專利名稱：流腦多糖-蛋白質(zhì)綴合疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及ー種流腦多糖-蛋白質(zhì)綴合疫苗及制備方法。
背景技術(shù)：
奈瑟氏腦膜炎球菌(Neisserza meningitides)是全球細(xì)菌性腦膜炎的主要原因。在最近的30年中，地方性腦膜炎球菌疾病的發(fā)病率在發(fā)展中國(guó)家為每100,000人中10到25人(Reido，F(xiàn).X.等人，1995)。病例致死率在10到20%之間。病原腦膜炎球菌被多糖莢膜所包被，附著在生物體外膜表面?；谇v膜多糖的免疫學(xué)特異性，已經(jīng)鑒定出13種不同的腦膜炎球菌血清型。這13個(gè)血清型中的5個(gè)引起了大部分腦膜炎球菌疾??；它們包括血清型A、B、C、W-135和Y。血清型A引超大部分流行性疾病。血清型B、C和Y引起大多數(shù)地方性疾病和疾病的區(qū)域性爆發(fā)。人類是唯一已知的腦膜炎奈瑟氏球菌的天然攜帯者。腦膜炎球菌可被持續(xù)攜帶幾個(gè)月，腦膜炎球菌通過(guò)直接接觸或通過(guò)空氣飛沫傳播。對(duì)入侵的腦膜炎球菌的宿主防御依賴于補(bǔ)體介導(dǎo)的溶菌作用，而在其中發(fā)揮作用的血清抗體大部分是針對(duì)莢膜多糖的?；谀X膜炎球菌多糖的疫苗已經(jīng)被描述，其引起針對(duì)莢膜多糖的免疫應(yīng)答。這些抗體可以對(duì)血清型特異性腦膜炎球菌引起補(bǔ)體介導(dǎo)的溶菌作用。腦膜炎球菌多糖疫苗顯示對(duì)兒童和成人有效，但對(duì)于嬰兒和幼兒其效能有限。對(duì)年幼群體，此多糖的后繼給藥產(chǎn)生弱加強(qiáng)應(yīng)答或無(wú)加強(qiáng)應(yīng)答。腦膜炎球菌多糖疫苗的保護(hù)期不能持續(xù)很長(zhǎng)，并且據(jù)估計(jì)對(duì)成人和大于4歲的兒童而言為3到5年。對(duì)I至4歲的兒童而言保護(hù)期少于3年。多糖能與主要組織相容性復(fù)合體分子結(jié)合，而這是抗原呈遞和刺激T-輔助淋巴細(xì)胞的前提條件，也即它們是非T。細(xì)胞依賴性抗原。多糖能夠不需T-輔助淋巴細(xì)胞的輔助而刺激B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體。由于對(duì)B淋巴細(xì)胞的非T-細(xì)胞依賴性刺激，這些抗原免疫后缺乏記憶誘導(dǎo)。在成人體內(nèi)，多糖抗原可以產(chǎn)生非常有效的非T-細(xì)胞依賴性應(yīng)答，但在嬰兒和幼兒的不成熟免疫系統(tǒng)中這些非T-細(xì)胞依賴性應(yīng)答卻很弱。非T-細(xì)胞依賴性多糖抗原可以通過(guò)將多糖共價(jià)連接至蛋白質(zhì)分子(“載體”或“載體蛋白質(zhì)”)上而轉(zhuǎn)變?yōu)門-細(xì)胞依賴性抗原。與綴合疫苗的多糖組分結(jié)合的B細(xì)胞可以被肽特異的T輔助細(xì)胞激活，所述肽為綴合的載體蛋白質(zhì)的一部分。對(duì)載體蛋白質(zhì)的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答可以增加針對(duì)多糖的抗體的產(chǎn)生。目前國(guó)外已經(jīng)上市的流腦結(jié)合疫苗中，W-135型及Y型流腦多糖均在片段化后采用連接接頭與載體蛋白進(jìn)行連接(如中國(guó)專利CN100556459C描述的以TT為載體和W性或Y型寡糖結(jié)合的疫苗，中國(guó)專利CN1889975A描述的以CRM197為載體和W型或Y型寡糖結(jié)合的疫苗)。