專利名稱：抑制STAT3 和AFP 基因表達的雙靶標siRNA 真核表達質粒及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及抑制STAT3和AFP基因表達的雙靶標siRNA真核表達質粒及其用途， 屬于生物醫藥技術領域。
背景技術：
甲胎蛋白(alpha_fetoprotein,AFP)是胚胎期由肝臟、卵黃囊產生的一種糖蛋白， 出生后急劇降低。當發生肝臟腫瘤、某些胃腸道腫瘤和某些生殖系統腫瘤時，血清AFP水平又復升高。目前AFP作為一種公認的腫瘤標志物在腫瘤的診斷中具有重要作用。大約有 80%的肝癌患者血清AFP升高，是診斷原發性肝癌的常用檢查項目之一。有約50%的生殖細胞腫瘤出現AFP陽性，在其它腸胃管腫瘤如胰腺癌或肺癌及肝硬化等患者亦可出現不同程度的升高。其中AFP陽性胃癌發病率占胃癌的5. 1%_15%，這種腫瘤惡性程度高，具有細胞形態學像肝癌，易發生肝轉移和早期淋巴道轉移，侵襲性強，預后差的特點。
近年來研究發現AFP在腫瘤的發生發展中具有重要作用(I)免疫調節活性AFP 能抑制NK細胞活性及T淋巴細胞依賴的抗原反應，誘導抑制性T細胞的產生，下調單核細胞表面的MHC-1I類分子，及抑制腫瘤壞死因子對腫瘤細胞的細胞毒性作用；AFP還能降低肝癌細胞死亡受體的表達，使之逃避淋巴細胞的攻擊。(2)促進腫瘤細胞增殖實驗證明， AFP對人肝癌HepG2細胞、H22細胞和Ehrlich腹水癌細胞及宮頸癌HeLa細胞有直接促增殖作用，用AFP (20mg/L)刺激人肝癌細胞Bel 7402發現c_fos，c-jun和N_ras的mRNA量升高，說明AFP能刺激一些與細胞增殖和分化有關的癌基因表達，從而促進腫瘤細胞增殖。 提示AFP可能是重要的內源性促腫瘤細胞增殖的自分泌性蛋白質。(3)參與腫瘤細胞凋亡過程有研究報道AFP通過與AFP受體結合從而阻止腫瘤細胞凋亡。另有研究認為AFP在腫瘤細胞中能通過活化caspase3誘導凋亡。
AFP作為一種胚胎時期或病理狀態合成的蛋白質，它伴隨著胚胎發育和細胞分裂旺盛過程，在腫瘤發生發展過程中不僅是一種伴隨現象，而且是促進腫瘤細胞生長的內源性物質。這一作用可以被AFP單克隆抗體阻斷。抑制AFP基因表達的藥物和方法將會影響腫瘤細胞的增殖，從而達到抗腫瘤治療的目的。因此，阻斷AFP基因的表達及其生物學活性同時結合其他的治療手段有可能是一個治療與AFP相關腫瘤的一個新的策略。
本發明人在AFP陽性胃癌中的研究證實，利用RNAi技術抑制AFP表達對AFP 陽性胃癌細胞FU97具有增殖抑制及凋亡誘導作用，同時可能通過下調VEGF表達抑制腫瘤血管生成在肝癌中，研究報道AFP的小干擾RNA (small interference RNA, siRNA) 可誘導人肝癌細胞系Huh7的生長阻滯(參見Yang X, Zhang Y, Zhang L, Zhang L, Mao J. Silencingalpha-fetoprotein expression induces growth arrest and apoptosis in humanhepatocellular cancer cell. Cancer Lett.2008 Nov 28;271 (2):281-93. Epub 2008 Jul26.)。本發明課題組的研究也發現AFP-siRNA可抑制肝癌細胞SMMC-7721 的增殖(參見 WangYS，Ma XL, Qi TGj Liu XDj Meng YSj Guan GJ. Do wnregulation ofalpha-fetoprotein siRNAinhibits proliferation of SMMC-7721 cells. World J Gastroenterol. 2005 0ctl4;11 (38):6053-5.)。
