用于治療中風的神經保護性脂質體組合物和方法
【專利摘要】本發明提供了通過施用負載氙（Xe）的脂質體組合物來治療中風（諸如不明來源的中風）的方法。在一些方面，將Xe包封在發生回波的脂質體中，并且通過施加超聲刺激，可以增強Xe的釋放。還提供了用于治療中風的組合物，諸如負載了Xe或者與H2或H2S相組合的Xe的脂質體。
【專利說明】用于治療中風的神經保護性脂質體組合物和方法
[0001]發明背景
[0002]本發明在國立衛生研究院授予的授權號NS067454、HL 074002、HL059586和HL069509的政府支持下完成。政府具有本發明的某些權利。
[0003]1.發明領域
[0004]本發明整體涉及醫學、生物化學和分子生物學領域。更具體地，涉及用于治療中風的、使用生物保護性的脂質體的組合物和方法。
[0005]2.相關技術的描述
[0006]血栓性中風和出血性中風也稱作腦血管意外(CVA)，二者一起成為美國的第四主要死因，并且是成年人殘疾的最常見原因。兩種類型的中風的特征在于，由向腦供血的紊亂造成的腦功能的快速喪失。在血栓性中風中，由血塊造成的腦動脈的阻塞會導致腦組織缺血或流向一部分腦的腦血流的阻塞，最終導致腦損傷。相反地，在出血性中風中，血液從在腦內或在腦表面上的破損血管泄漏或爆發，導致神經學損傷。不論中風的類型如何，通過醫學干預在早期保護腦組織免于由血栓形成或出血造成的急性血管事件，仍然是挽救患者生命的最重要的要素。早期腦組織保護可以拓寬鑒別診斷和有效治療的安全窗口。盡管在發作時具有類似的初始征狀，有效的治療干預取決于患者發生的中風的類型。例如，已經證實，組織纖溶酶原激活劑(tPA)的施用會至少部分有效地治療血栓性中風，但是被禁止用于治療出血性中風。仍然需要用于治療 中風的新的有效治療劑，特別是順從在中風發作后立即施用的治療劑。

【發明內容】

[0007]在第一個實施方案中，提供了用于治療受試者的中風的方法，所述方法包括:給所述受試者施用有效量的組合物，所述組合物包含負載氙的發生回波的脂質體(Xe-ELIP)。在一些方面，所述受試者已經被確定患有出血性中風。在另一個實施方案中，提供了治療受試者的不明來源的中風(即，沒有確定受試者患有血栓性中風還是出血性中風)的方法，所述方法包括:給所述受試者施用有效量的組合物，所述組合物包含有效量的Xe-ELIP。因而，在一些方面，提供了用于治療受試者(例如，已經被診斷出出血性中風和/或血栓性中風的受試者)的出血性中風和血栓性中風的方法。在其它方面，將所述實施方案的方法定義為，治療受試者的顱內動脈瘤或蛛網膜下腔出血的方法，所述方法包括:給所述受試者施用有效量的組合物，所述組合物包含有效量的Xe-ELIP。在一些實施方案中,提供了組合物,所述組合物包含在藥學上可接受的載體中的Xe-ELIP。
[0008]在另一個實施方案中，提供了治療受試者的血栓性中風的方法，所述方法包括:(a)給所述受試者施用有效量的包含Xe-ELIP的第一組合物；和(b)給所述受試者施用有效量的包含組織纖溶酶原激活劑(tPA)的第二組合物。例如，在某些方面，順序地或基本上同時地(例如，在包含Xe-ELIP和tPA的組合物中)施用Xe-ELIP和tPA。在一些方面，所述實施方案的方法包括:在施用所述第一組合物以后約或小于約2、3、4、5、6、7或8小時，施用所述第二組合物。在其它方面，所述第一組合物的施用是在中風發作的約6小時內或更短。在其它方面，所述第二組合物另外包含有效量的Xe-ELIP。在另一個方面，所述實施方案的方法包括:Ca)給患有中風或具有不明來源中風的征狀的受試者施用有效量的包含Xe-ELIP的第一組合物；(b)鑒別所述受試者是患有血栓性中風還是患有出血性中風；和(C)給被鑒別為患有血栓性中風的受試者施用有效量的包含tPA的第二組合物。
[0009]因而，在其它實施方案中，提供了包含Xe-ELIP和tPA的藥物組合物。在一些方面，所述組合物的tPA被包含在脂質體(例如，發生回波的脂質體)中。在其它方面，所述組合物包含至少2種不同脂質體的料漿，其中第一脂質體包含Xe-ELIP，而第二脂質體包含tPA(例如，其中tPA脂質體基本上不含有Xe)。
[0010]在另一個實施方案中，提供了包含Xe-ELIP和脂質體(例如，發生回波的脂質體)的藥物組合物，所述脂質體負載了 H2S和/或H2。例如，在一些方面，所述氣體被包含在所述組合物的單獨脂質體(例如，負載了不同氣體的脂質體的料漿)中。在其它方面，所述氣體中的2種或更多種被包含在相同的脂質體中。例如，組合物可以包含這樣的脂質體:所述脂質體包含Xe和H2、Xe和H2S、或者Xe、H2和H2S。在其它方面，所述實施方案的脂質體包含約0.1%至5%、0.1%至3%、或0.5%至2%H2S (作為脂質體中的總氣體的百分比)。例如，所述脂質體可以包含約1%H2S和約99%Xe。在其它方面，所述實施方案的脂質體包含約1%至50%、5%至40%、或10%至40%H2 (作為脂質體中的總氣體的百分比)。例如，所述脂質體可以包含約 30%H2S 和約 70%Xe。
[0011]所述實施方案的某些方面涉及包含tPA的組合物。在一些方面，所述tPA是純化的或重組的哺乳動物tPA (例如，人tPA)。這樣的tPA組合物可以被包含在藥學上可接受的載體中。在某些方面，所述tPA被包含在脂質體中。用于包封tPA的脂質體可以選自本領域已知的或本文詳述的任意其它脂質體。例如，在一些方面，所述tPA被包含在所述實施方案的發生回波的脂質體中。在某些優選的方面，包含tPA的脂質體基本上不含有Xe (即，tPA和Xe沒有負載到相同的脂質體囊泡中)。
[0012]經由多種方法，可以將根據所述實施方案的組合物施用給受試者。例如，在一些方面,靜脈內地、動脈內地、顱內地、經由靜脈內輸注或經由動脈內輸注,施用組合物(例如,含有Xe或tPA的組合物)。在優選的方面，在中風或中風征狀發作以后不久，諸如中風發作或中風征狀發作的約或小于約1、2、3、4、5、6或8小時，施用所述實施方案的組合物。因而，在一些方面，由第一響應者(例如，護士或醫療技師)施用所述實施方案的組合物。
[0013]在某些方面，所述實施方案的方法包括:給受試者施用一個或多個劑量的ELIP組合物(例如，Xe-ELIP組合物)。例如，在一些方面，給受試者施用劑量為約0.6至3.0mg/kg的Xe-ELIP，諸如約0.8至2.8mg/kg (mg-脂質/kg-受試者)的劑量。在其它方面，給受試者施用劑量為約1.0至2.5mg/kg的ELIP組合物，諸如約1.14mg/kg或約2.27mg/kg。在其它方面，提供了 ELIP組合物，其包含在合適的容納裝置中的單個單位劑量(例如，Xe-ELIP的單個單位劑量)。例如，所述單個單位劑量(即，適合約60kg的人受試者的劑量)可以是約100 至約 3，OOOmg、約 250 至約 2，OOOmg、約 250 至約 I, OOOrng、或約 400 至約 900mg (例如，480-900mg)的具有被包封的氣體的ELIP (基于總脂質重量)。在其它方面，可以由被包封的Xe的總體積限定Xe-ELIP的單個單位劑量。在一些方面，在單個劑量中的Xe的總體積是小于約5ml，諸如約0.1至2.5ml、約0.2至2.0ml、或0.5至1.5ml (例如，約1.0ml的劑量)的Xe。因而，在一些具體方面，提供了 Xe-ELIP的單個單位劑量，其包含在合適的容納裝置中的250至約1，OOOmg的脂質和約0.1至2.5ml的Xe。技術人員會認識到,任意前述劑量范圍也可應用于包括H2和/或H2S的Xe-ELIP組合物(在該情況下，氣體體積可以應用于被包封的氣體的總量)。
