一種復合種子細胞的組織工程神經的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種復合神經誘導的骨髓間充質干細胞的組織工程神經的制備方法，在Sondell制備法的基礎上，采用改良的酶-低滲-化學除垢劑三聯萃取神經，在體外構建具有生物活性的組織工程周圍神經，然后復合在體外培養、擴增和神經分化誘導骨髓間充質干細胞。本發明克服了目前較為認可的化學制備方法Sondell法在一定程度上對神經基膜管和細胞外基質結構的破壞作用，減少其了對軸突再生的影響。本發明所制備的復合神經誘導的骨髓間充質干細胞的組織工程神經可應用于制備神經移植物，對周圍神經缺損修復效果良好。
【專利說明】ー種復合種子細胞的組織工程神經的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫用材料的組織工程【技術領域】，涉及ー種復合神經誘導的骨髓間充質干細胞的組織工程神經的制備方法。
【背景技術】
[0002]臨床上經常遇到因腫瘤切除，創傷等原因造成的周圍神經缺損問題，使患者肢體肌肉萎縮，運動感覺功能受到損害。治療的方法是如果缺損距離較短時，可以通過解剖游離，做到無張カ縫合，當缺損距離過大時，通常需要進行自體神經移植。自體神經移植雖然有肯定的療效并且作為其他治療方法比較的金標準，但存在很多難以克服的缺點，最致命的缺點是可供選擇的神經供體實在有限[1]。至今尚沒有ー種合適的替代物能有效的取代自體神經移植。
[0003]材料科學、工程學和生命科學等相關學科的發展和交叉融合產生了再生醫學領域內一門新興學科——組織工程，即應用生命科學和工程學的原理和方法，在正確認識機體生理和病理兩種狀態下的組織結構及功能的關系的基礎上研究開發用于修復，維護，促進人體各組織或器官損傷后的功能和形態的生物替代物，它是人類治療組織，器官功能衰退，缺失的一項新技木，與傳統的治療技術相比有無與倫比的優點。這項技術的基礎是要有合適的細胞支架，ー種材料作為支架必須具有一下要求:生物相容性，表面相容性，結構相容性，生物降解性，可滅菌性。過去所用的支架一般為合成支架，雖具有支架形態，結構，強度，降解的可控性，也可批量生產，但也帶來了生物相容性差、感染等問題。
[0004]細胞外基質(extracellularmatrixc, ECM)是組織中除細胞外的所有成分,包括均質狀態的基質(蛋白多糖和糖蛋白)和細絲狀的膠原纖維。近年來隨著組織工程學的發展，經大量研究表明，ECM是細胞附著的基本框架和代謝場所，其形態和功能直接影響所構成的組織形態和功能。完整的ECM內可能存在著某些復合生長因子，可誘導調節細胞的生長、繁殖和分化等。細胞外基質在哺乳動物的發育和生理活動中起重要的作用，基質中的很多成分，如膠原的氨基酸序列在種屬間高度保守，這種同源性也為異種細胞外基質作為生物活性支架奠定了基礎。研究表明[2]，神經ECM成分有重要的生物學功能，不僅對神經再生有明顯的引導和促進作用，并且為神經再生構成了良好的微環境條件。
[0005]天然神經細胞外基質成分如層粘連蛋白(LN)、纖維粘連蛋白(FN)、硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)、I型膠原、IV型膠原(Type IV collagen)等大分子物質具有促進軸突再生的作用。其中對層粘連蛋白的研究認為LN是有A鏈和B1鏈與B2鏈共同構成十字架型結構的多機能蛋白，是軸突生長方向的信息產物和刺激軸突生長作用最強的物質，并且對干細胞的分化遷移起重要作用。LN的作用機制可能與其激活轉錄因子從而引起基因表達有夫，存在構象改變，突觸識別及轉錄功能。LN促進軸突再生的機制，除加速神經突起的生長外，非常重要的是加速了干細胞的遷移和Buugner帶的形成。