專利名稱：冬凌草納米微粒的制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種冬凌草納米微粒的制備方法及其應用。
背景技術：
冬凌草是唇形科茶菜屬植物碎米椏變種，因其植株凝結薄如蟬翼、形態各異的蝶狀冰凌片而得名，全株結滿銀白色冰片，風吹不落，隨風搖曳，日出后閃閃發光，展現出神奇的自然景觀，具有獨到的觀賞作用，具有清熱解毒、消炎止痛、健胃活血之效，主要分布于河南及黃河流域以南，具有耐寒、耐旱、病蟲害少等特點。冬凌草的藥用部位是全株，具有綜合開發利用價值的植物。冬凌草味甘苦，性微寒，其中含有冬凌草甲素、冬凌草乙素、熊果酸、齊墩果酸、冬凌草多糖等多種功效成分，具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗氧化和增強免疫力等作用。現代應用主治咽喉腫痛、扁桃體炎、氣 管炎、慢性肝炎、風濕痛，并對食管癌、乳腺癌、直腸癌等有緩解作用。中國發明專利申請其申請號201110288022. 9，公布號CN102327318A，公布日2012. 01. 25，公開了冬凌草具有防治骨質疏松癥的作用。納米中藥制劑是指運用納米技術制造的,粒徑小于IOOnm的中藥有效成分、有效部位、原藥及其復方的制劑。與常規制劑相比，納米制劑具有活性高、生物利用度高、良好緩控釋性能以及靶向給藥等特性。目前，可應用于中藥制劑的納米技術有很多，例如超細粉碎技術、噴霧干燥法、高壓均質技術、化學沉淀法、界面聚合、乳化聚合等，但這些方法都有其應用的局限性。例如，超細粉碎技術不受中藥溶解性能的限制，但是存在效率低、噪音大、生產量小等缺點；噴霧干燥法除了受溶解性限制外，其得到的顆粒不一定都是納米級；化學沉淀法等化學方法會引入化學溶劑，對人體和環境產生危害。

發明內容
針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供了一種冬凌草納米微粒的制備方法，該納米微粒制品應用于防治骨質疏松癥方面，相對于常規劑型的冬凌草制品而言具有更加明顯的效果。為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案是
一種冬凌草納米微粒的制備方法，其特征在于包括如下步驟
(1)將冬凌草與去離子水或無水乙醇中的一種或兩種組合溶劑按I:I 20混合后，在回流提取溫度為70°C 95°C下回流提取30min 300min，趁熱過濾，得到濾渣和濾液；
(2)將步驟(I)得到的濾液在60°C 90°C的條件下進行減壓蒸餾濃縮至原體積的1/2 1/10 ；
(3)將步驟(2)得到的濃縮濾液進行脫色、脫蛋白質處理，然后將處理液用95%乙醇調節至溶液中乙醇濃度為50%飛0%，低溫靜置12 24小時，離心分離得到沉淀物和上清液；
(4)將沉淀物用1(Γ50倍的去離子水充分溶解，然后上凝膠柱進行層析，用超純水洗脫，洗脫速度為O. lmfl. Oml/min，用紫外分光光度法進行跟蹤并收集洗脫液；(5)將步驟(4)的洗脫液與超臨界CO2抗溶劑系統的液體泵相連；
(6)啟動超臨界CO2抗溶劑系統，結晶釜的溫度為40°C 80°C，結晶釜的壓力為8Mpa 50Mpa，CO2 的流量為 30 300L/hr ；
(7)啟動超臨界CO2抗溶劑系統的夾帶劑泵和步驟(4)中的液體泵，洗脫液與甲醇、乙醇、乙酸乙酯或丙酮中的一種夾帶劑的進料比為10: f 1:10，洗脫液與夾帶劑先混合后，經超臨界CO2抗溶劑系統的納米噴嘴噴入結晶釜中，流量控制在IOOmf 1000ml/hr ;洗脫液中的溶劑和夾帶劑進入分離釜中解析并分離，洗脫液中的溶質在結晶釜內析出為微細顆粒，該微細顆粒即為冬凌草納米微粒。所述步驟(7)中的納米噴嘴的口徑為I IOOnm;所述的分離釜溫度為35°C 600C，分離壓力為4Mpa 7Mpa，優選分離釜溫度為50°C，分離壓力為5Mpa ;所述的CO2氣體的純度不低于99%。