[0014]在另一個方面，所述實施方案的組合物(例如，ELIP組合物)在多個劑量中施用給受試者。例如，在一些方面，給所述受試者施用所述組合物第2次、第3次或第4次。在某些方面，可以相對于第一次給藥調節第二劑量或以后的給藥的制劑、劑量或途徑。在一些方面，第2次或以后的給藥是在初次給藥以后約或小于約2、3、4、5、6、7或8小時(例如，在第I次給藥以后約4-6小時內)。在一些方面，在中風或中風征狀發作的約12小時內，給受試者施用所述實施方案的組合物2次。
[0015]在優選的方面，根據所述實施方案進行治療的受試者是人受試者。但是，在一些方面，所述受試者可以是非人動物，諸如非人靈長類動物或馴化的動物，諸如馬、狗或貓。在其它方面，所述受試者被鑒別為具有中風征狀，諸如突然的記憶喪失、完全或部分麻痹、定向障礙、說話困難、突然的視力障礙、部分身體的麻木、突然的嚴重的頭痛、或者行走或平衡困難。在一些方面，所述患有中風或具有中風征狀的受試者尚未被鑒別為患有血檢性中風或出血性中風。在其它方面，所述受試者已經被鑒別為患有血栓性中風和/或出血性中風。
[0016]在其它方面，給受試者施用所述實施方案的ELIP組合物另外包括:以有效地促進氣體從脂質體中釋放出的量，給所述受試者施加超聲刺激。例如，可以在施用ELIP組合物以后或伴隨地，施加超聲刺 激。在一些方面，在施用ELIP組合物(例如，Xe-ELIP)以后，諸如施用以后約或小于約10秒、20秒、30秒或1、2、3、4或5分鐘，施加超聲刺激。在某些情況下，在希望的脂質體釋放氣體的部位處或附近，施加超聲刺激。例如，在具有中風的受試者的情況下，可以將超聲刺激施加于頭或頸(例如，在頸動脈處)，從而刺激鄰近腦的脂質體有效載荷(payload)釋放。
[0017]多種用于給受試者施加超聲刺激的方法是已知的，且可以根據所述實施方案進行使用。例如，可以用常規超聲探頭或頸圈超聲裝置施加超聲刺激(例如，以提供在頸處的刺激)。施加給受試者的超聲刺激的功率和頻率可以變化，但是通常是有效地促進從脂質體釋放Xe (例如,體內釋放)的量。例如,可以以約I至8MHz的頻率施加超聲刺激，機械指數為約 0.1 至 1.4。
[0018]在其它方面，所述實施方案的方法另外包括:給所述受試者至少施用第二治療劑。例如，在血栓性中風的情況下，所述第二治療劑可以是減少血塊的血栓溶解劑。在其它方面，所述第二治療劑是抗炎劑或神經保護劑。在一些具體方面，例如，在血栓性中風的情況下，給受試者施用tPA。
[0019]在某些具體方面，所述第二治療劑包含負載H2S和/或4的發生回波的脂質體。在一些情況下，負載H2S和/或H2的發生回波的脂質體和負載Xe的發生回波的脂質體被包含在相同的組合物中。例如，所述實施方案的組合物可以包含這樣的發生回波的脂質體:所述脂質體分別包含Xe、H2S和/或H2。或者，所述組合物可以包含這樣的發生回波的脂質體:所述脂質體包含2種或3種氣體(例如，選自Xe、H2S和H2的2種或更多種氣體)。
[0020]在其它方面，根據所述實施方案的施用方法包括:在施用給受試者之前，制備液體脂質體懸浮液。例如，在一些方面，在施用之前不超過30分鐘、10分鐘、5分鐘或2分鐘，制備所述液體脂質體懸浮液。例如，在一些方面，制備液體脂質體懸浮液包括:將凍干的脂質體懸浮于溶液中，或融化冷凍的脂質體懸浮液。
[0021]在其它方面，所述實施方案的ELIP組合物包含額外的組分，諸如防腐劑、穩定劑和/或鹽。在一些方面，ELIP組合物至少包含第一種冷凍保護劑。根據所述實施方案使用的冷凍保護劑包括、但不限于:甘露醇、甘油、海藻糖、1，2-丙二醇或二甲基亞砜(DMS0)。
[0022]本文使用的“發生回波的脂質體”是指，通過超聲可以成像的脂質體。在具體的方面，發生回波的脂質體是這樣的脂質體:所述脂質體包含氣體組分(例如，Xe、H2S和/或和H2)，諸如包含在脂質體的疏水層中的氣體。發生回波的脂質體組合物和用于制備這種組合物的方法，提供在例如美國專利5，612，057,5, 858，399和7，976，743中，它們中的每一篇通過引用并入本文。在一些方面，由平均粒度限定所述實施方案的脂質體(例如，ELIP組合物)。例如，在一些方面，所述脂質體具有約0.4至10微米或0.8至10微米的平均尺寸(例如，約0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0 或 10.0 微米的平均尺寸)。
[0023]多種組分可以用于配制所述實施方案的脂質體，諸如負載了氣體(諸如Xe、H2和/或H2S)的ELIP。例如，所述實施方案的脂質體可以包含任意形式的磷脂酰膽堿(PC)(諸如二棕櫚酰基磷脂酰膽堿(DPPC))、任意形式的磷酸乙醇胺(PE)、聚乙二醇(PEG)或聚乙二醇化的磷脂、任意形式的磷脂酰甘油(PG)(諸如1，2- 二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’ -消旋-甘油)(DPPG))和/或膽固醇。在一些方面，脂質體包含至少一種PC、PE、帶負電荷的脂質、聚乙二醇化的脂質(例如，PEG2000-DPPE)和膽固醇分子。在一些具體方面，脂質體包含DPPC JPPC (EPC)、PEG2000-DPPE、DPPG和膽固醇。在其它方面，所述實施方案的脂質體由DPPC、EPC、PEG2000-DPPE、DPPG、膽固醇和氙組成，或基本上由它們組成。在其它方面，月旨質體由DPPC、EPC、PEG2000-DPPE、DPPG、膽固醇、Xe和H2、H2S或H2和H2S的組合組成，或基本上由它們組成。
[0024]如在本說明書中使用的，“一個”或“一種”可以表示一個(種)或多個(種)。如在權利要求中使用的，當結合詞語“包含”使用時，詞語“一個”或“一種”可以表示一個(種)或超過一個(種)。
[0025]在權利要求中使用的術語“或”用于表示“和/或”，除非明確地指出是僅指替代方案，或所述替代方案是相互排斥的，盡管公開內容支持僅指替代方案和“和/或”的定義。本文使用的“另一個(種)”可以表示至少第二個(種)或更多。
[0026]在本申請的通篇中，術語“約”用于表示，數值包括測定所述數值所用的裝置、方法所固有的誤差變化，或者研究受試者之間存在的變化。
[0027]從下述的詳細描述，會明白本發明的其它目的、特征和優點。然而，應當理解，詳細描述和具體實施例盡管示出了本發明的優選實施方案，但僅僅以例舉的方式給出，因為本領域的技術人員從該詳細描述會明白在本發明的精神和范圍內的各種改變和變型。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]下述附圖形成本說明書的一部分，且被包括用于進一步證實本發明的某些方面。結合本文呈現的具體實施方案的詳細描述，參照這些附圖中的一幅或多幅，可以更好地理解本發明。
[0029]圖1:含有氙的脂質體和超聲觸發的氙釋放的表征。(a)沒有氣體的傳統脂質體。(b)通過加壓冷凍方法制備的含有Xe的脂質體，其中Xe被捕集在脂質雙層中作為溶解的氣體或氣泡。(c和d)傳統脂質體和含有氣體的脂質體的電子顯微鏡圖像示出了含有氣體的脂質體的寬脂質雙層。傳統脂質體(e)和含有Xe的脂質體(f)的血管內超聲成像示出了來自含有Xe的脂質體的高超聲反射率。(g)氙從Xe-ELIP的超聲釋放具有2個階段:在前30min內快速釋放，隨后是持續超過18h的緩慢釋放(半衰期4.97±0.7小時)。超聲以功率依賴性的方式觸發Xe從Xe-ELIP的釋放(h)。
[0030]圖2 =Xe-ELIP的神經保護作用的時間窗。沒有治療(a)和在再灌注以后IOmin(b)、lh (c)和3h (d)用Xe-ELIP (7mg/kg)治療的大腦中動脈阻塞的冠狀腦切片(TTC染色)。白色區域是大腦中動脈阻塞以后的梗塞區域；腦的梗塞體積的定量表明，在再灌注以后IOmin和Ih時的Xe-ELIP施用顯著不同于無治療組。肢體放置(f)、橫梁行走(g)和網格行走(h)的神經學評估表明與TTC染色類似的結果。數據是平均值土標準差。
