm,高度為7mm。該連續(xù)梯度復(fù)合支架上有孔徑為15 μ m 25 μ m的孔，吸水率為66%，壓縮強(qiáng)度為13. 5±1. 5MPa。將本實(shí)施例的連續(xù)梯度復(fù)合支架在不同高度下測試其組成，整體上由水凝膠和納米羥基磷灰石/四氧化三鐵的磁性復(fù)合納米粒子組成，納米羥基磷灰石/四氧化三鐵的磁性復(fù)合納米粒子在連續(xù)梯度復(fù)合支架的頂部和底部的重量百分含量分別為0%和68%，納米羥基磷灰石/四氧化三鐵的磁性復(fù)合納米粒子的重量百分含量從該連續(xù)梯度復(fù)合支架的頂部至底部逐漸增多形成連續(xù)梯度分布。實(shí)施例3制備的連續(xù)梯度復(fù)合支架通過成骨細(xì)胞定量評價方法得到的吸光度值為O. 80±O. 10。實(shí)施例4I)將3. Og PVA (聚合度1750±50，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司)溶解于30. Og去離子水中，加熱使之溶解，得到Al溶液，再將l.Og CS溶解于50. Og去離子水中得到A2溶液，將Al溶液和A2溶液混合，得到84g的聚合物溶液；2)將制備例I制備的2. 7g純m-nHAP分散在65. 4g的去離子水中，經(jīng)超聲分散得到68. Ig的磁性復(fù)合納米粒子懸浮液；3)將步驟I)中的聚合物溶液和步驟2)中的磁性復(fù)合納米粒子懸浮液混合均勻，得到混合液，將混合液注入模具，在凝膠化以前通過磁場強(qiáng)度為10000高斯的磁場誘導(dǎo)Ih 將混合液中的rn-nHAP呈連續(xù)梯度分布，之后采用循環(huán)冷凍解凍的方法使混合液凝膠化，循環(huán)冷凍解凍的方法中，冷凍溫度為-22. 5°C，冷凍時間為13h，解凍溫度為20. 5°C，解凍時間為13h，循環(huán)冷凍解凍的次數(shù)為8次，混合液凝膠化后得到連續(xù)梯度復(fù)合支架，該連續(xù)梯度復(fù)合支架為圓柱形，直徑為8mm,高度為7_。該連續(xù)梯度復(fù)合支架上有孔徑為I μ m 5 μ m的孔，吸水率為80%，壓縮強(qiáng)度為20. 0±1. 5MPa。將本實(shí)施例的連續(xù)梯度復(fù)合支架在不同高度下測試其組成，整體上由水凝膠和納米羥基磷灰石/三氧化二鐵的磁性復(fù)合納米粒子組成，納米羥基磷灰石/三氧化二鐵的磁性復(fù)合納米粒子在連續(xù)梯度復(fù)合支架的頂部和底部的重量百分含量分別為0%和38%，納米羥基磷灰石/三氧化二鐵的磁性復(fù)合納米粒子的重量百分含量從該連續(xù)梯度復(fù)合支架的頂部至底部逐漸增多形成連續(xù)梯度分布。實(shí)施例4制備的連續(xù)梯度復(fù)合支架通過成骨細(xì)胞定量評價方法得到的吸光度值為I. 42 ±O. 13。實(shí)施例5I)將2. Og PVA (聚合度1750±50，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司)溶解于20. Og去離子水中，加熱使之溶解，得到Al溶液，再將O. 2g CS溶解于10. Og去離子水中得到A2溶液，將Al溶液和A2溶液混合，得到32. 2g的聚合物溶液；2)將制備例I制備的3. 3g純m-nHAP分散在80. 9g的去離子水中，經(jīng)超聲分散得到84. 2g的磁性復(fù)合納米粒子懸浮液；3)將步驟I)中的聚合物溶液和步驟2)中的磁性復(fù)合納米粒子懸浮液混合均勻，得到混合液，將混合液注入模具，在凝膠化以前通過磁場強(qiáng)度為8000高斯的磁場誘導(dǎo)IOOh將混合液中的m-nHAP呈連續(xù)梯度分布，之后采用循環(huán)冷凍解凍的方法使混合液凝膠化，循環(huán)冷凍解凍的方法中，冷凍溫度為-30°C，冷凍時間為15h，解凍溫度為30°C，解凍時間為15h，循環(huán)冷凍解凍的次數(shù)為9次，混合液凝膠化后得到連續(xù)梯度復(fù)合支架，該連續(xù)梯度復(fù)合支架為圓柱形，直徑為8mm,高度為7mm。連續(xù)梯度復(fù)合支架上有孔徑為7 μ m 15 μ m的孔，吸水率為67%，壓縮強(qiáng)度為15. O ±2. 6MPa。將本實(shí)施例的連續(xù)梯度復(fù)合支架在不同高度下測試其組成，整體上由水凝膠和納米羥基磷灰石/三氧化二鐵的磁性復(fù)合納米粒子組成，納米羥基磷灰石/三氧化二鐵的磁性復(fù)合納米粒子在連續(xù)梯度復(fù)合支架的頂部和底部的重量百分含量分別為0%和50%，納米羥基磷灰石/三氧化二鐵的磁性復(fù)合納米粒子的重量百分含量從該連續(xù)梯度復(fù)合支架的頂部至底部逐漸增多形成連續(xù)梯度分布。實(shí)施例5制備的連續(xù)梯度復(fù)合支架通過成骨細(xì)胞定量評價方法得到的吸光度值為I. 47±O. 09。對比例I