信號轉導和轉錄激活因子3 (signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)是一種存在于細胞楽；與酪氨酸磷酸化信號通道偶聯的雙功能蛋白。STAT3在多種腫瘤細胞中被激活，并持續處于高活性狀態。它具有抑制細胞凋亡，促進細胞增殖的作用，參與了人類惡性腫瘤的發生、發展和演進，已被公認為一種腫瘤相關基因。大量研究發現，利用反義核酸、STAT3的顯性負性異構體以及RNAi技術阻斷STAT3的活性及表達可使腫瘤細胞生長受到抑制。
RNA干擾((RNA interference, RNAi)是近年來發現和發展起來的在轉錄水平上的基因阻斷技術，是一種雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)分子在mRNA水平上關閉相應序列基因的表達或使其沉默的過程。RNAi技術具有高效性、特異性、操作相對簡便、效果穩定、一次可研究多個基因等多方面的優勢。目前，在某些病毒性疾病的治療研究中已取得了一定的進展，在基因功能研究和基因治療方面也已顯示出巨大的應用前景。
雙靶標RNAi是將2個shRNA裝入同一質粒的不同RNA聚合酶III啟動子 (H1+U6)-終止信號結構單元。每個shRNA獨立有效轉錄。不同的啟動子避免使用單一啟動子因序列相同可能引發的重組，2個shRNA分別作用于不同目標基因，增強對靶細胞的作用效果。
目前尚無關于利用RNAi技術將干擾STAT3和AFP基因的高效siRNA串聯在一個 shRNA表達質粒上、達到同時高效抑制二種在腫瘤中異常高表達的基因的雙靶標siRNA真核表達質粒及其應用的報道。發明內容
針對現有技術的不足，本發明提供一種抑制STAT3和AFP基因表達的雙靶標siRNA 真核表達質粒及其用途。
發明概述本發明以利用RNA干涉技術為主，針對STAT3和AFP基因的有效靶序列，構建了能在哺乳動物細胞中同時表達STAT3和AFPsiRNA的表達質粒 pGenesill. 5-STAT3-AFP，以下簡稱pGl. 5-SA。其示意圖譜見

圖1，能高效、特異性地抑制 AFP和STAT3基因表達，可用于制備治療高表達STAT3基因的AFP陽性腫瘤的基因藥物。
術語說明
STAT3 :英文 signal transducer and activator of transcription 3 的簡寫，信號轉導與轉錄激活因子3。
AFP,英文 alpha-fetoprotein 的簡寫，甲胎蛋白。
siRNA:英文 small interference RNA 的簡寫，小干擾 RNA
shRNA:英文 short hairpin RNA 的縮寫，短發夾 RNA。
shRNA包括兩個短的`反向重復序列(一個是正向序列，另一個是反向互補序列，兩者可以結合成為雙鏈，其中的正向序列為干涉靶序列)，中間由一莖環(loop)序列分隔，組成發夾結構。所謂反向重復序列是指在同一多核苷酸鏈內下游存在著與上游某一段序列的互補序列反向的序列。
RT-PCR:英文reverse transcription Polymerase Chain Reaction 的縮寫，反轉錄聚合酶鏈式反應。
western blotting :western 蛋白印跡法。
mRNA:英文messenger RNA的縮寫,信使核糖核酸。
cDNA:英文complementary DNA的縮寫,互補脫氧核糖核酸。
DEPC :英文diethypyrocarbonate的縮寫,焦碳酸二乙酯,是一種RNA酶抑制劑。
MTT :英文 3_ (4，5) -dimethylthiahiazo (-z-yl) -3, 5-d1-phenytetrazoliumromi de的縮寫，四甲基偶氮唑鹽，常用做比色法測定細胞活力的試劑。