[0031]圖3 =Xe-ELIP對BDNF表達和細胞凋亡的影響。在中風以后24h在大腦皮質組織中的BDNF (a)、phos_Akt (b)和phos-ERK (c)的蛋白印跡分析表明,Xe增加了 BDNF (d)、總Akt (e)和phos-ERK (f)的表達。來自假手術組(g)、中風組(h)和經過Xe-ELIP治療的中風組(i)的腦切片的半影區的TUNEL染色，示出了經Xe-ELIP治療的動物中的細胞凋亡的減少。細胞凋亡的蛋白印跡和顯微照片是3個獨立實驗的代表。數據是平均值土SD。
[0032]圖4 =Xe-ELIP的神經保護作用的劑量響應。將沒有治療(a)和用3.5mg/kg (b)、7mg/kg (c)和14mg/kg (d)的Xe-ELIP治療過的大腦中動脈阻塞的冠狀腦切片(用TTC染色)成像。白色區域是大腦中動脈阻塞以后的梗塞區域。在(e)中顯示了腦的梗塞體積的定量。在指示的圖中提供了肢體放置(f)、橫梁行走(g)和網格行走(h)的神經學評估。數據是平均值土標準差。
[0033]圖5:與Xe遞送相組合的靜脈內tPA對大腦缺血的影響。在(a)假的、(b)沒有治療的缺血性中風、(c)經過tPA治療的缺血性中風、(d)與tPA相組合的Xe-ELIP治療過的缺血性中風以后，將代表性的經TTC染色的冠狀腦切片成像，所述切片示出了在大腦中動脈阻塞以后3天的大鼠中的腦梗塞。(e )治療組之間的梗塞體積對比，示出了單獨的tPA會使梗塞體積減小69%，與靜脈內tPA相組合的Xe-ELIP會使梗塞體積減小75%。在指示的圖中示出了肢體放置(f)、橫梁行走(g)和網格行走(h)的神經學評估。數據是平均值土標準差。
[0034]圖6a_b: (a)當在恢復血流之前或之后施用時，Xe-ELIP會提供神經保護作用。(b)在用Xe-ELIP和/或tPA進行指定的治療以后，動物中的凝塊質量損失百分比。
[0035]圖7:示意地示出了用于制備所述實施方案的發生回波的脂質體的實施例方案。
[0036]圖8:結果表明，Xe-ELIP會在絲穿孔蛛網膜下腔出血(SAH)大鼠模型中減少出血。
[0037]圖9:結果表明，Xe-ELIP會改善SAH大鼠的一般神經學評價尺度和運動功能。
[0038]圖10:結果表明，Xe-ELIP會預防神經元凋亡性細胞死亡。代表性的顯微照片示出了來自出血性中風組(上圖)和經過Xe-ELIP治療的`出血性中風組(下圖)的腦切片的TUNEL染色。左圖是總細胞的DAPI染色。中圖是凋亡細胞的tunel染色。右圖是合并的圖像。
[0039]圖11:結果表明，Xe-ELIP會降低SAH大鼠的死亡率，但是不會極大地影響腦水腫和腦血流量。
[0040]圖12:這些圖示出了實施例4的實驗的時間線。[0041] 圖13:示出了在 tMCAO 模型中用 Xe-ELIP、H2S/Xe_ELIP 和 H2/Xe_ELIP 治療中風的結果。
[0042]圖14:這些圖示出了用指示的組合物治療的大鼠中的神經殘疾的行為測試的結果，它們通過指示的肢體放置、橫梁行走和網格行走來評估。
[0043]圖15:這些圖示出了使用乳酸脫氫酶(LDH)釋放試驗的Xe-ELIP試劑保護人腦星形膠質細胞免于H2O2 (IOmM)細胞毒性的效力測試的結果。
[0044]圖16:這些圖示出了在干細胞中的Xe-ELIP細胞毒性的測試結果。H2O2會造成鼠胚胎干細胞中的顯著LDH釋放，但是Xe和Xe-ELIP試劑不會。在培養結束之前，用Xe-試劑(3mg ELIP/30 μ I氣體/ml)和對照介質處理細胞4小時和2小時；加入IOmM H2O20
[0045]示例性實施方案的描述
[0046]1.本發明
[0047]中風也稱作腦血管意外(CVA)，是美國的第三主要死因，并且是成年人殘疾的最常見原因。中風的特征在于，由向腦供血的紊亂造成的腦功能的快速喪失。在血栓性中風中，腦動脈的阻塞(血塊)會導致流向一部分腦的血流受阻。相反地，在出血性中風中，血液從在腦中的血管泄漏或爆發，導致神經學損傷。早期治療和/或外科手術在減輕中風導致的神經學損傷中是重要的。但是，取決于中風的類型，施用的療法是非常不同的，達到下述程度:在已經確定地鑒別出中風的類型之前，不可將治療劑(諸如tPA)施用給患有中風的患者。不幸的是，在中風的治療中最重要的因素是及時干預，這會限制治療劑(諸如tPA)的有用性。
[0048]本文詳述的研究證實了一種新類型的發生回波的脂質體的合成，所述脂質體包封氙氣體(Xe-ELIP)。經證實，所述Xe-ELIP制劑在施加超聲以后會快速地且有效地釋放出被包封的Xe(圖1)。還表明，包含這些脂質體的組合物不僅有效地治療血栓性中風，而且還令人驚奇地有效地治療出血性中風(參見圖2、4、8和9)。因而，Xe-ELIP首次代表治療劑，所述治療劑可以在中風(或中風征狀發作)以后立即施用給患者，且在可以確定地鑒別出中風的類型之前。不同于任意其它經鑒定的療法，Xe-ELIP因而可以保護神經元免于由血塊(缺血)和出血導致的損傷。重要的是，通過保護腦免于過度的神經學損傷(通過實際的神經元損傷和行為測試來評估)，Xe-ELIP為患者贏得重要的時間，同時可以進行外科手術或其它治療干預。因此，該新類型的治療劑會提供顯著改善所有中風類型的臨床結果的可能性。
[0049]令人感興趣地，本文詳述的研究同樣證實，Xe-ELIP可以與tPA施用協同地起作用，從而提供血栓性中風的有效治療(參見，圖5)。另外，使用Xe-ELIP的早期治療會在評估中風診斷的同時防止過度的神經元損傷。隨后的tPA施用(有或沒有另外的Xe-ELIP)則會介導凝塊分解，從而產生與單獨的tPA相比明顯更好的臨床結果。
[0050]本文呈現的其它研究證實，共同施用(或施用被共同包封的)H2或H2S氣體可以進一步增強Xe-ELIP的神經保護作用。如圖13-14所示，當與Xe-ELIP結合施用時，H2和H2S能夠進一步減小梗塞體積，并進一步改善在中風受試者中的結果，這通過行為測試來評估。此外，如在圖16中所證實的，沒有ELIP組合物(其包含Xe或Xe和H2或H2S)表現出顯著毒性，這在鼠胚胎干細胞中進行評估。因此，H2和/或H2S向Xe-ELIP組合物中的進一步摻入，可以進一步增強它們的神經保護效力。
[0051]I1.脂質體和脂質體組合物
[0052]“脂質體”是一般術語，包括通過產生封閉的脂質雙層或聚集體而形成的各種單層和多層脂質媒介物。脂質體可以表征為具有雙層膜的囊泡結構，其通常包含磷脂和內部介質，所述內部介質通常包含水性組合物。本文提供的脂質體包括單層脂質體、多層脂質體和多泡脂質體。本文提供的脂質體可以由帶正電荷的、帶負電荷的或中性的磷脂組成。在某些實施方案中，所述脂質體在電荷方面是中性的。
[0053]多層脂質體具有被水性介質隔開的多個脂質層。當含有磷脂的脂質懸浮于過量的水溶液中時，多層脂質體自然地形成。在形成封閉結構之前，脂質組分進行自身重排，并且在脂質雙層之間捕獲水和溶解的溶質(Ghosh和Bachhawat, 1991)。親脂分子或具有親脂區域的分子也可以溶解在脂質雙層中或與其結合。
[0054]在具體的方面，氣體被包封在脂質體中，以產生發生回波的脂質體，后者可以通過超聲的適當施加來成像和/或破裂。下面詳述了用于氣體包封的具體方法，并在實施例1以及圖1和7中進行例證。
[0055]如本領域普通技術人員已知的，通過不同的方法，可以制備根據本發明的實施方案使用的脂質體。例如，可以將磷脂(Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL)(例如中性磷脂二油酰基磷脂酰膽堿(D0PC)、二棕櫚酰基磷脂酰膽堿(DPPC)和/或EPC)溶解在醇或其它有機溶劑中，然后與要包含在脂質雙層中的組分混合。所述混合物可以另外包括不同的去污劑。通常，渦旋脂質混合物，在干冰/丙酮浴中冷凍，并凍干過夜。將凍干的制劑在_20°C或以下儲存延長的時間段。當需要時，重構凍干的脂質體，例如，在0.9%鹽水中。