人硫酸肝素糖蛋白促成軸突生長的作用與層粘連蛋白和IV膠原形成一種復合物結構，改變空間構想從而產生相應的功能有夫。目前認為LN和IV型膠原之所以能夠促進突起的生長是因為神經細胞表面存在著能與它們功能基團相結合的受體，當受體與這些功能基團結合后受體調節神經細胞內的肌動蛋白絲，使其在細胞的邊緣聚合，受體與收縮的肌動蛋白絲相互作用產生張力，調節生長錐的型態和細胞骨架的動カ使得突起得以生長.Carbonetto等M認為I型膠原對神經突起的生長存在著一定的促進作用ECM中還含有多種神經營養因子如:神經生長因子(NGF)、睫狀源性神經營養因子(CNTF)、腦源性神經營養因子(BDNF)、膠原細胞源性神經營養因子(⑶NF)等都對運動神經元表達有不同程度的營養活性，其中⑶NF的營養活性最強。
[0006]由此可以看出:生物體細胞外基質是由不同含量的膠原，纖維粘連蛋白，層粘連蛋白，糖蛋白及糖胺聚糖按一定比例和結構建成的復雜的有機的統一整體，含有調節細胞分化遷移的各種生長因子和信號分子。就目前的技術水平看，人們還沒有能力制造出完全模擬細胞外基質結構和功能的支架，所以脫細胞的細胞外基質就成為組織工程支架最佳選擇。Kim BSM等用異體的脫細胞神經復合NGF (神經生長因子)和VEGF (血管內皮生長因子)后修復大鼠坐骨神經，發現其運動，傷害感受及本體感受均有顯著改善，進ー步證實脫細胞異體神經移植可以功能性的促進周圍神經再生。國內盧世壁等[5]用三硝基甲苯和脫氧膽酸納萃取異體神經，可將細胞及抗原脫去，并且很好的保留了基底膜和層粘連蛋白等促進軸突再生的成分和結構，成功得到了粗的長段的脫細胞異體神經。盡管脫細胞異體神經移植在國內外已取得了一些進展，但異體神經來源仍然有限，供給問題還是沒有完全解決。研究表明同種異體的同一組織之間細胞外基質的成分和結構是相同的，在某些不同種群之間，如豬和人的一些細胞外基質也是相似的。
[0007]同時隨著干細胞生物學的發展，干細胞可塑性開始受到關注。最近關于骨髓基質細胞的非傳統可塑性在周圍神經損傷中的應用引起了人們的極大關注te_8]。Dezawa等[9]報導了在體外通過一系列細胞因子的作用后，骨髄基質細胞可表達P75，S100,等膠質細胞標志，當其移植到大鼠坐骨神經損傷遠端的盲端管道后可整合入再生生長錐。Cuevas-也描述了將未誘導分化的骨髄基質細胞注射入神經損傷部位后的遷移分化和修復作用。Mel等[n]將骨髓基質細胞誘導成雪旺氏細胞樣細胞移植入大鼠坐骨神經損傷處，發現對損傷處的雪旺氏細胞的増殖起刺激和支持作用。故骨髓間充質干細胞作為雪旺細胞的替代品，彌補了雪旺細胞的取材來源、增殖純化、抗原特性等問題。
[0008]上述的參考文獻具體如下:
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【發明內容】

[0020]本發明解決的問題在于提供一種復合神經誘導的骨髓間充質干細胞的組織工程神經的制備方法，釆用組織工程的技術方法構建異種脫細胞神經基質，再用經過神經的誘導骨髓間充質干細胞與之復合，用于周圍神經缺損修復，以解決周圍神經損傷治療的難點。
[0021]本發明是通過以下技術方案來實現:
[0022]一種復合神經誘導的骨髓間充質干細胞的組織工程神經的制備方法，包括以下操作:
[0023]1)取離體的異種動物的外周神經組織，剔除其中的神經外血管、脂肪及結締組織之后，用胰蛋白酶處理；胰蛋白酶處理完成后終止消化，使用低滲處理液對神經組織進行低滲處理；
[0024]2)將低滲處理后的神經組織在SB-10溶液中震蕩浸泡12h以上，清洗后轉入含有Triton X200和SB-16的混合液中震蕩浸泡12h以上，清洗后得到脫細胞神經基質；