本發明的技術方案如下
抑制STAT3和AFP基因表達的雙靶標siRNAs真核表達質粒，其特征是，以 pGenesill. 5為載體，利用雙靶標siRNA技術，在一個shRNA表達質粒上引入針對STAT3和 AFP基因有效的shRNA序列，每個序列有各自的啟動子及終止信號且各自獨立表達，在高表達的STAT3基因的AFP陽性腫瘤中發揮干擾作用，是用于表達STAT3基因的AFP陽性腫瘤的治療性物質；
所述的shRNA序列的兩個反向重復序列分別是STAT3或AFP基因的干涉靶序列及其反向互補序列；
所述的STAT3、AFP基因的干涉靶序列分別為①5’ -GCAACAGATTGCCTGCATTGG-3’， 起始于 956 位 ,② 5’ -CAGGGAGACATTCATGAAC-3’，起始于 508 位；
所述的STAT3、AFP基因的干涉靶序列的反向互補序列分別為
5’-CCAATGCAGGCAATCTGTTGC-3’ ，5’-GTTCATGAATGTCTCCCTG-3’ ；
STAT3、AFP 基因 shRNA 表達框的 loop 序列分別為5’ -GGCCGGCGCGC-3’， 5，-CGCGCGCGGGCC-3，；
由以下方法制得
(I) STAT3和AFP基因雙啟動子shRNA表達框的構建
a.第一輪PCR 以包含Hl和U6啟動子的質粒XM-2P為模板，設計PCR引物，在3’ 引入PCR模板質粒XM-2P的部分序列，用于擴增Hl和U6啟動子序列，并在上下游引物中分別引入所述的STAT3和AFP基因的干涉靶序列的反向互補序列及loop序列；
上游引物P1-FW:5 ’ -GGCCGGCGCGC CCAATGCAGGCAATCTGTTGC GGGAAAGAGTGATC-3'
下游引物P卜RV : 5 ’ -CGCGCGCGGGCC GTTCATGAATGTCTCCCTG GGTGTTTCGTCCTTTC-3’ ；
b.第二輪PCR :以第一輪PCR為模板，設計PCR引物，在上下游引物中分別引入所述的STAT3和AFP基因的干涉靶序列、RNA聚合酶III終止序列“AAAAA”及限制性內切酶 HindIII (AAGCTT)、BamHI (GGATCC)，為了便于酶切，在兩個內切酶5’端添加了保護性堿基分別為“AGT”和“AT”
上游引物P2-FW: 5，-AGTAAGCTTAAAAAGCAACAGATTGCCTGCATTGG GGCCGGCGCGC CC-3，，
下游引物P2-RV:5，-ATGGATCCAAAAACAGGGAGACATTCATGAAC CGCGCGCGGGCC GT-3’ ；
c.經過以上兩輪PCR，得到STAT3和AFP基因雙啟動子shRNA表達框，產物結構為HindII1- -shRNAl-Hl 啟動子-U6 啟動子-shRNA2_BamHI。
(2)將步驟(I)所構建的STAT3和AFP基因shRNA表達框和siRNA表達載體 pGenesill. 5同時用Hindlll、BamHI雙酶切，分別產生插入片段和載體片段，然后進行連接，最后轉化到DH5 α大腸桿菌，經卡那霉素篩選，挑選單個菌落大量培養，用質粒提取試劑盒提取純化質粒DNA ;得到抑制STAT3和AFP基因表達的雙靶標siRNAs真核表達質粒 pGenesill. 5-STAT3-AFP ；
(3)質粒的鑒定將步驟(2)提取的質粒DNA瓊脂糖凝膠電泳，應用限制性內切酶 HindIIKBamHI做酶切鑒定，紫外分光光度計分析測定質粒DNA的濃度和純度，并進行插入片斷測序，以確定STAT3和AFP基因shRNA表達框是否正確插入pGenesill. 5質粒中。