I)將5. Og PVA (聚合度1750±50，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司)溶解于65. 5g去離子水中，加熱使之溶解，得到70. 5g的聚合物溶液；2)將制備例I制備的5. 5g純m-nHAP分散在134. 7g的去離子水中，經(jīng)超聲分散得到140. 2g的磁性復(fù)合納米粒子懸浮液；3)將步驟I)中的聚合物溶液和步驟2)中的磁性復(fù)合納米粒子懸浮液混合均勻，得到混合液，將混合液注入模具，在凝膠化以前通過磁場強(qiáng)度為8000高斯的磁場誘導(dǎo)120h將混合液中的m-nHAP呈連續(xù)梯度分布，之后采用循環(huán)冷凍解凍的方法使混合液凝膠化，循環(huán)冷凍解凍的方法中，冷凍溫度為_5°C，冷凍時間為24h，解凍溫度為4°C，解凍時間為24h，循環(huán)冷凍解凍的次數(shù)為15次，混合液凝膠化后得到連續(xù)梯度復(fù)合支架，該連續(xù)梯度復(fù)合支架為圓柱形，直徑為8mm,高度為7_。該連續(xù)梯度復(fù)合支架上有孔徑為3 μ m 7 μ m的孔，吸水率為75%，壓縮強(qiáng)度為16. 5±1. 5MPa。將本對比例的連續(xù)梯度復(fù)合支架在不同高度下測試其組成，整體上由水凝膠和納米羥基磷灰石/三氧化二鐵的磁性復(fù)合納米粒子組成，納米羥基磷灰石/三氧化二鐵的磁性復(fù)合納米粒子在連續(xù)梯度復(fù)合支架的頂部和底部的重量百分含量分別為0%和43%，納米羥基磷灰石/三氧化二鐵的磁性復(fù)合納米粒子的重量百分含量從該連續(xù)梯度復(fù)合支架的頂部至底部逐漸增多形成連續(xù)梯度分布。對比例I制備的連續(xù)梯度復(fù)合支架通過成骨細(xì)胞定量評價方法得到的吸光度值為O. 61 ±0. 07。通過對比例I和實(shí)施例I得到的連續(xù)梯度復(fù)合支架的吸光度值進(jìn)行比較，可見，實(shí)施例I中添加殼聚糖(CH)后，非常有利于成骨細(xì)胞的生長，其生物相容性明顯提高，并且仍具有較佳的力學(xué)性能，結(jié)合實(shí)施例2 5的連續(xù)梯度復(fù)合支架的吸光度值可知，磁性復(fù)合納米粒子在連續(xù)梯度復(fù)合支架的頂部和底部的重量百分含量分別為0%和35°/Γ55%，非常有利于成骨細(xì)胞的生長，并且從壓縮強(qiáng)度的力學(xué)數(shù)據(jù)可知，具有較佳的力學(xué)性能。
權(quán)利要求
1.一種連續(xù)梯度復(fù)合支架，其特征在于，由水凝膠和磁性復(fù)合納米粒子組成，其中，所述的磁性復(fù)合納米粒子在所述連續(xù)梯度復(fù)合支架的頂部和底部的重量百分含量分別為0%和109Γ70%，所述的磁性復(fù)合納米粒子的重量百分含量從所述連續(xù)梯度復(fù)合支架的頂部至底部逐漸增多形成連續(xù)梯度分布； 所述的水凝膠為聚乙烯醇與天然多糖兩者的水凝膠； 所述的磁性復(fù)合納米粒子為納米羥基磷灰石/鐵的氧化物的磁性復(fù)合納米粒子。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的連續(xù)梯度復(fù)合支架，其特征在于，所述的天然多糖為殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、藻酸鹽、甲殼素、葡聚糖中的一種或兩種以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的連續(xù)梯度復(fù)合支架，其特征在于，所述的連續(xù)梯度復(fù)合支架上有孔徑為I μ m 50 μ m的孔。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的連續(xù)梯度復(fù)合支架，其特征在于，所述的磁性復(fù)合納米粒子在所述連續(xù)梯度復(fù)合支架的頂部和底部的重量百分含量分別為0%和359Γ55%。