[0025]3)用含體積分數10-20%的胎牛血清和1-5 μ mol / L β -巰基こ醇的DMEM-F12培養基預誘導傳代后的骨髄間充質干細胞12-24h，無菌沖洗，然后培養基更換為含質量分數1-2% ニ甲基亞砜和體 積分數10-20%的胎牛血清的DMEM-F12培養基，誘導培養12 -24h ；
[0026]4)將脫細胞神經基質用DMEM-F12培養基充分浸潤，吸干培養基后37°C孵育，然后接種誘導培養后的神經誘導骨髄間充質干細胞，添加DMEM-F12培養，并補充胎牛血清至體積分數為10-20%，于37°C、5%C02、95%濕度的條件下培養48小時得到復合神經誘導的骨髓間充質干細胞的組織工程神經。
[0027]所述的外周神經組織是在顯微鏡下仔細剔除神經外血管、脂肪及結締組織；然后加入質量分數0.25%的胰蛋白酶，37°C下、以80-100次/分鐘的頻率震蕩水浴20-30分鐘；
[0028]傾去胰蛋白酶，PBS清洗終止胰蛋白酶消化，然后去離子水，25°C下、以80-100次/分鐘的頻率震蕩水浴3-4小時；再將低滲處理后的神經組織轉入滅菌的PBS溶液中潤洗。
[0029]所述的低滲處理后的神經組織是在SB-10溶液、含有Triton X200和SB-16的混合液交替多次循環處理之后，獲得脫細胞神經基質。
[0030]所述的低滲處理后的神經組織是在濃度為100-150mmol/L SB-10溶液中，在25°C下、以80-100次/分鐘的頻率震蕩水浴12-15小吋，然后轉入滅菌PBS溶液中清洗；
[0031]清洗后次轉入含有質量濃度0.14-0.20%的Triton X200和0.6-0.8mmol/L的SB-16的混合液中，在25°C下、以80-100次/分鐘的頻率震蕩水浴12-24小時，然后轉入滅菌PBS溶液中清洗；
[0032]清洗后第二次轉入濃度為100-150mmol/L SB-10溶液中，在25°C下、以80-100次/分鐘的頻率震蕩水浴5-10小吋，然后轉入滅菌PBS溶液中清洗；
[0033]清洗后第二次轉入含有質量濃度0.1`4-0.20%的Triton X200和0.6-0.8mmol/L的SB-16的混合液中，在25°C下、以80-100次/分鐘的頻率震蕩水浴10-15小時，然后轉入滅菌PBS溶液中清洗，獲得脫細胞神經基質，4°C保存。
[0034]所述的骨髄間充質干細胞的制備及傳代培養為:
[0035]取骨髓組織，使用含青霉素、鏈霉素各100U/ml的DMEM-F12培養基，沖洗吹打制成單細胞懸液，將細胞懸液和Percoll分離液混合后離心，收集離心液界面上乳白色云霧狀的細胞層，先后以PBS和DMEM-F12漂洗，用含體積分數10%胎牛血清的DMEM-F12培養基重懸細胞，計數5X 105個/ml后即接種于培養瓶中，置于37°C、5%C02、95%濕度的培養箱中進行原代培養，分別于1、3天半量換液，以后每3天全量換液1次；
[0036]待細胞長滿瓶底80%時進行傳代培養，以1 X 104個/ml傳代。
[0037]所述的步驟3)對骨髓間充質干細胞的誘導培養為:
[0038]用含體積分數20%的胎牛血清和3 μ mol / L β -巰基こ醇的DMEM-F12培養基預誘導傳代后的骨髄間充質干細胞24h，以無菌PBS沖洗，然后培養基更換為含質量分數2%ニ甲基亞砜和體積分數20%的胎牛血清的DMEM-F12培養基，誘導培養24h。
[0039]所述的步驟4)對骨髓間充質干細胞的培養為:
[0040]將脫細胞神經基質用DMEM-F12培養基浸潤12小吋，然后將培養基吸干，37°C下孵育5小吋；再將生長良好的神經誘導骨髄間充質干細胞，使用胰蛋白酶消化成細胞懸液，離心后用DMEM-F12培養液重懸，以104/cm2的密度接種在孵育后脫細胞神經基質上，以DMEM-F12為培養基，并補充胎牛血清的體積濃度至20%，置于37°C、5%C02、95%濕度的培養箱中培養48小吋，并在倒置顯微鏡下連續觀察細胞生長及污染情況。
