專利名稱：一種利用生物反應器生產犬細小病毒滅活疫苗的方法
技術領域：
本發明屬于獸用生物制品領域。更具體地，本發明涉及一種利用生物反應器工業化生產病毒疫苗的方法。
背景技術：
犬細小病毒病(Canineparvovirus disease, CPVD)是由犬細小病毒(Canineparvovirus,CPV)引起的犬的一種急性傳染病。可在犬和貓之間傳播，各種年齡的犬都能感染，斷奶后的幼齡犬最為易感，傳播速度快，發病率和死亡率高達70%以上。自正式報道犬細小病毒病在我國流行以來，該病對我國養犬業造成了極大的危害。給動物接 種疫苗是預防犬細小病毒感染的最有效的方法，目前國內生產犬細小病毒疫苗的方法多采用傳統轉瓶法或雞胚生產工藝，但與當前大規模動物疫苗生產不相適應，主要體現在培養病毒滴度低、產品質量不均一穩定、批間差大，生產效率低等。因此，特別需要一種新的均一高效的生產犬細小病毒滅活疫苗的方法。

發明內容
本發明提供一種利用生物反應器工業化生產犬細小病毒滅活疫苗的方法，該方法是利用生物反應器載體系統培養制苗用細胞，感染病毒后可獲得高效價的病毒抗原。該方法較現有的轉瓶或雞胚生產工藝具有病毒滴度高、質量均一穩定、生產效率高、過程可控性好的特點，是今后大規模工業化生產疫苗等生物制品的首要選擇和發展方向。本發明所采用的技術方案如下一種利用生物反應器工業化生產犬細小病毒滅活疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟I)應用生物反應器微載體和片狀載體系統培養制苗用細胞；2)接種犬細小病毒，進行生物反應器擴增病毒；3)收獲犬細小病毒的病毒培養液；4)犬細小病毒經二乙烯亞胺(BEI)滅活，加入佐劑制備疫苗。其中，優選的是，本發明步驟I)所用的制苗用細胞系為犬腎細胞系MDCK或貓腎細胞系F81。本發明步驟2)所接種的犬細小病毒毒株為CPV-2型病毒株。病毒是經過細胞適應性培養而來，具體方法為將犬細小病毒接種制苗用細胞后盲傳，即取接種病毒后病毒培養上清按I :3的量接種新鮮培養細胞進行不斷傳代，待細胞出現典型病變或上清中可明顯檢測到病毒為止，一般傳至3到5代即可，擴增并凍存病毒液作為反應器生產用毒種。本發明進一步優選的技術方案是，所用的生物反應器帶有Cell-Lift攪拌漿并使用Cytodex系列微載體培養系統；或者所用的生物反應器帶有籃式攪拌漿并使用酯片載體系統；或者，所用的生物反應器為一次性激流式生物反應器并使用紙片載體培養系統。其中，Cytodex系列微載體的使用濃度為5_20g/L ;酯片載體使用FibraCel disks圓盤狀酯片載體，其使用濃度為200-2000g每批次；紙片載體使用國產一次性聚酯纖維紙片載體，使用量為160g或1200g每批次。本發明進一步優選的技術方案是，步驟I)所述的生物反應器培養制苗用細胞工藝包含微載體單級或放大培養工藝，單級培養所用種子細胞為轉瓶或細胞工廠培養貼壁細胞，放大培養所用種子細胞為生物反應器微載體系統培養所獲細胞。單級培養優選為14L生物反應器單級培養模式，放大培養優選為14L到40L放大培養模式。具體放大方法為將微載體上生長細胞通過胰酶消化裝置消化下來以后，連同新的微載體一起導入到新的更大體積的生物反應器中繼續培養，依此方法放大到所需生產規模。本發明14L到40L放大培養模式采用一種胰酶消化裝置消化細胞，避免了大規模消化細胞工藝繁瑣及消化時間長的缺點，消化下來的細胞在微載體上重新貼附及生長狀態良好。本發明進一步優選的技術方案是，步驟I)所述的生物反應器培養制苗用細胞方式為補料分批培養方式或連續灌注的培養方式。其中，生物反應器片狀載體系統培養方式優選為補料分批培養方式，生物反應器微載體系統培養方式則優選為灌注培養方式。