本發明的抑制STAT3和AFP基因表達的雙靶標siRNA真核表達質粒在制備治療表達STAT3的AFP陽性腫瘤的基因藥物中的應用。
為了對STAT3、AFP雙siRNA表達質粒對STAT3和AFP基因的抑制效果及對AFP陽性腫瘤細胞的作用進行鑒定，脂質體轉染細胞，提取總核糖核酸(Ribonucleic Acid, RNA), 反轉錄-聚合酶鏈式反應(reverse transcription Polymerase Chain Reaction, RT— PCR)法測定對STAT3和AFP信使核糖核酸(messenger RNA, mRNA)表達水平的抑制作用， 蛋白印跡法(western blotting)測定對STAT3和AFP蛋白表達水平的影響。四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)、細胞免疫化學法檢測Ki67分析轉染STAT3、AFP雙siRNA表達質粒后對 AFP陽性腫瘤細胞生長增殖的影響。
本發明的針對STAT3和AFP基因構建的雙siRNA表達質粒是可用于高表達STAT3 的AFP陽性腫瘤治療物質，其在體外培養的AFP陽性腫瘤細胞內可有效抑制STAT3和AFP 基因的表達，對腫瘤細胞的增殖有顯著的抑制作用，可進一步在實驗動物體內進行基因治療研究。
本發明的抑制STAT3和AFP基因表達的雙靶標siRNA真核表達質粒的制備方法和生物學活性鑒定主要包括如下內容
一、質粒的制備，包括雙RNA聚合酶III啟動子(H1+U6)的引入，雙基因shRNA表達框的設計與構建，將上述構建的雙shRNA表達框定向克隆入載體pGenesill. 5，轉化宿主菌、擴增及質粒DNA的提取，質粒的鑒定。
二、質粒生物學活性的鑒定，包括質粒的轉染、脂質體轉染效率的計算、RT - PCR 檢測STAT3和AFP基因的表達、western blotting測定STAT3和AFP蛋白表達水平的影響。 MTT、細胞免疫化學法檢測Ki67分析轉染STAT3、AFP雙siRNA表達質粒后對AFP陽性腫瘤細胞生長增殖的影響。
下面詳細說明本發明制備方法中各步驟的具體操作方法
1、RNA干涉靶序列的選擇及雙RNA聚合酶III (H1+U6)啟動子的引入選用經篩選、驗證有效的STAT3及AFP基因的RNAi靶序列，分別為
①5’-GCAACAGATTGCCTGCATTGG-3’
② 5’-CAGGGAGACATTCATGAAC-3’
設計PCR引物，以包含Hl和U6啟動子的質粒XM-2P為模板，擴增Hl和U6啟動子序列，并在上下游引物中分別引入STAT3和AFP基因的干涉靶序列的反向互補序列及loop 序列上游引物P1-FW:5’ -GGCCGGCGCGCCCAATGCAGGCAATCTGTTGCGGGAAAGAGTGATC-3’ 下游引物P1-RV:5’ -CGCGCGCGGGCCGTTCATGAATGTCTCCCTGGGTGTTTCGTCCTTTC-3’ PCR 反應體系試劑體!Η(μ丨)
權利要求
1.抑制STAT3和AFP基因表達的雙靶標siRNAs真核表達質粒，其特征是，以pGenesill. 5為載體，利用雙靶標siRNA技術，在ー個shRNA表達質粒上引入針對STAT3和AFP基因有效的shRNA序列，每個序列有各自的啟動子及終止信號且各自獨立表達，在高表達的STAT3基因的AFP陽性腫瘤中發揮干擾作用，是用于表達STAT3基因的AFP陽性腫瘤的治療性物質； 所述的shRNA序列的兩個反向重復序列分別是STAT3或AFP基因的干涉靶序列及其反向互補序列； 所述的STAT3、AFP基因的干涉靶序列分別為①5’ -GCAACAGATTGCCTGCATTGG-3’，起始于 956 位5’ -CAGGGAGACATTCATGAAC-3'，起始于 508 位； 所述的STAT3、AFP基因的干涉靶序列的反向互補序列分別為5’-CCAATGCAGGCAATCTGTTGC-3’ ，5’-GTTCATGAATGTCTCCCTG-3’ ； STAT3、AFP 基因 shRNA 表達框的 loop 序列分別為5’ -GGCCGGCGCGC-3’，5，-CGCGCGCGGGCC-3，； 由以下方法制得 (1)STAT3和AFP基因雙啟動子shRNA表達框的構建 a.