[0056]或者，通過在容器(例如，梨形玻璃燒瓶)中在溶劑中混合脂質，可以制備脂質體。該容器的體積應該是預期的脂質體懸浮液的體積的十倍大。通過使用旋轉蒸發器，在負壓下在大約40°C去除溶劑。所述溶劑通常在約5分鐘至2小時內被去除，這取決于希望的脂質體體積。所述組合物可以在真空下在干燥器中進一步干燥。由于隨時間變質的趨勢，經干燥的脂質通常在約I周后丟棄。
[0057]在其它替代方法中，根據其它已知的實驗方法，可以制備脂質體(例如，參見 Bangham 等人，1965;Gregoriadis,1979;Deamer 和 Uster,1983;Szoka 和Papahadjopoulos, 1978,各自通過在相關部分中的引用并入本文)。可以與本發明的實施方案一起使用的其它脂質體包括:陽離子型脂質體，例如，如在W002/100435A1、美國專利5，962，016、美國申請 2004/0208921、W003/015757A1、W004029213A2、美國專利 5，030，453、和美國專利6，680，068 (在沒有放棄聲明下，它們都通過引用整體并入本文)中所述。在W004/002453A1中也描述了制備脂質體的方法。可以將中性脂質摻入陽離子型脂質體中(例如,Farhood等人，1995)。可以在某些實施方案中使用的不同的中性脂質體,公開在美國專利5，855，911 (它通過引用并入本文)中。這些方法的差別在于，它們各自的捕獲水性物質的能力以及它們各自的水性間隙與脂質之比。
[0058]脂質體的尺寸隨合成方法而異。在本發明的實施方案中的脂質體可以是多種尺寸。在某些實施方案中，脂質體較小，例如，外徑小于約lOOnm、約90nm、約80nm、約70nm、約60nm或小于約50nm。
[0059]在制備這樣的脂質體時，可以使用本文描述的或本領域普通技術人員已知的任何方法。制備脂質體的其它非限制性實例描述在下述文獻中:美國專利4，728，578、4，728，575,4, 737，323,4, 533，254,4, 162，282,4, 310，505 和 4，921，706 ;國際申請 PCT/ US85/01161 和 PCT/US89/05040 ;英國專利申請 GB 2193095A ;Mayer 等人，1986 ;Hope 等人，1985 ；Mayhew 等人 1987 ；Mayhew 等人，1984 ；Cheng 等人，1987 ;和 Liposome Technology,1984，每篇通過引用并入本文。
[0060]在某些實施方案中，基于脂質的納米顆粒是中性脂質體(例如，DOPC脂質體)。本文使用的“中性脂質體”或“不帶電荷的脂質體”被定義為，具有一種或多種脂質組分的月旨質體，所述脂質組分產生基本上中性的凈電荷(基本上不帶電荷)。“基本上中性的”或“基本上不帶電荷”是指，在給定的群體(例如，脂質體群體)內很少的(如果有的話)脂質組分包括未被另一組分的相反電荷抵消的電荷(即，少于10%的組分包括未被抵消的電荷，更優選地少于5%，最優選地少于1%)。在某些實施方案中，中性脂質體可以主要包括它們本身在生理條件下(即，在約PH 7)是中性的脂質和/或磷脂。
[0061]本發明的實施方案的基于脂質體和/或脂質的納米顆粒可以包含磷脂。在某些實施方案中，可以使用單一種類的磷脂來制備脂質體(例如，磷脂，諸如DPPC(由全部飽和的磷脂酰甘油或磷脂酰絲氨酸組成)，可以用于產生脂質體)。在其它實施方案中，可以使用超過一類磷脂來產生脂質體(例如，DPPC和EPC)。
[0062]磷脂包括，例如，磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺；因為磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿在生理條件下(即，在約pH 7 )是不帶電荷的，這些化合物可以具體地用于產生中性脂質體。在某些實施方案中，所述磷脂DOPC用于產生不帶電荷的脂質體。在某些實施方案中，可以使用不是磷脂的脂質(例如，膽固醇)。
[0063]磷脂包括甘油磷脂和某些鞘脂。磷脂包括、但不限于:二油酰基磷脂酰膽堿(“D0PC”)、卵磷脂酰膽堿(“EPC”)、二月桂酰基磷脂酰膽堿(“DLPC”)、二肉豆蘧酰基磷脂酰膽堿(“DMPC”)、二棕櫚酰基磷脂酰膽堿(“DPPC”)、二硬脂酰基磷脂酰膽堿(“DSPC”)、1-肉豆蘧酰基-2-棕櫚酰基磷脂酰膽堿(“MPPC”)、1-棕櫚酰基-2-肉豆蘧酰基磷脂酰膽堿(“PMPC”)、1-棕櫚酰基-2-硬脂酰基磷脂酰膽堿(“PSPC”)、1-硬脂酰基-2-棕櫚酰基磷脂酰膽堿(“SPPC”)、二月桂酰基磷脂酰甘油(“DLPG”)、二肉豆蘧酰基磷脂酰甘油(“DMPG”)、二棕櫚酰基磷脂酰甘油(“DPPG”)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(“DSPG”)、二硬脂酰基鞘磷脂(“DSSP”)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(“DSPE”)、二油酰基磷脂酰甘油(“D0PG”)、二肉豆蘧酰基磷脂酸(“DMPA”)、二棕櫚酰基磷脂酸(“DPPA”)、二肉豆蘧酰基磷脂酰乙醇胺(“DMPE”)、二棕櫚酰基磷脂酰乙醇胺(“DPPE”)、二肉豆蘧酰基磷脂酰絲氨酸(“DMPS”)、二棕櫚酰基磷脂酰絲氨酸(“DPPS”)、腦磷脂酰絲氨酸(“BPS”)、腦鞘磷脂(“BSP”)、二棕櫚酰基鞘磷脂(“DPSP”)、二肉豆蘧基磷脂酰膽堿(“DMPC”)、1，2- 二硬脂酰基-sn_甘油-3-磷酸膽堿(“DAPC”)、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(“DBPC”)、1，2-二二十碳烯酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(“DEPC”)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(“DOPE”)、棕櫚酰油酰基磷脂酰膽堿(“P0PC”)、棕櫚酰油酰基磷脂酰乙醇胺(“POPE”)、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺和二亞油酰基磷脂酰膽堿。
[0064]磷脂可以來自天然的或合成的來源。在某些實施方案中，使用來自天然來源的磷月旨(諸如卵或大豆磷脂酰膽堿、腦磷脂酸、腦或植物磷脂酰肌醇、心臟心磷脂和植物或細菌磷脂酰乙醇胺(或它們的氫化形式))作為磷脂。在一些方面，使用聚乙二醇化的脂質，諸如PEG2000-DPPE=1, 2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](它們可以都是mPEG mPEG磷脂，或都是磷脂酰乙醇胺)。
[0065]技術人員同樣會理解，可以調節各種脂質體組分的摩爾比，以優化遞送、包封等。在一些方面，例如，脂質體包含比率為約30-50:10-30:5-15:5-15:10-20或約40-50:20-30:5-10:5-10:10-20 的 DPPC:EPC:PEG2000-DPPE:DPPG:CH。具體比率的一些實例包括、但不限于:50:20:10:10:15 ；60:30:10:10:12 ；46:23:8:8:15 ；47:27:9:8:1348:28:7:7:13。[0066]在某些實施方案中，所述基于脂質的囊泡是D0TAP:膽固醇納米顆粒。通過混合陽離子型脂質DOTAP (1，2_雙(油酰氧基)-3-(三甲基銨基)-丙烷)與膽固醇，制備D0TAP:膽固醇納米顆粒。可以進一步用核酸制備囊泡，且囊泡可以形成這樣的結構(稱作“夾心’):其中所述核酸顯得濃縮在2個脂質雙層之間(美國專利6，770，291和6，413，544)。