本發明進一步優選的技術方案是，步驟I)所述的生物反應器培養制苗工藝條件 溫度為 360C _37°C，攪拌轉速為 40RPM -60RPM，溶氧(DO)為 30%_60%，pH 為 7. 0-7. 2。本發明進一步優選的技術方案是，步驟I)所述的生物反應器培養制苗用細胞所用的細胞生長液為分別添加5-10%的小牛血清的DMEM/F12、DMEM、MEM或199培養基，在一具體的實施例中，采用的培養基為添加8%的小牛血清的DMEM/F12培養基。在一個具體的實施方式中，本發明采用的生物反應器載體培養系統中聚酯纖維紙片載體量160g，接種細胞密度為2-6X 109cells，優選的為2_4X 109cells，接種病毒前總細胞量在2X IOiciceIls以上。在另一個具體的實施例中，本發明所使用的Cytodex I微載體濃度為5-20g/L，優選的為6-10 g/L，接種細胞密度為O. 5-2X 106cellS/mL。本發明進一步優選的技術方案是，本發明的生物反應器培養模式可以是分批培養、補料分批培養、連續培養或灌注培養方式任一。在一個具體的實施例中，本發明所采用的制苗用細胞培養模式為補料分批培養方式，在另一個具體的實施例中，本發明所采用的制苗用細胞培養模式為連續灌注培養方式。生物反應器擴增病毒可以按任意比例接種犬細小病毒。優選的是，本發明步驟2)所述的犬細小病毒接種量按O. 001-0. IMOI進行接種，在更加優選的另一具體實施例中，本發明所采用的病毒接種量為O. 01M0I。MOI即病毒感染復數(Multiplicity Of Infection)的英文縮寫，直觀來講就是總病毒數與總細胞數的比值，通過取樣計數接種病毒前細胞濃度來確定接種病毒量。本發明進一步優選的技術方案是，步驟2)所述的病毒培養工藝為補料分批培養或連續灌注培養，采用的病毒維持培養基為原倍的或濃縮了 2-5倍的培養基，更優選為濃縮了 2-3倍的培養基。培養過程中，間歇補加營養物質如葡萄糖、谷氨酰胺、蛋白胨、酵母提取物或乳清蛋白水解物任一或其組合。本發明進一步優選的技術方案是，步驟2)生物反應器擴增培養工藝條件為溫度為 340C _35°C，攪拌轉速為 40RPM-50RPM，溶氧(DO)為 30%_60%，pH 為 7. 2-7. 4。病毒維持培養基為DMEM/F12、DMEM、MEM或199基礎培養基的任一之中添加O. 5%_2%的小牛血清，優選的是DMEM/F12基礎培養基中添加2%的小牛血清。病毒的收獲可以按任一方式收獲，本發明步驟3)所采用的病毒抗原收獲方式依病毒培養方式不同而可以米用不同收獲方式。病毒培養方式為補料分批培養時收獲病毒可米用分批收獲方式，病毒培養為連續灌注培養時收獲病毒可采用連續收獲方式。滅活是指用物理或化學手段殺死病毒、細菌等，但是不損害它們體內有用抗原的方法。生物制品行業制苗用病毒常用的滅活方法有甲醛滅活、BPL(i3_丙內酯)滅活及BEI (二乙烯亞胺)滅活，甲醛滅活以使病毒的蛋白、核酸變性來達到滅活而保留部分抗原的目的；BPL和BEI滅活是一種新型的病毒滅活方法，僅破壞病毒的核酸而不破壞病毒的蛋白質而達到滅活目的，保持病毒的免疫原性。本發明步驟4)所述的病毒滅活方法為BEI滅活，該方式滅活獲得的產品具有較好的免疫原性。除非另有說明，本發明涉及液體與液體之間的百分比時，所述的百分比為體積/體積百分比；本發明涉及液體與固體之間的百分比時，所述百分比為體積/重量百分比；本發明涉及固體與液體之間的百分比時，所述百分比為重量/體積百分比；其余為重量/重量百分比。