第一輪PCR以包含Hl和U6啟動子的質粒XM-2P為模板，設計PCR引物，在3’引入PCR模板質粒XM-2P的部分序列，用于擴增Hl和U6啟動子序列，并在上下游引物中分別引入所述的STAT3和AFP基因的干涉靶序列的反向互補序列及loop序列；上游引物P1-FW:5’ -GGCCGGCGCGC CCAATGCAGGCAATCTGTTGC GGGAAAGAGTGATC-3’，下游引物P1_RV:5，-CGCGCGCGGGCC GTTCATGAATGTCTCCCTG GGTGITTCGTCCTTTC-3，； b.第二輪PCR以第一輪PCR為模板，設計PCR引物，在上下游引物中分別引入所述的STAT3和AFP基因的干涉靶序列、RNA聚合酶111終止序列“ AAAAA ”及限制性內切酶HindII I(AAGCTT)、BamHI (GGATCC)，為了便于酶切，在兩個內切酶5’端添加了保護性堿基分別為“AGT”和“AT”上游引物P2-FW:5’-AGTAAGCTTAAAAA GCAACAGATTGCCTGCATTGG GGCCGGCGCGC CC-3’，下游引物P2-RV:5’ -ATGGATCCAAAAA CAGGGAGACATTCATGAAC CGCGCGCGGGCC GT-3’ ； c.經過以上兩輪PCR，得到STAT3和AFP基因雙啟動子shRNA表達框，產物結構為HindII1-ShRNAl-Hl 啟動子-U6 啟動子-shRNA2_BamHI。
(2)將步驟(I)所構建的STAT3和AFP基因shRNA表達框和siRNA表達載體pGenesill. 5同時用Hindlll、BamHI雙酶切，分別產生插入片段和載體片段，然后進行連接，最后轉化到DH5 a大腸桿菌，經卡那霉素篩選，挑選單個菌落大量培養，用質粒提取試劑盒提取純化質粒DNA ;得到抑制STAT3和AFP基因表達的雙靶標siRNAs真核表達質粒pGenesill. 5-STAT3-AFP ； (3)質粒的鑒定將步驟(2)提取的質粒DNA瓊脂糖凝膠電泳，應用限制性內切酶HindIIKBamHI做酶切鑒定，紫外分光光度計分析測定質粒DNA的濃度和純度，并進行插入片斷測序，以確定STAT3和AFP基因shRNA表達框是否正確插入pGenesill. 5質粒中。
2.權利要求1的抑制STAT3和AFP基因表達的雙靶標siRNA真核表達質粒在制備治療表達STAT3的AFP陽性腫瘤的基因藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及抑制STAT3和AFP基因表達的雙靶標siRNA真核表達質粒及其用途。本發明以利用RNA干涉技術為主，針對腫瘤中異常高表達的AFP和STAT3基因的靶序列，構建了能在真核細胞中同時表達STAT3和AFP siRNA的質粒pGenesil1.5-STAT3-AFP。本發明能高效、特異性地抑制腫瘤細胞的STAT3和AFP基因表達，可用于制備治療表達STAT3的AFP陽性腫瘤的基因藥物。
文檔編號A61K48/00GK103031334SQ20121048890
公開日2013年4月10日 申請日期2012年11月27日 優先權日2012年11月27日
發明者馬效恩, 鄭燕, 汪運山, 石曉紅, 王婧男, 胡瑞, 孔毅 申請人:汪運山