所述的凝膠柱層析所用的填料為葡聚糖凝膠系列、瓊脂糖凝膠系列或丙烯葡聚糖凝膠系列中的一種。為了更完整地提取有效成份，將步驟(3)離心得到的上清液用95%乙醇調節至溶液中乙醇濃度為60°/Γ70%，低溫靜置12 24小時，離心分離得到沉淀物II和上清液；將上述離心得到的上清液用95%乙醇調節至溶液中乙醇濃度為70°/Γ80%，低溫靜置12 24小時，離心分離得到沉淀物III和上清液；再將上述離心得到的上清液用95%乙醇調節至溶液中乙醇濃度為80°/Γ90%，低溫靜置12 24小時，離心分離得到沉淀物IV ;將上述得到的沉淀物II、沉淀物III和沉淀物IV與步驟(3)中得到的沉淀物合并。上述制備方法得到的冬凌草納米微粒可在防治骨質疏松癥方面以及制備防治骨質疏松癥的藥物中的應用，具有很好的療效。本發明與現在技術相比，其有益效果在于
第一、采用超臨界CO2抗溶劑技術制備冬凌草納米微粒，無需脫除溶劑殘留、干燥、粉碎等后續處理工序，大大提高生產效率；整個過程中采用的CO2具有無臭、無毒、無污染、不易燃易爆的特點，使生產環境具有更高的安全性；產品中無溶劑殘留，使產品品質具有更高的安全性。第二、本發明的制備方法制得的冬凌草納米微粒，具有更高的生物利用度和靶向給藥的特點。通過切除大鼠卵巢建立骨質疏松模型，檢測骨密度，驗證了冬凌草納米微粒對骨質疏松是具有保護作用的，并通過對比試驗驗證了納米級冬凌草微粒較常規粒度的冬凌草微粒，在治療骨質疏松癥方面具有更加明顯的效果。通過實驗測定其誘導T淋巴細胞增殖反應的影響，發現隨著用量的增加，其對ConA誘導的T淋巴細胞的增殖反應有顯著增強作用，并分析了冬凌草納米微粒在治療骨質疏松和誘導T淋巴細胞增殖反應方面的相關性。另外，通過臨床實驗驗證了冬凌草納米微粒對于絕經后骨質疏松癥以及骨質疏松性骨折的治療作用。


圖I為本發明的冬凌草納米微粒的制備方法中超臨界CO2抗溶劑系統的流程示意圖。附圖標注=C1是承裝冬凌草洗脫液的原料罐，P1是液體泵，P2是夾帶劑泵，F1是結晶釜，F2是分離釜。
具體實施例方式為了更好地理解本發明，下面結合附圖及實施例進一步闡明本發明內容，但本發明的內容不僅僅局限于下面的實施例，并給出本發明的有益效果的實驗例。實施例I :
一種冬凌草納米微粒的制備方法，包括如下步驟
(I )、將冬凌草與去離子水按I: I混合后在95°c加熱條件下回流提取60min，趁熱過濾，濾渣重復上述操作I次，合并濾液；
(2)、將步驟(I)得到的濾液在70°C的條件下進行減壓蒸餾濃縮至原體積的50%；
(3)、將步驟(2)的濃縮液經活性炭脫色、sevage法脫蛋白質后，用95%乙醇調節至溶液 中乙醇濃度為55%，低溫靜置12小時，離心分離得到沉淀I和上清液；
(4)、將步驟(3)離心得到的上清液用95%乙醇調節至溶液中乙醇濃度為65%，低溫靜置12小時，離心分離得到沉淀II和上清液；
(5)、將步驟(4)離心得到的上清液用95%乙醇調節至溶液中乙醇濃度為75%，低溫靜置12小時，離心分離得到沉淀III和上清液；
(6)、將步驟(5)離心得到的用上清液95%乙醇調節至溶液中乙醇濃度為85%，低溫靜置12小時，離心分離得到沉淀IV ；
(7)、將沉淀Γιν用10倍去離子水充分溶解后上葡聚糖凝膠柱層析，用超純水洗脫，洗脫速度為O. lml/min，每管10ml，收集30號 100號管的洗脫液；
(8)、合并步驟(7)收集得到的洗脫液將其放入冬凌草洗脫液的原料罐C1中，并與超臨界CO2抗溶劑系統的液體泵P1相連；