由于載體蛋白和天然多糖并沒(méi)有活性基團(tuán)可以反應(yīng)，連接接頭上是一種有機(jī)分子，一端具有和蛋白反應(yīng)的化學(xué)活性，另一端具體和多糖連接的化學(xué)活性。已經(jīng)被采用的接頭有己ニ酸ニ酰肼，1，4-丁ニ胺，N-こ酰高半胱氨酸硫內(nèi)酯等，有些接頭和蛋白或多糖連接反應(yīng)之前，必須對(duì)蛋白和多糖進(jìn)行衍生。這些接頭一般是惰性的，也就是不會(huì)與人體蛋白質(zhì)或其他大分子在生理?xiàng)l件下產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，而且在結(jié)合疫苗的制備エ藝中也會(huì)被盡量的去除，但是這些接頭存在于結(jié)合產(chǎn)物中，可引起人體免疫系統(tǒng)來(lái)針對(duì)這些接頭產(chǎn)生免疫反應(yīng)，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的無(wú)效抗體。目前用于流腦多糖結(jié)合疫苗不但采用接頭的エ藝，而且需要對(duì)多糖進(jìn)行解聚以降低其分子量，但是在這個(gè)過(guò)程中，多糖會(huì)有損失，從而增加了產(chǎn)品的總體生產(chǎn)成本。中國(guó)專利CN1889975A描述的以CRM197為載體和W型或Y型寡糖結(jié)合的疫苗的分子量一般在200KD以下。一般認(rèn)為大分子量的免疫原會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。因此有必要開發(fā)出分子量較大的免疫綴合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種流腦多糖-蛋白質(zhì)綴合疫苗。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種流腦多糖-蛋白質(zhì)綴合疫苗的制備方法。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種多價(jià)流腦多糖-蛋白質(zhì)綴合疫苗。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下流腦多糖-蛋白質(zhì)綴合疫苗，其特征是用[S-C]n-[N_P]m表不,其中S表不一種流腦多糖分子，C表示該流腦多糖分子中引入醛基的C原子，P表示CRM197蛋白分子，N表示該蛋白分子中賴氨酸側(cè)鏈氨基的N原子；n和m大于I且小于10 ;所述S的分子量>100KD ；所述[S-C]n-[N-P]m的平均分子量在200KD到2000KD之間，所述流腦多糖為W-135型和Y型流腦多糖中的至少ー種，所述流腦多糖為奈瑟氏腦膜炎球菌莢膜多糖的簡(jiǎn)稱。所述[S-C]n-[N-P]m的分子量?jī)?yōu)選為200KD到700KD之間。多價(jià)流腦多糖-蛋白質(zhì)綴合疫苗，包括上述流腦多糖-蛋白質(zhì)綴合疫苗，還包括A型流腦多糖與載體蛋白結(jié)合的綴合物和C型流腦多糖與載體蛋白結(jié)合的綴合物。流腦多糖-蛋白質(zhì)綴合疫苗的制備方法，包括如下步驟(I)將純化的流腦多糖溶解于水或こ酸鈉緩沖液中，按照流腦多糖與高碘酸鹽質(zhì)量比為I :0. 02-0.2的比例加入高碘酸鹽，活化反應(yīng)后，超濾或透析去除未反應(yīng)的高碘酸鹽，使流腦多糖上相鄰的雙羥基被氧化成醛基，得到引入醛基的活化流腦多糖；(2)按質(zhì)量比為0. 5-3 1的比例將步驟(I)獲得的活化流腦多糖和純化的載體蛋白CRM197溶解于磷酸鹽緩沖液中，調(diào)節(jié)pH到6. 