[0041]所制備的復合神經誘導的骨髄間充質干細胞的組織工程神經在制備神經移植物中的應用。[0042]所制備的復合神經誘導的骨髓間充質干細胞的組織工程神經在制備周圍神經缺損修復的藥物中的應用。
[0043]所制備的神經誘導的骨髄間充質干細胞在制備雪旺細胞替代品中的應用。
[0044]與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果:
[0045]本發明提供的復合神經誘導的骨髓間充質干細胞的組織工程神經的制備方法，在Sondell制備法的基礎上，采用改良的酶_低滲_化學除垢劑三聯萃取神經，在體外構建具有生物活性的組織工程周圍神經，然后復合在體外培養、擴增和神經分化誘導骨髄間充質干細胞，用于周圍神經缺損修復。
[0046]由于本發明采用了酶(胰蛋白酶)_低滲(去離子水)-化學除垢劑三聯萃取法，其中Triton X200、SB-10和SB-16三種相對柔和的化學萃取劑的聯合使用，克服了目前較為認可的化學制備方法Sondell法在一定程度上對神經基膜管和細胞外基質結構的破壞作用，減少其了對軸突再生的影響，從而使得本發明制備的脫細胞神經基質具有能夠更加有效地保留神經組織天然的細胞外基質結構優勢。
[0047]本發明采用神經基質復合分化誘導的骨髄間充質干細胞的組織工程神經，具有良好的神經修復效果:經神經誘導干細胞組縫合神經處與周圍組織無明顯粘連，與正常神經連接處光滑無斷裂，表面可見微小血管網形成，似正常神經；以所制備的骨髄干細胞為雪旺細胞的替代品，彌補了雪旺細胞的取材來源、增殖純化、抗原特性等缺陷，構建的脫細胞組織工程神經更加符合神經組織的生理構成，移植物的修復效果較單純脫細胞神經基質更加明顯。【專利附圖】

【附圖說明】
[0048]圖1是本發明制備的脫細胞神經基質橫切片的HE染色圖片；
[0049]圖2是本發明制備的脫細胞神經基質的Masson三色染色圖片；
[0050]圖3是本發明制備的脫細胞神經基質的掃描電鏡圖片；
[0051]圖4是本發明制備的脫細胞神經基質的透射電鏡圖片；
[0052]圖5是實例中神經誘導的骨髄間充質干細胞和脫細胞神經基質共培養后第10天相差顯微鏡下觀察的圖片，可見大量類雪旺細胞；
[0053]圖6實例中未誘導的骨髄間充質干細胞和脫細胞神經基質共培養后第10天相差顯微鏡下觀察的圖片，可見大量梭形細胞。
【具體實施方式】
[0054]下面結合具體的實施例對本發明做進ー步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。
[0055]本發明提供的復合神經誘導的骨髄間充質干細胞的組織工程神經的制備方法，包括以下操作:
[0056]1)取離體的異種動物的外周神經組織，剔除其中的神經外血管、脂肪及結締組織之后，用胰蛋白酶處理；胰蛋白酶處理完成后終止消化，使用低滲處理液對神經組織進行低滲處理；
[0057]2)將低滲處理后的神經組織在SB-10溶液中震蕩浸泡12h以上，清洗后轉入含有Triton X200和SB-16的混合液中震蕩浸泡12h以上，清洗后得到脫細胞神經基質；
[0058]3)用含體積分數10-20%的胎牛血清和1-5 μ mol / L β -巰基こ醇的DMEM-F12培養基預誘導傳代后的骨髄間充質干細胞12-24h，無菌沖洗，然后培養基更換為含質量分數1-2% ニ甲基亞砜和體積分數10-20%的胎牛血清的DMEM-F12培養基，誘導培養12 -24h ；