(9)、啟動超臨界CO2抗溶劑系統，其中結晶釜Fl的溫度為45°C，結晶釜的壓力為8Mpa，，CO2 的流量為 30L/hr ；
(10)、啟動超臨界CO2抗溶劑系統的夾帶劑泵P2和液體泵P1，選擇乙醇為夾帶劑，調節各自的頻率，使夾帶劑泵和液體泵的進料比為1: 1，洗脫液與夾帶劑混合后經超臨界CO2抗溶劑系統的納米噴嘴噴入結晶釜F1中，分離釜F2的溫度為50°C，分離壓力為5Mp，納米噴嘴的口徑為lOOnm，洗膠液中的溶劑和夾帶劑進入分離釜中解析并分離，洗脫液中的溶質在結晶釜內析出為微細顆粒，該微細顆粒即為冬凌草納米微粒。本實施例制備的冬凌草納米微粒的平均粒徑為126. 9nm。實施例2:
一種冬凌草納米微粒的制備工藝，包括如下步驟
(1)、將冬凌草與去離子水按1:10混合后在80°C加熱條件下回流提取120min，趁熱過濾，濾渣重復上述操作I次，合并濾液；
(2)、將步驟(I)得到的濾液在80°C的條件下進行減壓蒸餾濃縮至原體積的10%；
(3)、將步驟(2)的濃縮液經活性炭脫色、sevage法脫蛋白質后，用95%乙醇調節至溶液中乙醇濃度為55%，低溫靜置12小時，離心分離得到沉淀I和上清液；
(4)、將步驟(3)離心得到的上清液用95%乙醇調節至溶液中乙醇濃度為65%，低溫靜置12小時，離心分離得到沉淀II和上清液；(5)、將步驟(4)離心得到的上清液用95%乙醇調節至溶液中乙醇濃度為75%，低溫靜置12小時，離心分離得到沉淀III和上清液；
(6)、將步驟(5)離心得到的用上清液95%乙醇調節至溶液中乙醇濃度為85%，低溫靜置12小時，離心分離得到沉淀IV ；
(7)、將沉淀廣IV用20倍去離子水全部充分溶解后上瓊脂糖凝膠柱層析，用超純水洗脫，洗脫速度為O. 5ml/min, 10ml/tube,收集10號 40號管的洗脫液；
(8)合并步驟(7)收集得到的洗脫液將其放入冬凌草洗脫液的原料罐C1中，并與超臨界CO2抗溶劑系統的液體泵P1相連；
(9)、啟動超臨界CO2抗溶劑系統，其中結晶釜的溫度為50°C，結晶釜的壓力為20Mpa，CO2的流量為50L/hr ；
(10)、啟動超臨界CO2抗溶劑系統的夾帶劑泵P2和液體泵P1，選擇乙醇為夾帶劑，調節 各自的頻率，使夾帶劑泵和液體泵的進料比為3:1，洗脫液與夾帶劑混合后經超臨界CO2抗溶劑系統的納米噴嘴噴入結晶釜F1中，分離釜F2的溫度為55°C，分離壓力為6Mpa，納米噴嘴的口徑為50nm，洗膠液中的溶劑和夾帶劑進入分離釜中解析并分離，洗脫液中的溶質在結晶釜內析出為微細顆粒，該微細顆粒即為冬凌草納米微粒。本實施例制備的冬凌草納米微粒的平均粒徑為77. 2nm。實施例3
一種冬凌草納米微粒的制備方法，包括如下步驟
(1)、將冬凌草與去離子水按1:20混合后在70°C加熱條件下回流提取180min，趁熱過濾，濾渣重復上述操作I次，合并濾液；
(2)、將步驟(I)得到的濾液在90°C的條件下進行減壓蒸餾濃縮至原體積的10%；
(3)、將步驟(2)的濃縮液經活性炭脫色、sevage法脫蛋白質后，用95%乙醇調節至溶液中乙醇濃度為55%，低溫靜置12小時，離心分離得到沉淀I和上清液；
(4)、將步驟(3)離心得到的上清液用95%乙醇調節至溶液中乙醇濃度為65%，低溫靜置12小時，離心分離得到沉淀II和上清液；
(5)、將步驟(4)離心得到的上清液用95%乙醇調節至溶液中乙醇濃度為75%，低溫靜置12小時，離心分離得到沉淀III和上清液；
(6)、將步驟(5)離心得到的用上清液95%乙醇調節至溶液中乙醇濃度為85%，低溫靜置12小時，離心分離得到沉淀IV ；
(7)、將沉淀廣IV用15倍去離子水全部充分溶解后上丙烯葡聚糖凝膠柱層析，用超純水洗脫，洗脫速度為O. 25ml/min, 10ml/tube,收集10號 50號管的洗脫液；