5和8. 5之間，以氰基硼氫化鈉醛基摩爾比5-10的比例加入氰基硼氫化鈉，進(jìn)行還原胺反應(yīng)18-48小時(shí)，使活化流腦多糖的醛基和CRM197表面賴氨酸上的氨基產(chǎn)生聯(lián)接；(3)加入硼氫化鈉封閉活化流腦多糖上未反應(yīng)的醛基；通過(guò)硫銨沉淀或者疏水柱層析的方法去除未與載體蛋白CRM197產(chǎn)生反應(yīng)的游離流腦多糖，得到純化的流腦多糖-蛋白質(zhì)綴合疫苗；所述流腦多糖血清型為W-135和Y至少ー種，所述流腦多糖為奈瑟氏腦膜炎球菌莢膜多糖的簡(jiǎn)稱。上述疫苗還可以包括佐劑。佐劑選自鋁佐劑、弗氏佐劑、單磷酰脂A、CpG、QS-21、霍亂毒素或甲酰甲硫氨酰肽。鋁佐劑為磷酸鋁或氫氧化鋁。上述疫苗還可以包含藥學(xué)可接受的防腐剤。防腐劑選自芐醇、對(duì)羥苯甲酸酷、硫柳汞、氯代丁醇或苯扎氯銨。本發(fā)明的流腦多糖-蛋白質(zhì)綴合疫苗，Y型和W-135型流腦多糖未經(jīng)解聚エ藝過(guò)程，并且和蛋白質(zhì)之間的連接不通過(guò)連接頭。因此本發(fā)明的エ藝流程簡(jiǎn)單，收率高，生產(chǎn)成本低，且多糖蛋白比相對(duì)穩(wěn)定，并可在這一水平范圍內(nèi)進(jìn)行相対的人為控制，大大提高了疫苗的質(zhì)量穩(wěn)定性。


圖I為抗血清5倍稀釋時(shí)，針對(duì)流腦Y型多糖的免疫酶聯(lián)反應(yīng)OD值。圖2為抗血清5倍稀釋時(shí)，針對(duì)流腦W-135型多糖的免疫酶聯(lián)反應(yīng)OD值。圖3為抗血清3125倍稀釋后與各型多糖的免疫酶聯(lián)反應(yīng)OD值。
具體實(shí)施例方式莢膜多糖可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。在本發(fā)明中莢膜多糖制備自奈瑟氏腦膜炎球菌血清型A、C、W-135和Y。在相關(guān)的實(shí)施方案中，這些腦膜炎球菌血清型綴合物分別制備然后配制成單ー劑量形式。例如，從奈瑟氏腦膜炎球菌血清型A、C、W-135和Y分別純化莢膜多糖，而后分別與載體蛋白進(jìn)行連接。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中利用溫和氧化條件將來(lái)源于奈瑟氏腦膜炎球菌血清型A和C莢膜多糖部分解聚并活化，對(duì)奈瑟氏腦膜炎球菌血清型W-135和Y直接進(jìn)行活化而不進(jìn)行解聚エ藝。由于反應(yīng)參數(shù)決定了產(chǎn)品的分子特性，如多糖和蛋白的比例及分子量。因此，我們研究了不同參數(shù)條件下結(jié)合反應(yīng)獲得的產(chǎn)品的免疫原性，而確定合適的エ藝條件和最終的反應(yīng)物。流腦Y型多糖的活化反應(yīng)以及產(chǎn)生的產(chǎn)物由下列的反應(yīng)式所表示。
權(quán)利要求
1.流腦多糖-蛋白質(zhì)綴合疫苗，其特征是用[S-C]n-[N_P]m表不,其中S表不一種流腦多糖分子，C表示該流腦多糖分子中引入醛基的C原子，P表示CRM197蛋白分子，N表示該蛋白分子中賴氨酸側(cè)鏈氨基的N原子；11和111大于I且小于10 ;所述S的分子量>100KD ；所述[S-C]n-[N-P]m的平均分子量在200KD到2000KD之間，所述流腦多糖為W-135型和Y型流腦多糖中的至少一種，所述流腦多糖為奈瑟氏腦膜炎球菌莢膜多糖的簡(jiǎn)稱。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的流腦多糖-蛋白質(zhì)綴合疫苗，其特征是所述[S-C]n-[N-P]m的平均分子量在200KD到700KD之間。