圖I為本發明利用生物反應器生產犬細小病毒滅活疫苗的工藝流程圖。圖2為14L生物反應器中微載體上細胞生長曲線圖。圖3a為細胞接種后12h的微載體體狀態圖。圖3b為細胞接種后培養60h的微載體體狀態圖。圖3c為接毒后36h的微載體體狀態圖。圖3d為接毒后96h的微載體體狀態圖。
具體實施例方式為了便于理解本發明，特例舉以下實施例，其作用應被理解為是對本發明的解釋和說明，而不用于限制本發明的范圍。實施例I IOL安普激流式生物反應器紙片載體系統培養生物反應器為安普AP20激流式生物反應器，配備一次性聚酯纖維紙片載體系統。細胞為貓腎傳代細胞F81，購自上海研晶生化，制苗用犬細小病毒為CPV-2型病毒株，其ATCC保藏號為VR-2016。DMEM/F12培養基購自北京清大天一公司，小牛血清購自武漢三利生物技術有限公司。I)生物反應器的準備及紙片載體的處理將細胞培養袋無菌條件下裝好電極，泵入新鮮培養基。細胞生長培養基為添加10%小牛血清的DMEM/F12液體培養基。將無菌pH7. 2的磷酸鹽緩沖液(PBS)導入預裝有紙片載體的灌注培養袋中，浸泡過夜。將PH7. 2的PBS排出，開啟循環泵讓灌注袋中充滿細胞生長培養基。設定溫度、攪拌轉速及通氣，無菌備用。2)接種細胞進行反應器培養用轉瓶靜置培養種子細胞，按總細胞為2X IO9ceIls的細胞量接種IOL安普生物反應器，灌注培養袋中預裝載體量為160g。設定工藝條件如下溫度為37°C，攪拌轉速為50RPM，pH為7. 2 (CO2和加NaHCO3調節)，溶氧為50%(氮氣和空氣調節)。過程中每12h取樣測定葡萄糖消耗情況，若葡萄糖濃度過低可置換部分新鮮培養基。 3 )接種病毒及病毒增殖培養細胞培養4-5天后，當葡萄糖日消耗量超過2g，預測細胞總量達2X IOiciceIls時按O. 01M0I接種犬細小病毒,接種病毒后靜置培養6h,后打開循環泵,用病毒維持液置換細胞生長培養基為病毒維持培養基，讓灌注袋中充滿病毒維持培養基，病毒維持培養基為DMEM培養基添加2%的小牛血清。設定工藝條件如下溫度為34°C，攪拌轉速為50RPM，pH為7. 3 (CO2和加NaHCO3調節)，溶氧為60% (氮氣和空氣調節)，過程依葡萄糖消耗需補加原倍的或濃縮的培養基，當糖耗明顯降低或取樣明顯觀察到游離細胞時結束培養，過程可分批收獲病毒液，病毒培養周期為2-4天。4)病毒血凝效價檢測
(I)在“V”型微量反應板上進行。每孔加入50uL，pH 7. 2的O. 01mol/L的PBS液或生理鹽水，向第I孔滴加步驟3)所收獲的病毒上清50uL，吸放3 5次混勻，然后從第一孔吸出50uL加入第二孔，以相同方法混勻，再從第二孔吸50uL加入第三孔，如此做倍比稀釋至倒數第二孔，再從倒數第二孔吸出50uL棄去，最后一孔不加病毒(抗原)作為紅細胞對照。(2)吸取O. 5%雞紅細胞懸浮液，每孔滴加50uL，加畢后在微量振蕩器上振蕩15 30秒，使其混合均勻，靜置室溫下或37°C溫箱中作用20 40分鐘。(3)當對照孔紅細胞全部沉入孔底中間，即可判定各孔的紅細胞凝集情況。以病毒最大的稀釋度孔出現100%凝集現象者為這個病毒的凝集價，即一個血凝單位。(4)所收獲病毒上清檢測步驟如下表，檢測結果顯示生物反應器分批補料培養病毒抗原血凝效價為可達213。表I為所收獲抗原HA效價檢測步驟及結果
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I 2 345 6 7 8 9 10 Il 材料對照
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pl72 B PiSCuL) W 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 ~50^ 醫霉濯團50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