[0059]4)將脫細胞神經基質用DMEM-F12培養基充分浸潤，吸干培養基后37°C孵育，然后接種誘導培養后的神經誘導骨髄間充質干細胞，添加DMEM-F12培養，并補充胎牛血清至體積分數為10-20%，于37°C、5%C02、95%濕度的條件下培養48小時，得到復合神經誘導的骨髓間充質干細胞的組織工程神經。
[0060]本發明首先對異種生物神經組織進行處理，在顯微鏡下仔細剔除神經外血管、月旨肪及結締組織，使用胰蛋白酶處理神經，以協助破壞在細胞膜和細胞外基質之間的結合，然后在使用低滲處理液(去離子水)對神經進行低滲處理，然后使用中性去細胞化學試劑SB-10溶液萃取，將萃取好的神經組織用PBS緩沖液清洗后接著使用陰離子處理劑TritonX200和中性去細胞化學試劑SB-16溶液萃取，之后再循環上述化學除垢劑的處理步驟，但作用時間減少，最后達到徹底清除神經細胞的目的以完成脫細胞神經基質的制備。取一定量的骨髄組織，吹打制成單細胞懸液，注入含Percoll分離液于離心管中離心，收集離心液上層云霧狀細胞，先后以PBS和DMEM-F12漂洗，用含有胎牛血清的DMEM-F12培養基重懸細胞后接種于培養瓶中，置于37°C、5%C02、95%濕度的培養箱中進行原代培養，之后定期更換細胞液。待細胞長滿瓶底8 0%時進行傳代培養。將傳代后的骨髄間充質干細胞用含胎牛血清和巰基こ醇(ΒΜΕ)的DMEM-F12培養基預誘導骨髓間充質干細胞，PBS沖洗后換成含ニ甲基亞砜(DMS0)和胎牛血清的DMEM-F12誘導。將誘導的骨髓間充質干細胞制成細胞懸液后分散、點狀注入事先制備好的脫細胞神經基質中，置入培養皿中培養。
[0061]所述的PBS溶液的pH為7.2-7.4 ;所述的SB-10溶液即ニ甲基硫代こ酸-10，為中性的去細胞化學劑；所述的SB-16溶液即ニ甲基硫代こ酸-16，亦為中性去細胞化學劑；所述的Triton X200溶液即三硝基甲苯X-100，為陰離子處理劑；所述的DMEM-F12培養基為ー種常用細胞培養基；所述的Percoll分離液是經過聚こ烯卩比咯燒酮(polyvinylpyrolidone,PVP)處理的硅膠顆粒混懸液；所述的胎牛血清為常見的細胞外培養液，其濃度可根據不同需要調整；所述的巰基こ醇和ニ甲基亞砜均為常見的化學試劑，以上試劑和培養基均可從生物公司購得，0.25%胰蛋白酶消化液可自行配制或者由生物公司購得。
[0062]下面結合具體的實施例來進行說明，其中脫細胞神經基質來源于York豬肋間神經；骨髄間充質干細胞來源于SD大鼠骨髄。
[0063]一種復合神經誘導的骨髄間充質干細胞的組織工程神經的制備方法，包括以下操作:
[0064]1)取健康York豬的外周神經組織(肋間神經60mm)，在顯微鏡下仔細剔除神經外血管、脂肪及結締組織；
[0065]2)取上述處理后的神經，加入0.25%胰蛋白酶，37°C中以100次/分鐘的頻率震蕩水浴30分鐘；
[0066]3)傾去上述容器中的胰蛋白酶，PBS清洗3遍，毎次5分鐘以終止胰酶消化，加入低滲溶液(去離子水)，25°C中以100次/分鐘的頻率震蕩水浴4小時；
[0067]4)將處理后的神經組織轉入含有滅菌PBS溶液中潤洗；
[0068]5)轉入含有濃度為125mmol/L的SB-10處理液中，在25°C中以100次/分鐘的頻率震蕩水浴15小吋；
[0069]6)轉入滅菌PBS溶液中清洗15分鐘，期間PBS溶液至少更換3次；
[0070]7)轉入 0.14%Triton X200 和 0.6mmol/L SB-16 混合處理液中，在 25°C 中以 100次/分鐘的頻率震蕩水浴24小時；
[0071]8)轉入滅菌PBS清洗液中清洗3次，每次5分鐘；
[0072]9)再次轉入含有濃度為125mmol/L的SB-10處理液繼續以先前條件震蕩萃取7小時；
[0073]10)滅菌PBS溶液清洗15分鐘，每5分鐘更換1次PBS溶液；