3.多價(jià)流腦多糖-蛋白質(zhì)綴合疫苗，其特征是包括權(quán)利要求I或2流腦多糖-蛋白質(zhì)綴合疫苗，還包括A型流腦多糖與載體蛋白結(jié)合的綴合物和C型流腦多糖與載體蛋白結(jié)合的綴合物。
4.流腦多糖-蛋白質(zhì)綴合疫苗的制備方法，其特征是包括如下步驟 (1)將純化的流腦多糖溶解于水或乙酸鈉緩沖液中，按照流腦多糖與高碘酸鹽質(zhì)量比為I :0. 02-0. 2的比例加入高碘酸鹽，活化反應(yīng)后，超濾或透析去除未反應(yīng)的高碘酸鹽，使流腦多糖上相鄰的雙羥基被氧化成醛基，得到引入醛基的活化流腦多糖； (2)按質(zhì)量比為O.5-3 1的比例將步驟(I)獲得的所述活化流腦多糖和純化的載體蛋白CRM197溶解于磷酸鹽緩沖液中，調(diào)節(jié)pH到6. 5和8. 5之間，以氰基硼氫化鈉醛基摩爾比5-10的比例加入氰基硼氫化鈉進(jìn)行還原胺反應(yīng)18-48小時(shí)，使活化流腦多糖的醛基和CRM197表面賴氨酸上的氨基產(chǎn)生聯(lián)接； (3)加入硼氫化鈉封閉活化流腦多糖上未反應(yīng)的醛基；通過(guò)硫銨沉淀或者疏水柱層析的方法去除未與載體蛋白CRM197產(chǎn)生反應(yīng)的游離流腦多糖，得到純化的流腦多糖-蛋白質(zhì)綴合疫苗；所述流腦多糖血清型為W-135和Y至少一種，所述流腦多糖為奈瑟氏腦膜炎球菌莢膜多糖的簡(jiǎn)稱。
5.根據(jù)權(quán)利要求1，2或3所述的疫苗，其特征是還包括佐劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的疫苗，其特征是所述佐劑選自鋁佐劑、弗氏佐劑、單磷酰脂A、CpG> QS-21、霍亂毒素或甲酰甲硫氨酰肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗，其特征是所述鋁佐劑為磷酸鋁或氫氧化鋁。
8.根據(jù)權(quán)利要求1，2或3所述的疫苗，其特征是還包含藥學(xué)可接受的防腐劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的疫苗，其特征是所述防腐劑選自芐醇、對(duì)羥苯甲酸酯、硫柳汞、氯代丁醇或苯扎氯銨。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種流腦多糖-蛋白質(zhì)綴合疫苗及制備方法，所述疫苗是用[S-C]n-[N-P]m表示，其中S表示一種流腦多糖分子，C表示該流腦多糖分子中引入醛基的C原子，P表示CRM197蛋白分子，N表示該蛋白分子中賴氨酸側(cè)鏈氨基的N原子；所述流腦多糖為W-135型和Y型流腦多糖中的至少一種，本發(fā)明的疫苗，Y型和W-135型流腦多糖未經(jīng)解聚工藝過(guò)程，并且和蛋白質(zhì)之間的連接不通過(guò)連接頭。因此本發(fā)明的工藝流程簡(jiǎn)單，收率高，生產(chǎn)成本低，且多糖蛋白比相對(duì)穩(wěn)定，并可在這一水平范圍內(nèi)進(jìn)行相對(duì)的人為控制，大大提高了疫苗的質(zhì)量穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)A61K47/48GK102861326SQ20121035160
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日
發(fā)明者朱濤, 宇學(xué)峰, 劉正, 邵忠琦, 毛慧華, 邱東旭 申請(qǐng)人:天津康希諾生物技術(shù)有限公司