5.根據(jù)權(quán)利要求f4任一項(xiàng)所述的連續(xù)梯度復(fù)合支架的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)將聚乙烯醇與天然多糖溶解于水中，得到聚合物溶液； 2)將納米羥基磷灰石/鐵的氧化物的磁性復(fù)合納米粒子分散在水中，經(jīng)超聲分散得到磁性復(fù)合納米粒子懸浮液； 3)將步驟I)中的聚合物溶液和步驟2)中的磁性復(fù)合納米粒子懸浮液混合均勻，得到混合液，將混合液注入模具，在凝膠化以前通過磁場誘導(dǎo)方法將混合液中的納米羥基磷灰石/鐵的氧化物的磁性復(fù)合納米粒子呈連續(xù)梯度分布，之后采用循環(huán)冷凍解凍的方法使混合液凝膠化，得到連續(xù)梯度復(fù)合支架。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的連續(xù)梯度復(fù)合支架的制備方法，其特征在于，步驟I)中，所述的聚合物溶液中聚乙烯醇的重量百分含量為2°/Γ Ο% ； 所述的聚合物溶液中天然多糖的重量百分含量為O. 059Γ2%。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的連續(xù)梯度復(fù)合支架的制備方法，其特征在于，步驟2)中，所述的磁性復(fù)合納米粒子懸浮液中納米羥基磷灰石/鐵的氧化物的磁性復(fù)合納米粒子的重量百分含量為3% 8%。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的連續(xù)梯度復(fù)合支架的制備方法，其特征在于，步驟3)中，所述的聚合物溶液與磁性復(fù)合納米粒子懸浮液的質(zhì)量比為O. Γ1. 5 :1。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的連續(xù)梯度復(fù)合支架的制備方法，其特征在于，步驟3)中，所述的磁場誘導(dǎo)方法為在磁場強(qiáng)度600(Tl0000高斯的磁場下誘導(dǎo)O. Ih 240h。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的連續(xù)梯度復(fù)合支架的制備方法，其特征在于，步驟3)中，所述的循環(huán)冷凍解凍的方法中，冷凍的溫度為_40°C _5°C，冷凍的時間為5h 24h，解凍的溫度為4°C 37°C，解凍的時間為5h 24h，循環(huán)冷凍解凍的次數(shù)為3次 15次。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種連續(xù)梯度復(fù)合支架，涉及生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，由水凝膠和磁性復(fù)合納米粒子組成，磁性復(fù)合納米粒子在連續(xù)梯度復(fù)合支架的頂部和底部的重量百分含量分別為0%和10%~70%，磁性復(fù)合納米粒子的重量百分含量從連續(xù)梯度復(fù)合支架的頂部至底部逐漸增多形成連續(xù)梯度分布，水凝膠為聚乙烯醇與天然多糖兩者的水凝膠，磁性復(fù)合納米粒子為納米羥基磷灰石/鐵的氧化物的磁性復(fù)合納米粒子。本發(fā)明連續(xù)梯度復(fù)合支架通過添加天然多糖提高細(xì)胞相容性，具備高強(qiáng)度和較好生物相容性，能夠很好地滿足骨軟骨天然結(jié)構(gòu)的多層次要求。本發(fā)明還公開了一種連續(xù)梯度復(fù)合支架的制備方法，其易于實(shí)施和控制，并具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A61L27/46GK102861362SQ20121034661
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月18日
發(fā)明者侯瑞霞, 付俊, 程亞軍, 張國花 申請人:中國科學(xué)院寧波材料技術(shù)與工程研究所