[0074]11)再次轉入的0.14%Triton X200和0.6mmol/L SB-16混合處理液中，同先前的條件震蕩萃取15小吋；
[0075]12)轉入含有滅菌PBS溶液中，4°C保存。
[0076]13)取一定量的骨髓組織，使用無血清DMEM-F12培養基(含青霉素、鏈霉素各100U/ml)沖洗吹打制成單細胞懸液，按細胞懸液和Percoll分離液以1:1的比例移至離心管中，將離心半徑調至8cm，以2000r/min的速率離心20分鐘，收集離心液界面上乳白色云霧狀的細胞層，先后以PBS和DMEM-F12漂洗，用含有10%胎牛血清的DMEM-F12培養基重懸細胞，計數5X 105個/ml后即接種于培養瓶中，置于37°C、5%C02、95%濕度的培養箱中進行原代培養，分別于1、3天半量換液，以后每3天全量換液1次。倒置相差顯微鏡觀察細胞培養全過程。待細胞長滿瓶底80%時進行傳代培養，以1 X 104個/ml傳代；
[0077]具體的，將SD大鼠斷頸處死，70%こ醇消毒，無菌條件下取股骨、脛骨，剔出周圍肌肉組織，剪去兩端骨骺，抽取5ml無血清DMEM-F12培養基(含青霉素、鏈霉素各100U/ml)沖洗骨髄腔，吹打制成單細胞懸液，注入含有5ml的Percoll分離液的離心管中，將離心半徑調至8cm，以2000r/min的速率離心20分鐘，收集離心液界面上乳白色云霧狀的細胞層，先后以PBS和DMEM-F12漂洗，用含有10%胎牛血清的DMEM-F12培養基重懸細胞，計數5 X 105個/ml后即接種于培養瓶中，置于37°C、5%C02、95%濕度的培養箱中進行原代培養，分別于1、3天半量換液，以后每3天全量換液1次。
[0078]14)用含20%胎牛血清和3 μ mol / Lβ-巰基こ醇(ΒΜΕ)的DMEM-F12培養基預誘導上述傳代后的骨髄間充質干細胞24小吋，以無菌PBS沖洗3次，然后換成含2%ニ甲基亞砜(DMS0)和20%胎牛血清的DMEM-F12，誘導24小時。
[0079]15)取制備好的脫細胞神經基質，用DMEM-F12培養基浸潤12小時，然后將培養基吸干，置于37°C的孵箱中5小吋。取生長良好的神經誘導骨髄間充質干細胞，使用0.25%胰酶消化成細胞懸液，800r/min離心5分鐘，DMEM-F12重懸，以104/cm2的密度接種在自制的脫細胞神經基質上，繼續選用為DMEM-F12培養基，補充20%胎牛血清，置于37°C、5%C02、95%濕度的培養箱中培養48小時，倒置顯微鏡下連續觀察細胞生長及污染情況。
[0080]參見圖1所示的脫細胞神經基質橫切片的HE染色圖片，可以看到圖片中的軸突及神經細胞均消失，代之以紅染的神經內膜形成的圓形空腔，周邊可見紅染的神經束膜及外膜；
[0081]參見圖2所示的脫細胞神經基質的Masson三色染色圖片，可以看到脫細胞神經基質只保存大量膠原成分(藍色);
[0082]參圖3所示的脫細胞神經基質的掃描電鏡圖片，可以看到神經基底膜保留，而管腔擴大；
[0083]參見圖4所示的脫細胞神經基質的透射電鏡圖片，可以看到神經髓鞘完全被清除。
[0084]由圖1-圖4可知，本發明所制備的脫細胞神經基質脫細胞相對完全，能夠更加有效地保留神經組織天然的細胞外基質結構。
[0085]參見圖5、圖6，神經誘導的骨髄間充質干細胞和脫細胞神經基質共培養后第10天相差顯微鏡下觀察的圖片，可見大量類雪旺細胞，能夠作為雪旺細胞的替代品；而未誘導的骨髄間充質干細胞和脫細胞神經基質共培養后，可見大量梭形細胞。
[0086]下面給出所制備的復合神經誘導的骨髄間充質干細胞的組織工程神經的移植實驗:
[0087]1)健康SD大鼠30只，雌雄各半，體重約180-220g/只，分成三組:復合神經誘導的骨髄間充質干細胞組、未誘導的骨髄間充質干細胞組和單純脫細胞神經基質組，每組10只。動物用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(用藥量0.4ml/100g)后，無菌條件下暴露右側坐骨神經，在梨狀肌下緣2_ 處造成長15_的坐骨神經缺損，三組將各自脫細胞神經支架與兩斷端用10-0無創線端端吻合，之后依次縫合臀大肌及皮膚。術后肌注慶大霉素4萬単位3次(1次/4h)，分籠飼養。
[0088]2)術后各組大鼠精神狀態可，活動良好，傷ロ無感染，復合神經誘導骨髄間充質干細胞組大鼠術后平均6天傷ロ愈合，足底皮膚紅腫，但無潰瘍；平均18天后術側足趾可著地行走，后蹬カ較好；未經誘導的骨髄間充質干細胞組大鼠術后平均7天傷ロ愈合，足底皮膚紅腫無潰瘍；平均21天后術側足趾可著地行走，后蹬カ亦較好；單純支架組大鼠5d后足底皮膚紅腫潰瘍，4周后皮膚潰瘍及傷ロ基本愈合，術后6周方可著地行走，有跛行。
[0089]3)術后3個月，針刺患肢足底，兩組復合骨髄干細胞組均有痛感，尤以符合神經分化誘導組為甚，支架組痛覺不明顯；經神經誘導干細胞組縫合神經處與周圍組織無明顯粘連，與正常神經連接處光滑無斷裂，表面可見微小血管網形成，似正常神經，直徑較正常的神經干稍細，其余兩組較神經分化誘導組稍細，神經分化誘導組術區未見粘連，手術側腓腸肌萎縮不明顯。單純神經支架組和未誘導干細胞組術區仍有少量粘連，手術側腓腸肌少許萎縮。
[0090]結果表明本發明具有良好的神經修復作用，可應用于:制備神經移植物、制備周圍神經缺損修復的藥物，將具有良好的神經修復作用:經神經誘導干細胞組縫合神經處與周圍組織無明顯粘連，與正常神經連接處光滑無斷裂，表面可見微小血管網形成，似正常神經。
[0091]而且本發明制備的神經誘導的骨髄間充質干細胞，能夠作為雪旺細胞的替代品，彌補了雪旺細胞的取材來源、增殖純化、抗原特性等缺陷，構建的脫細胞組織工程神經更加符合神經組織的生理構成，移植物的修復效果較單純脫細胞神經基質更加明顯。
【權利要求】
1.一種復合神經誘導的骨髄間充質干細胞的組織工程神經的制備方法，其特征在干，包括以下操作: 1)取離體的異種動物的外周神經組織，剔除其中的神經外血管、脂肪及結締組織之后，用胰蛋白酶處理；胰蛋白酶處理完成后終止消化，使用低滲處理液對神經組織進行低滲處理； 2)將低滲處理后的神經組織在SB-10溶液中震蕩浸泡12h以上，清洗后轉入含有Triton X200和SB-16的混合液中震蕩浸泡12h以上，清洗后得到脫細胞神經基質； 3)用含體積分數10-20%的胎牛血清和1-5μ mol / L β -巰基こ醇的DMEM-F12培養基預誘導傳代后的骨髄間充質干細胞12-24h，無菌沖洗，然后培養基更換為含質量分數1-2% ニ甲基亞砜和體積分數10-20%的胎牛血清的DMEM-F12培養基，誘導培養12-24h ； 4)將脫細胞神經基質用DMEM-F12培養基充分浸潤，吸干培養基后37°C孵育，然后接種誘導培養后的神經誘導骨髄間充質干細胞，添加DMEM-F12培養，并補充胎牛血清至體積分數為10-20%，于37°C、5%C02、95%濕度的條件下培養48小時，得到復合神經誘導的骨髓間充質干細胞的組織 工程神經。
2.如權利要求1所述的復合神經誘導的骨髄間充質干細胞的組織工程神經的制備方法，其特征在于，所述的外周神經組織是在顯微鏡下仔細剔除神經外血管、脂肪及結締組織；然后加入質量分數0.25%的胰蛋白酶，37°C下、以80-100次/分鐘的頻率震蕩水浴20-30分鐘； 傾去胰蛋白酶，PBS清洗終止胰蛋白酶消化，然后去離子水，25°C下、以80-100次/分鐘的頻率震蕩水浴3-4小時；再將低滲處理后的神經組織轉入滅菌的PBS溶液中潤洗。