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結果######### ++1 —'—注:#為完全凝集，++為不完全凝集，一為不凝集。5)病毒滅活及制苗將收獲的病毒液按O.Olmmol/mL的量加入BEI滅活過夜，滅活檢驗合格后按O. 5mg/mL的量加入氫氧化鋁膠佐劑配制疫苗，分裝凍干后制成成品。實施例2 14L NBS攪拌式生物反應器放大培養反應器為NBS公司Celligen 310生物反應器，帶Cell-Lift攪拌槳。微載體為GE公司Cytodexl載體，細胞生長培養基為DMEM/F12培養基(北京清大天一生物技術有限公司)添加10%的小牛血清(武漢三利生物技術有限公司)，貓腎傳代細胞F81購自上海研晶生化，CPV-2型病毒株為ATCC(美國菌種保藏中心)VR-2016毒株。I)生物反應器的準備將生物反應器罐體進行徹底清洗，將pH及DO電極進行標定后安裝到罐體上，包扎管道接口并進行檢漏試驗，完成后進行高壓蒸汽滅菌，滅菌條件為121 °C，30min，自然冷卻 至室溫。將無菌過濾好的細胞生長培養基無菌連接到反應器上，通過蠕動泵導入罐體，培養基的最少加入量以浸沒電極探頭為標準，設定參數，并打開反應器溫度、攪拌及通氣控制進行培養基的平衡和預培養，過夜待用。2)生物反應器培養制苗用細胞具體步驟為按GE公司的說明書預處理微載體，濃度為10g/L，之后連同細胞生長培養基導入到生物反應器中，設定生物反應器培養工藝條件為溫度為37°C，攪拌轉速為45RPM，DO為50%, pH為7. 2。待穩定后接種F81細胞，細胞密度在I X 106cells/mL后開始灌注生長液，后依細胞密度調整灌注速率為每天O. 5-2個工作體積，取樣顯微鏡觀察細胞完全長滿微載體后可用于接種病毒或者按如下方法放大培養將NBS 14L生物反應器長滿的微載體細胞導入到一種細胞消化裝置中，用無菌PH7. 2的PBS洗滌1-2次，加入胰酶消化5-10分鐘后加入生長液終止消化，并按總濃度10g/L的載體量加入新的微載體并導入到NBS 40L生物反應器中，同上述14L生物反應器培養參數設定培養工藝條件，采用連續灌注培養直到細胞長滿微載體，細胞生長周期為3-5天。生物反應器中微載體上細胞生長曲線如附圖2所示。3)接種病毒并培養繁殖病毒細胞取樣觀察全部長滿載體表面后，接種犬細小病毒。病毒接種量為0.01M0I。接種病毒后生物反應器培養工藝條件為溫度為34°C，攪拌轉速為50RPM，DO為60%，pH為7. 3，病毒維持液為DMEM培養基添加2%的小牛血清。接種病毒6h后用病毒維持液置換生物反應器中細胞生長液，灌注速率為每天O. 5-2個工作體積，24h后進行連續灌注培養病毒并連續收獲上清，直到細胞病變脫落后結束培養，并低溫保存病毒液，病毒培養時間為3-4天。顯微鏡觀察接種病毒前和接種病毒后生物反應器細胞貼附微載體情況如圖3所
/Jn ο4)病毒血凝效價檢測接種病毒后每24h取樣，按實施例I步驟4)檢測方法進行病毒血凝效價檢測，檢測結果見下表。表I生物反應器收獲病毒血凝效價測定結果
病毒培養時間~|24h |48h |72h |96h
權利要求
1.ー種利用生物反應器エ業化生產犬細小病毒滅活疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟 I)應用生物反應器微載體和片狀載體系統培養制苗用細胞； 2)接種犬細小病毒，進行生物反應器擴增病毒； 3)收獲犬細小病毒的病毒培養液； 4 )犬細小病毒經ニこ烯亞胺(BEI)滅活，加入佐劑制備疫苗。