(8)合并步驟(7)收集得到的洗脫液將其放入冬凌草洗脫液的原料罐C1中，并與超臨界CO2抗溶劑系統的液體泵P1相連；
(9)、啟動超臨界CO2抗溶劑系統，其中結晶釜的溫度為55°C，結晶釜的壓力為35Mpa，CO2的流量為80L/hr ；
(10)、啟動超臨界CO2抗溶劑系統的夾帶劑泵P2和液體泵P1，選擇乙醇為夾帶劑，調節各自的頻率，使夾帶劑泵和液體泵的進料比為1: 1，洗脫液與夾帶劑混合后經超臨界CO2抗溶劑系統的納米噴嘴噴入結晶釜F1中，分離釜F2的溫度為55°C，分離壓力為5Mpa，納米噴嘴的口徑為60nm，洗膠液中的溶劑和夾帶劑進入分離釜中解析并分離，洗脫液中的溶質在結晶釜內析出為微細顆粒，該微細顆粒即為冬凌草納米微粒。本實施例制備的冬凌草納米微粒的平均粒徑為86. 5nm。實施例4
一種冬凌草納米微粒的制備方法，包括如下步驟
(1)、將冬凌草與去離子水按1:5混合后在85°C加熱條件下回流提取240min，趁熱過濾，濾渣重復上述操作I次，合并濾液；
(2)、將步驟(I)得到的濾液在85°C下進行減壓蒸餾濃縮至原體積的20%；
(3)、將步驟(2)的濃縮液經活性炭脫色、sevage法脫蛋白質后，用95%乙醇調節至溶液中乙醇濃度為55%，低溫靜置12小時，離心分離得到沉淀I和上清液； (4)、將步驟(3)離心得到的上清液用95%乙醇調節至溶液中乙醇濃度為65%，低溫靜置12小時，離心分離得到沉淀II和上清液；
(5)、將步驟(4)離心得到的上清液用95%乙醇調節至溶液中乙醇濃度為75%，低溫靜置12小時，離心分離得到沉淀III和上清液；
(6)、將步驟(5)離心得到的用上清液95%乙醇調節至溶液中乙醇濃度為85%，低溫靜置12小時，離心分離得到沉淀IV ；
(7)、將沉淀Γιν用10倍去離子水充分溶解后上葡聚糖凝膠柱層析，用超純水洗脫，洗脫速度為O. lml/min，每管10ml，收集30號 100號管的洗脫液；
(8)、合并步驟(7)收集得到的洗脫液將其放入冬凌草洗脫液的原料罐C1中，并與超臨界CO2抗溶劑系統的液體泵P1相連；
(9)、啟動超臨界CO2抗溶劑系統，其中結晶釜的溫度為40°C，結晶釜的壓力為12Mpa，CO2的流量為150L/hr ；
(10)、啟動超臨界CO2抗溶劑系統的夾帶劑泵P2和液體泵P1，選擇乙醇為夾帶劑，調節各自的頻率，使夾帶劑泵和液體泵的進料比為1: 5，洗脫液與夾帶劑混合后經超臨界CO2抗溶劑系統的納米噴嘴噴入結晶釜F1中，分離釜F2的溫度為45°C，分離壓力為5Mpa，納米噴嘴的口徑為80nm，洗膠液中的溶劑和夾帶劑進入分離釜中解析并分離，洗脫液中的溶質在結晶釜內析出為微細顆粒，該微細顆粒即為冬凌草納米微粒。本實施例制備的冬凌草納米微粒的平均粒徑為104. 8nm。實驗例I :
為了驗證冬凌草納米微粒可在防治骨質疏松癥方面的應用效果，按本發明制備方法得到的冬凌草納米微粒進行對去卵巢大鼠股骨骨密度的影響實驗
I、實驗方法
將32只SD雄性大鼠隨機分為4組，即對照組、模型組、納米給藥組和常規給藥組，每組8只。除對照組外，其余三組進行切除卵巢手術。4周后，給藥組分別進行冬凌草納米微粒和冬凌草常規制劑的灌胃給藥，對照組和模型組進行相同體積生理鹽水的灌胃給藥，連續給藥30d。30d后分別測定其骨密度。2、實驗結果
冬凌草對去卵巢大鼠股骨骨密度的測定結果如下表2。表2.冬凌草對去卵巢大鼠股骨骨密度的影響
權利要求