3.如權利要求1所述的復合神經誘導的骨髄間充質干細胞的組織工程神經的制備方法，其特征在于，所述的低滲處理后的神經組織是在SB-10溶液、含有Triton X200和SB-16的混合液交替多次循環處理之后，獲得脫細胞神經基質。
4.如權利要求1所述的復合神經誘導的骨髄間充質干細胞的組織工程神經的制備方法，其特征在于，所述的低滲處理后的神經組織是在濃度為100-150mmol/L SB-10溶液中，在25°C下、以80-100次/分鐘的頻率震蕩水浴12-15小吋，然后轉入滅菌PBS溶液中清洗； 清洗后次轉入含有質量濃度0.14-0.20%的Triton X200和0.6-0.8mmol/L的SB-16的混合液中，在25°C下、以80-100次/分鐘的頻率震蕩水浴12-24小吋，然后轉入滅菌PBS溶液中清洗； 清洗后第二次轉入濃度為100-150mmol/L SB-10溶液中，在25°C下、以80-100次/分鐘的頻率震蕩水浴5-10小吋，然后轉入滅菌PBS溶液中清洗； 清洗后第二次轉入含有質量濃度0.14-0.20%的Triton X200和0.6-0.8mmol/L的SB-16的混合液中，在25°C下、以80-100次/分鐘的頻率震蕩水浴10-15小時，然后轉入滅菌PBS溶液中清洗，獲得脫細胞神經基質，4°C保存。
5.如權利要求1所述的復合神經誘導的骨髄間充質干細胞的組織工程神經的制備方法，其特征在于，所述的骨髄間充質干細胞的制備及傳代培養為: 取骨髓組織，使用含青霉素、鏈霉素各100U/ml的DMEM-F12培養基，沖洗吹打制成單細胞懸液，將細胞懸液和Percoll分離液混合后離心，收集離心液界面上乳白色云霧狀的細胞層，先后以PBS和DMEM-F12漂洗，用含體積分數10%胎牛血清的DMEM-F12培養基重懸細胞，計數5X 105個/ml后即接種于培養瓶中，置于37°C、5%C02、95%濕度的培養箱中進行原代培養，分別于1、3天半量換液，以后每3天全量換液1次； 待細胞長滿瓶底80%時進行傳代培養，以1 X 104個/ml傳代。
6.如權利要求1所述的復合神經誘導的骨髄間充質干細胞的組織工程神經的制備方法，其特征在于，所述的步驟3)對骨髓間充質干細胞的誘導培養為: 用含體積分數20%的胎牛血清和3 μ mol / L β -巰基こ醇的DMEM-F12培養基預誘導傳代后的骨髄間充質干細胞24h，以無菌PBS沖洗，然后培養基更換為含質量分數2%ニ甲基亞砜和體積分數20%的胎牛血清的DMEM-F12培養基，誘導培養24h。
7.如權利要求1所述的復合神經誘導的骨髄間充質干細胞的組織工程神經的制備方法，其特征在于，所 述的步驟4)對骨髓間充質干細胞的培養為: 將脫細胞神經基質用DMEM-F12培養基浸潤12小時，然后將培養基吸干，37°C下孵育5小時；再將生長良好的神經誘導骨髄間充質干細胞，使用胰蛋白酶消化成細胞懸液，離心后用DMEM-F12培養液重懸，以104/cm2的密度接種在孵育后脫細胞神經基質上，以DMEM-F12為培養基，并補充胎牛血清的體積濃度至20%，置于37°C、5%C02、95%濕度的培養箱中培養48小吋，并在倒置顯微鏡下連續觀察細胞生長及污染情況。
8.權利要求1所制備的復合神經誘導的骨髄間充質干細胞的組織工程神經在制備神經移植物中的應用。
9.權利要求1所制備的復合神經誘導的骨髄間充質干細胞的組織工程神經在制備周圍神經缺損修復的藥物中的應用。
10.權利要求1所制備的神經誘導的骨髄間充質干細胞在制備雪旺細胞替代品中的應用。
【文檔編號】A61L27/38GK103446628SQ201310364793
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月20日 優先權日:2013年8月20日
【發明者】樊立宏, 王坤正, 黨曉謙, 余澤鋒 申請人:西安交通大學