[0067]A.負載氣體的脂質體
[0068]在某些實施方案中，本發明提供了容易地生產含有氣體的脂質體并同時進行藥物包封的方法。在示例性的實施方案中(參見實施例1)，通過水合脂質膜、聲處理、冷凍和融化等常規操作，制備磷脂和膽固醇的脂質體。通過在聲處理以后包括將脂質置于目標氣體壓力下的步驟，產生的脂質含有空氣。在平衡以后，冷凍所述樣品。然后使壓力降低至大氣壓，并融化懸浮液。該操作導致在適當(10mg/ml)濃度的脂質分散體捕集最高約10% (按體積計算)的量的空氣。被包封的氣體的量隨著氣體壓力和脂質濃度而增加。使用0.32M甘露醇來提供具有生理滲透性的水相，將1、2、4或6個大氣壓施加于4mg脂質。這會分別導致10、15、20和3(^1氣體的包封。盡管本發明的實施方案不限于任何具體機制，氣體包封的機制大概依賴于下述事實:即空氣(主要是氮和氧)像大多數溶質一樣難溶于冰中，因此從在冷凍過程中形成的冰中排除。被排除的空氣然后作為氣袋離開溶液，所述氣袋通過脂質包被而以某種形式穩定化。空氣在這些制品中的存在，會使它們對超聲敏感，使得最多一半的它們的水性內容物(可包括水溶性的藥物)可以在施加超聲的短時間(例如，10秒)被釋放。
[0069]本發明提供了將氣體導入脂質體中的方法，所述導入使得脂質體不僅反射超聲，而且在暴露于超聲或其它觸發操作時釋放它們的內容物。具有實踐重要性的是，在某些實施方案中使用與冷凍相組合的高壓的方法是非常簡單的，并允許與選擇的氣體的摻入一起容易地包封溶質。所述方法適用于制備超聲造影劑和超聲控制的藥物遞送系統。
[0070]用于制備脂質體的常規操作不允許摻入氣體，因為氣體在水中的溶解度較低。但是，根據亨利定律，氣體在液體中的溶解度與液體上面的氣體的壓力直接成比例。當所述氣體的壓力低于、等于或大于局部溫度下的平衡飽和值時，則認為溶液是不飽和的、飽和的或過飽和的。因而，如果增加壓力，會增加溶液中的氣體分子濃度，且當降低壓力時，多余的氣體作為蒸氣釋放。
[0071]本發明的某些實施方案的加壓-冷凍方法是基于該原理。冷凍的基本作用是，濃縮氣體和溶質分子，從而有利于它們的包封。實際上，多年來已知下述基本現象，即在冷凍過程中，空氣會釋放，并經常作為氣泡捕集在得到的冰中，此外還已知，細胞中的氣泡形成明顯促進長期保存細胞和組織時的冷凍損傷。
[0072]在下面，具體地在實施例1以及圖1和7中，提供了生產發生回波的脂質體的方法的示例性步驟。氣體在脂質體中的摻入與壓力成比例。如上面所指出的，如果脂質體的氣體吸收與第一步中在溶液中的量成比例，這從亨利定律可以預見到。盡管這會影響氣體捕集，但是冷凍步驟對溶解的氣體具有較大影響，并因而對氣體包封具有較大影響。盡管本發明不限于任何機理，但是據信，冷凍可能用于2個目的:增加溶解的氣體的局部濃度，和使主體氣相的小袋形成成核。像其它溶質一樣，氣體在液體水中的溶解度大于在固體冰中的溶解度。因而，隨著冰晶體生長，溶解的氣體逐漸從冰移動至未凍結的溶液，結果是，溶解的氣體在越來越少的液體溶液體積中越來越濃縮。當溶解的氣體濃度變得足夠高時，氣體氣泡可能成核并生長。根據成核理論，當總溶解的氣體壓力和周圍液體中的環境壓力之間的差異超過拉普拉斯壓力(Laplace pressure)(由于在表面張力影響下表面的收縮,在氣泡中產生的壓力)時，氣泡形成。
[0073]盡管顯而易見的是，冷凍會從水相中驅除氣體，但是如此驅除的氣泡停留在冷凍的分散體內何處是未知的。為了使分散體變得可反射超聲，必須存在具有高聲阻抗的表面的氣袋(如圖1所示)。氣體可能離開溶液，與脂質雙層的疏水內部接觸，所述疏水內部具有對于空氣的相對較低的表面張力；但是，海藻糖對空氣摻入的影響提示，涉及更復雜的過程。海藻糖(其通過促進玻璃態形成而不是它自身的或水的結晶，起冷凍保護劑的作用)比甘露醇支持遠遠更少的回聲產生(echogenicity)。甘露醇在糖類中的非常獨特之處在于，在冷卻以后，易于從溶液中結晶出。以前有人提出，冷凍甘露醇溶液會對脂質體造成損傷。與該發現相一致，且基于成核理論，多年前就做出提示:在被損傷膜的表面處的極性-非極性界面，可能是氮氣泡在減壓病中釋放的優選成核部位，所述減壓病影響快速減壓的潛水員。
[0074]另外，盡管本發明不限于任何具體機制，認為下述內容是含有氣體的脂質體形成過程的一部分。盡管在冰形成過程中的液相過飽和會造成初期的氣袋形成，這不可能是全部情況(whole story)，因為，如果是這樣的話，當在將壓力降回環境壓力之前融化樣品時，回聲產生不會特別低。在這些條件下，冰會融化，且產生的水基本上被脫氣，所以與脂質(處于所有形式)結合的空氣會擴散進該水中。另一方面，當先降低壓力再融化樣品時，在最初融化的溶液中的空氣濃度較高，因為它含有在加壓以后溶解在懸浮液中的大部分空氣。因為它的高溶質(甘露醇)含量，在脂質體環境中的冰會首先融化，然后立即將脂質暴露于環境壓力(I個大氣壓)。該最初融化階段不僅被空氣高度過飽和，而且還可能如在前一段中所述，含有氣袋，所述氣袋當暴露于環境壓力時會生長。因此，空氣會離開溶液，從而擴大氣體核(其大概在冷凍過程中形成)。結果是被脂質`單層穩定化的氣袋的形成。
[0075]此外，氣體(例如，Xe)和水性溶質的共包封在藥物遞送中具有優點，因為它允許通過施加超聲來釋放脂質體內容物。由于有聲學活性的脂質體也會反射超聲，因此不僅可以根據超聲的施加部位來定位藥物的釋放，而且可以在活化治療劑進行遞送的同時對治療劑成像。此外，脂質體本身的分子靶向也是可能的。
[0076]除了釋放脂質體內容物和提供該過程的圖像以外，超聲可能對組織產生與藥物遞送相協同的影響，即超聲的空化效應，這可以促進藥物向它的靶標的接近。例如，以前的方法發現，通過用高強度超聲破壞靶區域中的藥物填充的造影微氣泡，可以實現位點特異性的藥物遞送(Porter 等人，J Ultrasound Med 1996; 15 (8): 577-84.)。另外,Shohet 等人(Circulation2000; 101 (22):2554-6.)發現，白蛋白包被的微氣泡可以用于經由超聲介導的(US-mediated)微氣泡破壞將腺病毒轉基因有效地遞送至大鼠心肌。以前的工作還已經發現，在有聲學活性的脂質體存在下，并同時施加超聲，會增強質粒DNA的攝入(Huang等A ,Mol.Ther.2003; 7 (5):422，第 2 部分)。[0077]通過改變脂質體組成、被包封的氣體和/或超聲施加參數，能夠進一步提高發生回波的脂質體對超聲刺激的敏感性。脂質雙層通過疏水相互作用保持在一起，所述疏水相互作用傾向于使所述脂質雙層具有自密封性質，使得脂質體的脂質殼在表面更替以后迅速重新密封。因此，改變脂質膜的剛度可能會影響它對超聲的響應。最佳氣體的選擇涉及在脂質體中的高體積和在血流中的低釋放速率。最有效的超聲脈沖似乎是，在所述組織可以耐受的最高強度下的小量。
[0078]B.脂質體的靶向
[0079]通過在不損害脂質體遞送它們的有效載荷的能力的情況下添加配體，實現靶向遞送。預見到，這會實現向特定細胞、組織和器官(例如，腦中的特定部位)的遞送。基于配體的遞送系統的靶向特異性，是基于配體受體在不同細胞類型上的分布。所述靶向配體可以與納米顆粒非共價地或共價地結合，且可以通過本文討論的多種方法與納米顆粒綴合。
[0080]可以用于以所述實施方案的脂質體為靶標的分子的實例包括:抗體(或其片段)和適體(apatmer )。替代地或額外地預見到，可以使用細胞滲透性肽來將脂質體直接地遞送進細胞中。
[0081]II1.藥物組合物和給藥途徑