2.根據權利要求I的利用生物反應器エ業化生產犬細小病毒滅活疫苗的方法，其特征在于，步驟I)所用的制苗用細胞為犬腎細胞系MDCK或貓腎細胞系F81，所述步驟2)使用的犬細小病毒毒株為CPV-2型病毒株。
3.根據權利要求I的利用生物反應器エ業化生產犬細小病毒滅活疫苗的方法，其特征在于，步驟I)所述生物反應器為 帶有Cell-Lift攪拌槳和Cytodex系列微載體培養系統的生物反應器，或 帶有籃式攪拌槳和Celligen310酯片載體系統的生物反應器，或 帶有紙片載體培養系統的一次性激流式生物反應器。
4.根據權利要求I的利用生物反應器エ業化生產犬細小病毒滅活疫苗的方法，其特征在于，所述步驟I)應用生物反應器微載體和片狀載體系統進行制苗用細胞的培養エ藝模式為14L生物反應器單級培養模式或14L到40L放大培養模式。
5.根據權利要求I的利用生物反應器エ業化生產犬細小病毒滅活疫苗的方法，其特征在于，步驟I)所述生物反應器培養制苗用細胞的エ藝條件為溫度為36°C _37°C，攪拌轉速為 40RPM -60RPM，溶氧(DO)為 30%_60%，pH 為 7. 0-7. 2，細胞生長培養基為 DMEM/F12、DMEM、MEM或199基礎培養基的任一之中添加5%-10%的小牛血清。
6.根據權利要求I的利用生物反應器エ業化生產犬細小病毒滅活疫苗的方法，其特征在于，步驟I)應用生物反應器微載體和片狀載體系統進行制苗用細胞培養所采用的培養方式為分批補料培養或連續灌注培養。
7.根據權利要求I的利用生物反應器エ業化生產犬細小病毒滅活疫苗的方法，其特征在于，步驟2)接種犬細小病毒后病毒擴增培養エ藝條件為溫度為34°C _35°C，攪拌轉速為40RPM-50RPM，溶氧(DO)為 30%_60%，pH 為 7. 2-7. 4。病毒維持培養基為 DMEM/F12、DMEM、MEM或199基礎培養基的任一之中添加O. 5%-2%的小牛血清。
8.根據權利要求I的利用生物反應器エ業化生產犬細小病毒滅活疫苗的方法，其特征在于，所述步驟2)接種犬細小病毒的接種量按O. 001M0I -O. IMOI進行接種。
9.根據權利要求I的利用生物反應器エ業化生產犬細小病毒滅活疫苗的方法，其特征在干，步驟2)所采用的病毒培養方式為分批補料培養和連續灌注培養；分批補料培養所用培養基為原倍或濃縮2-5倍的病毒維持培養基，并間歇補加營養物質，所述營養物質選自葡萄糖、谷氨酰胺、蛋白胨、酵母提取物、乳清蛋白水解物中的任一或二者以上的組合。
10.根據權利要求I的利用生物反應器エ業化生產犬細小病毒滅活疫苗的方法，其特征在于，步驟3)所采用的收獲犬細小病毒的方法為分批收獲或連續收獲方式。
全文摘要
本發明公開了一種利用生物反應器生產犬細小病毒滅活疫苗的方法，包括以下步驟(1)應用生物反應器微載體和片狀載體系統進行制苗用細胞培養; (2)接種犬細小病毒并進行病毒擴增培養;(3)收獲病毒培養液;(4)病毒液經BEI滅活，加入佐劑制備疫苗。本發明具有培養細胞密度大、病毒滴度高、質量均一穩定、過程可控和生產效率高的優點，克服了現有轉瓶或雞胚生產工藝產品批間差大、抗原含量低和生產效率低的不足。
文檔編號A61K39/23GK102861329SQ20121034888
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月19日 優先權日2012年9月19日
發明者李偉, 劉潔, 秦紅剛, 漆世華, 朱薇, 謝紅玲, 韓興, 王楨楨, 王威, 溫文生 申請人:武漢中博生物股份有限公司