1.一種冬凌草納米微粒的制備方法，其特征在于包括如下步驟 (1)將冬凌草與去離子水或無水こ醇中的一種或兩種組合溶劑按I:I 20混合后，在回流提取溫度為70°C 95°C下回流提取30min 300min，趁熱過濾，得到濾渣和濾液； (2)將步驟(1)得到的濾液在60で^KTC的條件下進行減壓蒸餾濃縮至原體積的1/2 1/10 ； (3)將步驟(2)得到的濃縮濾液進行脫色、脫蛋白質處理，然后將處理液用95%こ醇調節至溶液中こ醇濃度為50%飛0%，低溫靜置12 24小時，離心分離得到沉淀物和上清液； (4)將沉淀物用1(Γ50倍的去離子水充分溶解，然后上凝膠柱進行層析，用超純水洗脫，洗脫速度為O. lmfl. Oml/min，用紫外分光光度法進行跟蹤并收集洗脫液； (5)將步驟(4)的洗脫液與超臨界CO2抗溶劑系統的液體泵相連； (6)啟動超臨界CO2抗溶劑系統，結晶釜的溫度為40°C 80°C，結晶釜的壓カ為8Mpa 50Mpa，CO2 的流量為 30 300L/hr ； (7)啟動超臨界CO2抗溶劑系統的夾帶劑泵和步驟(4)中的液體泵，洗脫液與甲醇、こ醇、こ酸こ酯或丙酮中的一種夾帶劑的進料比為10: f 1:10，洗脫液與夾帶劑先混合后，經超臨界CO2抗溶劑系統的納米噴嘴噴入結晶釜中，流量控制在IOOmf 1000ml/hr ;洗脫液中的溶劑和夾帶劑進入分離釜中解析并分離，洗脫液中的溶質在結晶釜內析出為微細顆粒，該微細顆粒即為冬凌草納米微粒。
2.根據權利要求I所述的冬凌草納米微粒的制備方法，其特征在于所述步驟(7)中的納米噴嘴的口徑為I lOOnm。
3.根據權利要求I所述的冬凌草納米微粒的制備方法，其特征在于所述的分離釜溫度為35°C 60°C,分離壓カ為4Mpa 7Mpa。
4.根據權利要求I所述的冬凌草納米微粒的制備方法，其特征在于所述的分離釜溫度為50 C，分尚壓力為5Mpa。
5.根據權利要求I所述的冬凌草納米微粒的制備方法，其特征在于所述的CO2氣體的純度不低于99%。
6.根據權利要求I所述的冬凌草納米微粒的制備方法，其特征在于所述的凝膠柱層析所用的填料為葡聚糖凝膠系列、瓊脂糖凝膠系列或丙烯葡聚糖凝膠系列中的ー種。
7.根據權利要求I所述的冬凌草納米微粒的制備方法，其特征在于將步驟(3)離心得到的上清液用95%こ醇調節至溶液中こ醇濃度為60°/Γ70%，低溫靜置12 24小時，離心分離得到沉淀物II和上清液；將上述離心得到的上清液用95%こ醇調節至溶液中こ醇濃度為709Γ80%，低溫靜置12 24小時，離心分離得到沉淀物III和上清液；再將上述離心得到的上清液用95%こ醇調節至溶液中こ醇濃度為80°/Γ90%，低溫靜置12 24小時，離心分離得到沉淀物IV ;將上述得到的沉淀物II、沉淀物III和沉淀物IV與步驟(3)中得到的沉淀物合并。
8.根據權利要求I所述的冬凌草納米微粒的制備方法，其特征在于將步驟(I)濾渣重復步驟(I)操作I次，合并濾液。
9.一種如權利要求I所述的制備方法制備的冬凌草納米微粒在防治骨質疏松癥方面的應用。
10.一種如權利要求I所述的制備方法制備的冬凌草納米微粒在制備防治骨質疏松癥方面藥物中 的應用。
全文摘要
本發明公開了一種冬凌草納米微粒的制備方法，主要是將冬凌草提取物采用超臨界CO2抗溶劑技術處理。本發明還公開了通過本發明制備方法制得的冬凌草納米微粒在治療骨質疏松方面的應用。本發明因采用超臨界CO2抗溶劑技術制備冬凌草納米微粒，無需脫除溶劑殘留、干燥、粉碎等后續處理工序，大大提高生產效率；整個過程中采用的CO2具有無臭、無毒、無污染、不易燃易爆的特點，使生產環境具有更高的安全性；產品中無溶劑殘留，使產品品質具有更高的安全性。
文檔編號A61K36/53GK102824405SQ20121034870
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月19日 優先權日2012年9月19日
發明者曾智平, 華健 申請人:華健