[0082]在臨床上應用脂質體(例如，包含氣體的脂質體)的情況下，必須制備脂質體復合物，作為適于預定用途的藥物組合物。通常，需要制備基本上不含熱原以及可能對人或動物有害的任何其它雜質的藥物組合物。通常還希望采用適宜的緩沖劑，以使復合物穩定，并允許其被靶細胞攝取。本發明的水性組合物包含有效量的Xe，所述Xe包封在如以上所討論的脂質體中，所述脂質體進一步分散在藥學上可接受的載體或水性介質中。這種組合物還稱為接種物。短語“藥學上”或“藥理學上可接受的”是指這樣的組合物:當施用給適當的動物或人時，其不會產生相反的、變應性的或其它不希望的反應。本文使用的“藥學上可接受的載體”包括任意的和所有的溶劑、分散介質、包衣劑、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。藥物活性物質的這樣的介質和試劑的使用是本領域公知的。除了與活性成分不相容的任何常規介質或試劑外，預見到其在治療組合物中的應用。還可以在所述組合物中摻入補充性的活性成分。
[0083]在適當地與表面活性劑(諸如羥丙基纖維素)相混合的水中，可以制備治療組合物的溶液。還可以在甘油、液體聚乙二醇及其混合物中以及在油中制備分散體。在常規的貯存和使用條件下，這些制劑含有防腐劑，以防止微生物的生長。本發明的治療組合物有利地以可注射的組合物的形式(作為液體溶液或懸浮液)施用；還可以制備固體形式，其適合在注射之前溶解或懸浮于液體中。還可以乳化這些制劑。用于這種目的的典型組合物包含藥學上可接受的載體。例如，所述組合物可以含有在每毫升磷酸鹽緩沖鹽水中的10mg、25mg、50mg或高至約IOOmg的人血清白蛋白。其它藥學上可接受的載體包括水溶液、無毒的賦形劑，包括鹽、防腐劑、緩沖劑等。
[0084]非水性溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有機酯諸如油酸乙酯。水性載體包括:水、醇/水溶液、鹽水溶液、腸胃外的媒介物(諸如氯化鈉、林格氏葡萄糖等)。靜脈內的媒介物包括流體和營養物補充劑。防腐劑包括抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體。根據眾所周知的參數，調節藥物組合物的各種組分的PH和確切濃度。其它制劑適用于口服給藥。口服制劑包括諸如下述的典型的賦形劑:例如，藥用級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。所述組合物通常采取溶液或懸浮液的形式。
[0085]本發明的實施方案的治療組合物可以包括經典的藥物制劑。根據本發明的治療組合物的施用可以是經由任意常規途徑，只要經由該途徑可到達靶組織即可。在該情況下，靜脈內的注射或輸注可能是優選的。這種組合物通常作為藥學上可接受的組合物(其包含生理上可接受的載體、緩沖劑或其它賦形劑)來施用。
[0086]基于預期的目標，確定治療組合物的有效量。術語“單位劑量”或“劑量”是指，適合用于受試者中的物理上離散的單元，每個單元含有預定量的治療組合物，經計算所述預定量與它的施用(即，適當的途徑和治療方案)相結合，會產生在上面討論的希望的響應。根據治療的次數和單位劑量，要施用的量取決于希望的保護。
[0087]從在動物研究中確定的有效劑量，可以外推出治療劑的有效劑量范圍。一般而言，根據下式，可以計算出以mg/kg為單位的人等效劑量(HED)(參見,例如，Reagan-Shaw等Λ , FASEB J.，22(3):659-661, 2008，它通過引用并入本文):
[0088]HED (mg/kg)=動物劑量(mg/kg) X (動物 Km/人 Km)
[0089]Km因子在轉換中的使用，會產生更準確的HED值，所述值是基于體表面積(BSA)，而不僅僅基于體重。人和各種動物的K111值是眾所周知的。例如，平均60kg的人(具有1.6m2的BSA)的Km是37，而20kg的兒童(BSA 0.8m2)具有25的Km。一些有關的動物模型的Km也是眾所周知的，包括:小鼠Km為3 (假定體重為0.02kg,且BSA為0.007);倉鼠Km為5 (假定體重為0.08kg，且BSA為0.02);大鼠1為6 (假定體重為0.15kg，且BSA為0.025);猴Km為12 (假定體重為3kg，且BSA為0.24)。
[0090]治療組合物的精確量取決于從業人員的判斷，且是每個個體所特有的。盡管如此，計算的HED劑量會提供一般指導。影響劑量的其它因素包括:患者的身體狀態和臨床狀態、給藥途徑、預期的治療目標以 及具體治療制劑的效能、穩定性和毒性。對于本發明的實施方案，預見到，治療性脂質體(例如，Xe-ELIP)劑量在人(成年人)中的量是大于約0.568mg/kg。例如，人劑量范圍可以是約0.6至3.0mg/kg、約0.8至2.8mg/kg或約1.0至2.5mg/kg。在一些具體方面，以約1.14mg/kg至約2.27mg/kg的劑量，將Xe-ELIP施用給人受試者。
[0091]IV.實施例
[0092]包括下述的實施例，以證實本發明的優選實施方案。本領域技術人員應該了解，在下述實施例中公開的技術代表由發明人揭示的在本發明的實踐中作用良好的技術，并因而可以認為構成其實踐的優選方式。然而，本領域技術人員在考慮本公開內容以后應當了解，在公開的具體實施方案中可以做出一些改變，并仍然獲得類似的或同樣的結果，而不脫離本發明的精神和范圍。
[0093]實施例1-Xe-ELIP生產和實驗方法
[0094]Xe-ELIP 生產
[0095]使用在圖7中示意地圖解的凍融方案(也參見，美國專利7，976，743，通過引用并入本文)，生產氙-ELIP。簡而言之，脂質體由下述物質組成:L-c1-磷脂酰膽堿(卵PC)，1，2_ 二掠櫚酸基-sn-甘油 _3_ 憐酸膽喊(DPPC; Avanti Polar Lipids, Alabaster, Ala),1，2- 二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG2000PE)和膽固醇(Sigma, St Louis, Mo)。在氯仿中混合5毫克脂質，在50°C水浴中用氬蒸發溶劑，以在玻璃瓶上形成薄膜。將脂質膜在真空下放置4至6小時，以完全去除溶劑。用0.32mol/L甘露醇水合干燥的脂質膜，至IOmg脂質/毫升的濃度，隨后聲處理5分鐘。將經聲處理的脂質體轉移至2-mL玻璃瓶，用特氟隆-橡膠隔片密封蓋子。用連接到27號1/2英寸的針的12-mL注射器，穿過特氟隆橡膠隔片將6毫升Xe (100%) (ConcordeSpecialty Gas Inc, Eatontown, NJ)注射進玻璃瓶中(應當指出，在該階段,可以摻入其它氣體和/或氣體混合物)。用干冰在-70°C下冷凍加壓的脂質體分散體至少半小時。在通過去除蓋子去掉瓶子的壓力以后，使脂質體分散體融化。Xe-ELIP的結構和氣體保留性質示于圖1。
[0096]MCA阻塞的大鼠模型 [0097]所有動物實驗均得到位于休斯頓(Houston)的得克薩斯保健科學中心大學(The University of Texas Health Science Center)的動物福利委員會的批準。在外科手術之前，將雄性 Sprague-Dawley 大鼠(260_280g，Harlan LaboratoriesInc.，Indianapolis, IN)禁食24小時，自由獲取水。在外科手術之前，如下誘導麻醉:將嚙齒類動物放入連續流入異氟烷的密封誘導室(咨詢Melanie)中5分鐘。在手術部位處皮下注射丁哌卡因(2mg/kg)，以提供局部鎮痛。如下誘導腦缺血:使用以前描述的管腔內縫合方法(Britton，等人2010，通過引用并入本文)，阻塞右大腦中動脈(MCA) 2小時。簡而言之，在頭骨中制作Imm直徑鉆孔，以利于在阻塞MCA之前測量局部腦灌注(CP)。接著，通過中線頸切口，暴露右頸總動脈(CCA)。然后在右頸外動脈(ECA)的遠端端部附近結扎它。分離內動脈，并與鄰近的組織分開。從右ECA推進制造的25-cm 4-0尼龍單絲，并插入右MCA中2小時，以引起缺血。使用激光多普勒流量計(其放置在缺血區上面在前因后面2mm和側面6mm處)，證實穿過MCA的局部血流的中斷。在所有實驗中，在缺血過程中維持體溫在37°C。將聚乙烯導管插入右股動脈，用于壓力記錄。
[0098]治療時間窗的測定
[0099]將動物隨機地分成4組(在每組中，n=8):(1)無治療組-僅MCA阻塞；(2)治療組“a”_在再灌注以后IOmin施用Xe-ELIP； (3)治療組“b” -在再灌注以后60min施用Xe-ELIP ; (4)治療組“c” -在再灌注以后180min施用Xe-ELIP。通過將改進的PESO管道插入右內頸動脈中，在4分鐘的時段內給每個治療組的所有大鼠施用200 μ I的Xe-ELIP。在Xe-ELIP施用過程中，將ICA暴露于1-MHz連續波超聲，所述超聲具有0.18MPa的峰至峰壓力波幅(1-W/cm2撥號設置)。在以后的3天中，進行神經學評估。在MCAO以后第3天，通過2%2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色，測定梗塞體積。
[0100]劑量依賴性的測定和Xe-ELIP施用的影響
[0101]將動物隨機地分成4組(在每組中，n=8):(1)無治療組-僅MCA阻塞；(2)治療組“a”_接受100 μ I劑量的Xe (IOmg Xe-ELIP/ml)； (3)治療組“b”_接受200 μ I劑量的Xe-ELIP (IOmg Xe-ELIP/ml); (3)治療組“c”接受 400 μ I 劑量的 Xe-ELIP (IOmg Xe-ELIP/ml)。通過將改進的PESO管道插入右內頸動脈中，在再灌注以后60min每個治療組的所有大鼠接受Xe-ELIP。在Xe-ELIP施用過程中，將ICA暴露于1-MHz連續波超聲，所述超聲具有0.18MPa的峰至峰壓力波幅(1-W/cm2撥號設置)。在MCAO以后3天，通過TTC染色，測定梗塞體積。在以后的3天中，進行神經學評估。在MCAO以后第3天，通過2%TTC染色，測定梗塞體積。
[0102]神經學評估[0103]由不了解治療組的觀察人員，在安靜且低照明的房間中進行小鼠的所有行為試驗。在外科手術以后第1、2和3天，通過記錄肢體放置、橫梁行走和網格行走能力，測試每只動物的運動功能和神經學結果。
[0104]通過觀察當提起動物的尾巴懸在桌子上方時動物的抬頭和向桌子伸出前肢的能力，評估肢體放置(零評分-無反應；評分為1- 10反應緩慢或延遲；評分為2-反應迅速,且充分執行)。通過觀察在跨橫梁(2.5x2.5x80cm)移動時保持平衡的能力，評估跨橫梁行走的能力。如下指定反應評分:評分O -沒有腳滑動地走過橫梁；評分1-抓住橫梁的側面進行移動；評分2-表現出跨橫梁的艱難蠕動，但是能夠移動；評分3-由于行走困難，需要超過10秒才能走過橫梁；評分4-不能走過橫梁；評分5 -不能在橫梁上移動身體或任何肢體；評分6-不能在橫梁上停留超過10秒。通過將動物放在不銹鋼網格地板(20cmx40cm，具有2cmX2cm的孔大小)上，評估網格行走能力。計數邁步的總數，直到最多50步。記錄腳錯失誤(foot fault error)(通過落入網格中的前肢或后肢的誤放來定義)的數目。
[0105]梗塞體積測量 [0106]在神經學評估以后第3天，處死動物。取出腦。使用Jacobowitz腦切片機，切成2mm厚的冠狀切片，然后用在I3BS中的2%2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)在3rC處染色20分鐘，用于梗塞體積測定。將染色的切片轉移至10%磷酸鹽緩沖的福爾馬林進行貯存。用Canon G7 10.0兆像素照相機，對切片拍攝照片，所述照相機安裝在Polaroid落地三腳架上，物距為8.5cm。使用Image Pro-Plus,傳遞和分析圖像，以計算梗塞體積。通過測量在均勻地切片(Imm)的腦切片上的梗塞面積，并將它們累加到一起(Simpson法則)，計算梗塞體積。通過將TTC未染色的(梗塞的)組織的體積除以全腦的體積，計算歸一化的梗塞體積與全腦體積之比。
[0107]凝膠電泳和免疫印跡
[0108]將動物分成3組:1)假的外科手術，沒有缺血；2)MCA0 2小時，沒有治療；和3) MCAO 2小時，并在動脈內施用Xe-ELIP (400 μ I)以后，再灌注I小時。收集腦組織切片，并在 Iml RIPA (Radio Tmmuno Precipitation Assay)緩沖液(Cell SignalingTechnology, MA, USA)中勻漿化，所述緩沖液含有蛋白酶抑制劑、苯基甲基磺酰氟(PMSF, ImM)和磷酸酶抑制劑混合液(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)0在中風發作以后7和24小時，收獲腦組織。提取全細胞蛋白，并用SONICS Vibra Cell(S0NICS& MATERIALS Inc，CT，USA)聲處理3次。收集上清液，并測量蛋白濃度。加載等量的蛋白(80yg)，并使用Tris-甘氨酸運行緩沖液系統電泳，在12%SDS_聚丙烯酰胺凝膠上分離2小時，然后轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore，MA，USA)。在不含吐溫-20的非哺乳動物封閉試劑(L1-C0R Biosciences, NE, USA)中封閉I小時以后，與BDNF 的第一抗體(1:250, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)、憐酸化的 AKT 的第一抗體(1:250，Cell Signaling Technology, MA, USA)或總 Akt 的第一抗體(1:500，CellSignaling Technology, MA, USA)和憐酸-ERK1/2 的第一抗體(1:250，Cell SignalingTechnology, MA, USA)或 Erkl/2 的第一抗體(:500, Cell Signaling Technology, MA, USA)一起在4°C溫育膜過夜。在用含有0.1%吐溫-20的Tris緩沖的鹽水(TBS-T)洗滌膜以后，與 IRDye 800CW Dky 抗-兔 IgG 第二抗體(H+L) (L1-CORBiosciences, NE, USA)—起在室溫溫育膜I小時。在TBS-T 0.1%中充分洗滌(沖洗2次，并洗滌3次，每次5min)以后，通過odyssey紅外成像系統(L1-COR Biosciences, NE, USA)使印跡顯影。為了確保等量的蛋白加載，用抗b-肌動蛋白(Sigma，MO，USA)在室溫重新探測膜I小時，然后與IRDye 680L T Gt抗-小鼠 IgG(H+L) (L1-COR Biosciences, NE, USA) 一起溫育 I 小時。使用相同的 odyssey紅外成像系統，掃描膜。使用NIH ImageJ軟件，分析所有蛋白帶的光密度。通過向b_肌動蛋白歸一化，定量所有靶蛋白，并計算為對應的對照組的倍數。
[0109]繞計分析
[0110]通過2個組的Wilcoxon秩檢驗或多個組的Kruskal-Wallis方差分析(AN0VA),進行非參數統計分析，并報告為大多數實驗的平均值和標準差。當在總體對比中檢測到差異時，進行所有組的平均秩的多重比較，用于所有逐對對比。將治療組之間的神經學結果對比報告為中位值和四分位數。使用Statistica (第9版，StatSoft Inc., Tulsa, OK)軟件進行統計分析。認為P〈0.05是顯著的。
[0111]實施例2-作為中風治療劑的Xe-ELIP
[0112]首先，如下研究了 Xe-ELIP療法的劑量依賴性:在Male Sprague-Dawley大鼠模型的中風發作以后3小時，注射l_4mg/大鼠的劑量范圍(3.5、7和14mg/kg)的Xe-ELIPjy^S大鼠模型具有右大腦中動脈血管內絲暫時阻塞(MCA0)(2小時)。在中風發作以后3小時接受7mg/kg或14mg/kg的Xe-ELIP的治療組的歸一化梗塞體積分別減少至6.0±2%(p=0.04)和3.7±2% (p=0.002)(圖4a-e)。該研究證實，在中風發作以后3小時內以大于2_4mg (例如，7mg/kg或更大)的劑量施用的Xe-ELIP會提供最好的神經保護。
[0113]在外科手術以后第1、2和3天，以觀察人員不知情的方式，通過在安靜且低照明的房間中記錄肢體放置、 橫梁行走和網格行走能力，進行神經學損傷的行為評估。示于圖4f-h的結果證實了用7mg/kg或14mg/kg治療的動物的非常顯著的行為改善。
[0114]然后在大鼠絲MCAO和血栓性MCAO模型上進一步研究了 Xe-ELIP的治療時間窗。在中風發作以后2、3和5小時(在再灌注以后IOmin、I小時和3小時)，芽過上升右頸總動脈，給絲MCAO模型施用Xe-ELIP。在非治療組中，形成大梗塞，其主要涉及大腦皮質和紋狀體，歸一化的梗塞體積占全腦的16±5.2%(228±74mm3)(圖2a，e)。在中風發作以后IOmin和2小時施用Xe-ELIP，使歸一化的梗塞體積從15±5.1% (對照)分別下降至4.9±1.2%(ρ=0.005)和6.0±3.4% (ρ=0.002)(圖2a_e)。在MCA阻塞和再灌注的最初幾個小時期間，組之間的核心體溫沒有差異。
[0115]在外科手術以后第1、2和3天，以觀察人員不知情的方式，通過在安靜且低照明的房間中記錄肢體放置、橫梁行走和網格行走能力，進行神經學損傷的行為評估。在中風發作以后3小時施用Xe-ELIP的組，在執行行為任務中表現出微小改善。在10分鐘和I小時時施用Xe-ELIP的組，從第I天開始在所有行為測試中表現出改善的行為，在第3天之前在所有測試中具有顯著的改善(圖2f-h)。經證實，氙作為谷氨酸受體(NMDA)拮抗劑來保護神經元損傷，而在早期的缺血事件中觀察到由過量胞外谷氨酸鹽積累造成的興奮性中毒效應。
[0116]在中風發作以后2小時(在再灌注以后IOmin)時的Xe-ELIP治療時間窗表現出治療效果。在臨床場合，用于中風治療的tPA施用受限于它的狹窄的治療時間窗。盡管85%的中風是由于循環凝塊對腦動脈的阻塞，15%的中風是出血性的。在從血栓性中風中排除出血性中風之前，不可以施用靜脈內tPA。因而，在靜脈內tPA之前施用神經保護劑來延長tPA治療時間窗，是一個非常有前途的臨床相關策略。因而，在中風發作以后2小時，但是在再灌注以前和以后，進一步研究了 Xe-ELIP施用的神經保護作用。在圖6a中，示出了在治療之前和之后Xe-ELIP對腦梗塞的減小。在再灌注以前和在再灌注以后，Xe-ELIP分別使歸一化的梗塞體積減小了 86 土 12%和67 土 7%。
[0117]在缺血性中風發作的4.5h內施用tPA，仍然是已經證實具有臨床益處的唯一治療。神經保護性聯合治療可以使缺血性神經元損傷的有害效應最小化。為了測試Xe-ELIP對tPA活性的影響，在豬血塊上，對比了 tPA在有Xe-ELIP存在下和單獨的tPA的血栓溶解有效性。在摻合游離Xe (Xe飽和溶液)30分鐘以后，tPA的血栓溶解作用受到抑制。當用Xe-ELIP摻合tPA時，它具有與單獨的tPA相同的血栓作用。這證實了 ELIP保護Xe免于與tPA相互作用的效應(圖6b)。
[0118] 接著研究了 Xe-ELIP在大鼠栓塞性中風模型中的治療效果。通過將13mm長的血塊注射進大腦中動脈中，在雄性Sprague-Dawley大鼠(n=16)中誘導血栓性中風。在治療組中，在發作阻塞以后2小時，靜脈內地輸注tPA( I Omg/kg )。在靜脈內tPA之前，靜脈內地施用Xe-ELIP。在5min的Xe-ELIP施用過程中，施加連續波超聲(IMHz，50%工作循環，0.5W/cm2)，以觸發從ELIP釋放Xe。沒有任何治療的血栓性中風對照組表現出最大的損傷和梗塞體積(全腦的17±5%)(圖5a-e)。tPA治療會將損傷和梗塞體積減小至5.2±0.4% (p=0.025，相對于中風)。與Xe-ELIP相組合的tPA治療會將梗塞體積進一步減小至1.5±0.4%(p=0.05，相對于tPA組)。行為缺陷與梗塞體積反相關。在tPA和tPA+Xe-ELIP治療組中，通過激光多普勒流量計監測的局部血流速度是類似的(圖5f-h)。該研究證實了通過施加IMHz超聲釋放的被ELIP包封的氙的神經保護作用。Xe-ELIP可以與tPA組合地使用，而不影響tPA血栓溶解活性。由治療條件導致的死亡率示于下面的表1。
[0119]表1:
[0120]
【權利要求】
1.一種用于在尚未確定患有血栓性中風或出血性中風的受試者中治療中風的組合物，所述組合物包括有效量的負載氙的發生回波的脂質體。
2.根據權利要求1所述的組合物，其中所述受試者尚未確定患有血栓性中風。
3.根據權利要求1所述的組合物，其中所述的組合物供靜脈內、動脈內、顱內、經由靜脈內輸注或經由動脈內輸注施用。
4.根據權利要求1所述的組合物，它還包含負載H2S或H2的發生回波的脂質體。
5.根據權利要求1所述的組合物，其中所述組合物是凍干的，或是冷凍的，或在懸浮液中。
6.根據權利要求1所述的組合物，其中所述組合物另外包含冷凍保護劑。
7.根據權利要求6所述的組合物，其中所述冷凍保護劑是甘露醇。
8.根據權利要求1所述的組合物，其中所述脂質體包含磷脂酰膽堿(PC)、磷酸乙醇胺(PE)、聚乙二醇(PEG)、磷脂酰甘油(PG)或磷脂酰絲氨酸(PS)或膽固醇。
9.根據權利要求8所述的組合物，其中所述脂質體包含至少一種PC、PE、帶負電荷的脂質、聚乙二醇化的脂質和膽固醇分子。
10.根據權利要求8所述的組合物，其中: Ca)所述PC包括二棕櫚酰基磷脂酰膽堿(DPPC)或卵磷脂酰膽堿(EPC)； (b)所述P·EG 包括 PEG2000-DPPE ;或 (c)所述PG包括1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸_(1’ -消旋-甘油)。
11.根據權利要求10所述的組合物，其中所述脂質體包含二棕櫚酰基磷脂酰膽堿(DPPC)、卵磷脂酰膽堿(EPC)、PEG2000-DPPE、DPPG 和膽固醇。
12.根據權利要求11所述的組合物，其中所述脂質體基本上由DPPC、EPC、PEG2000-DPPE、DPPG、膽固醇和氙組成。
13.根據權利要求1所述的組合物，其中所述脂質體具有0.4至10微米的平均尺寸。
14.一種用于治療受試者的出血性中風和血栓性中風的組合物，所述組合物包括有效量的包含負載氙的發生回波的脂質體。
15.一種用于治療受試者的出血性中風的組合物，所述組合物包含有效量的負載氙的發生回波的脂質體。
16.一種藥物組合物，其包含負載氙的發生回波的脂質體和tPA。
17.一種藥物組合物，其包含負載Xe的發生回波的脂質體和負載H2S或H2的脂質體。
18.—種藥物組合物，其包含負載Xe的發生回波的脂質體，其中所述脂質體包含(I)第一 PC組分、(2)第二 PC組分、(3)聚乙二醇化的脂質組分、(4) PG組分和(5)膽固醇組分，且其中所述組分分別以約30-60:10-30:5-15:5-15:10-20的比率存在。
19.一種試劑盒，它包含前述權利要求任一所述的組合物和超聲刺激裝置。
20.如權利要求19所述的試劑盒，其中所述的超聲刺激裝置是常規的超聲探頭或頸圈的超聲裝置。
【文檔編號】A61P7/02GK103565745SQ201210356929
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年9月21日 優先權日:2012年8月10日
【發明者】黃韶玲, M·E·克萊格曼, 耿永健, 金亨建, D·D·麥克弗森 申請人:德克薩斯州大學系統董事會