專利名稱：一種細菌纖維素/聚乙烯醇復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料，制備了一種細菌纖維素/聚乙烯醇復(fù)合水凝膠材料，具有高含水量、高強度、高生物相容性、低摩擦系數(shù)、粘彈性、及可固定等特征，可用于軟骨、半月板等承重組織的替換物。
背景技術(shù)：
細菌纖維素(bacterial cellulose，BC)是一種用途非常廣泛的生物材料，其典型生產(chǎn)菌種是Acetobacter xyIinum木醋桿菌,其細胞的側(cè)壁孔分泌直徑I. 78nm微纖絲,組成3 4nm直徑的微纖絲束，再構(gòu)成纖維絲帶寬3(Tl00nm，厚:TSnm，進而交織成多級纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。細菌纖維素作為醫(yī)用材料在20世紀(jì)80年代就開始引起關(guān)注，經(jīng)過多年來各個領(lǐng) 域科研工作者的研究證實細菌纖維素純度高，含水量高，結(jié)晶度高，具有獨特的粘彈性力學(xué)行為，力學(xué)性能優(yōu)良(尤其是拉伸強度顯著，柔韌度高)、生物相容性優(yōu)異，其獨特的納米多級纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在某種程度上模擬了細胞外基質(zhì)中的膠原網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，不僅在力學(xué)性能上有重要作用，且對細胞有引導(dǎo)作用，免疫原性低于膠原，用于組織工程支架有獨特的優(yōu)勢，被廣泛地用于各類型臨床醫(yī)用材料的研究開發(fā)，主要研究熱點有傷口敷料、組織工程支架、組織替代物以及藥物緩釋載體等。將天然細菌纖維素用于半月板、關(guān)節(jié)軟骨等承重組織替換物時，盡管其力學(xué)行為與天然的半月板、關(guān)節(jié)軟骨等一致，但其力學(xué)強度還不能達到天然組織的水平，不能直接用于臨床修復(fù)，需進一步改性提高其力學(xué)強度以滿足對材料強度具有高要求的組織修復(fù)材料的需要。A. Bodin等發(fā)現(xiàn)未經(jīng)修飾的細菌纖維素在載荷為2kMPa時，與豬半月板的楊氏模量在同一個水平，但是在高載荷下，細菌纖維素半月板的楊氏模量無法與天然半月板匹配。細菌纖維素膜的力學(xué)性能優(yōu)異，干膜BC的彈性模量可達5000MPa ；A. Bodin等測得形變20%時的濕態(tài)BC壓縮模量是3. 5KPa ；A. Svensson等測得濕態(tài)下0. 3mm厚的BC的壓縮模量大約lOKPa，3mm厚的BC的壓縮模量大約70KPa左右，0. 3mm厚的BC拉伸的楊氏模量為IOMPa左右。因此，細菌纖維素的力學(xué)強度干態(tài)遠大于濕態(tài)，且試樣的厚度也對力學(xué)結(jié)果有影響，另外其拉伸模量遠高于壓縮模量。聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)是一種很有應(yīng)用前景的生物醫(yī)用高分子材料，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，通過物理交聯(lián)可獲得的凝膠，有良好的生物相容性，同自然關(guān)節(jié)軟骨類似的力學(xué)行為，是一種優(yōu)良的關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)材料，但其力學(xué)強度和摩擦性能需進一步提高。聚乙烯醇由于聚合度、醇解度、醇解方式等不同，在溶解時間、溫度上有一定的差異，因此其溶解方法和時間需要進行摸索。一般采用95°C左右水浴間接加熱并同時攪拌來溶解，聚乙烯醇的水溶液濃度一般在12 14%以下；低醇解度聚乙烯醇樹脂產(chǎn)品水溶液濃度一般可在20%左右。聚乙烯基卩比咯燒酮(Polyvinylpyrrolidone, PVP)具有優(yōu)良的溶解性、生物相容性、低毒性、成膜性，廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域中，諸如口服藥物的緩釋載體，口服或注射藥物的穩(wěn)定劑，注射藥物的增溶劑和分散劑，以及外傷包扎帶，人工玻璃體等。此外，由于PVP是一種高親水的高分子材料，在醫(yī)學(xué)中也常被用作潤滑性涂層，與PVA復(fù)合可改善材料表面潤滑性能。BC作為半月板替代物的原材料，其力學(xué)行為與天然半月板一致，都屬于粘彈性材料，缺陷是力學(xué)強度不足。但BC具有納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可仿生細胞基質(zhì)中的膠原等纖維性成分；同樣親水、生物安全性高、且交聯(lián)方法簡單安全的高分子聚合物PVA與PVP，可仿生細胞基質(zhì)中的糖氨聚糖等空間填充物質(zhì)。
將BC與高分子材料復(fù)合提高其力學(xué)強度，目前已有的BC/PVA復(fù)合材料，有三種制備方法一是在培養(yǎng)基中添加低濃度PVA，進行原位合成，制得的BC/PVA復(fù)合材料在脫水后測拉伸強度低于純BC，力學(xué)強度降低；二是Leonardo E. Millon等將BC懸浮液，與PVA溶液混勻后凍融交聯(lián)，復(fù)合材料的彈性模量可達到7. 5MPa ;三是將BC濕膜直接浸入不同濃度的PVA溶液，滲透平衡后凍融交聯(lián)，如萬怡灶等制備了 0. 3mm厚度的BC/PVA復(fù)合膜，其BC含量12-27%，采用拉伸法測得的楊氏模量可達63Mpa，用于角膜。另有萬同等用采用此法制備BC含量f 2%，PVA含量f 15%的復(fù)合材料，拉伸模量約為8MPa左右。根據(jù)現(xiàn)有資料，天然半月板的拉伸模量在IOMPa以上，而關(guān)節(jié)軟骨的拉伸模量5-50MPa。現(xiàn)有BC/PVA復(fù)合材料還不能滿足臨床實際應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種BC/PVA復(fù)合材料的制備方法，即將BC濕膜直接浸泡于高濃度PVA溶液中，滲透平衡后進行凍融交聯(lián)。本發(fā)明的另一目的是提供上述制備所得的BC/PVA復(fù)合材料，其在濕態(tài)下的壓縮模量大幅提高，可達60MPa左右。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明制備了 BC/PVA/PVP復(fù)合材料，進一步提高材料的力學(xué)強度，并降低材料的摩擦系數(shù)，同時結(jié)合MRI或者CT，及三維重建，光敏樹脂固化成型技術(shù)，實現(xiàn)了個體化組織置換物的制備。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種細菌纖維素/聚乙烯醇復(fù)合材料的制備方法，包括如下步驟(I)醫(yī)用細菌纖維素濕膜塊的制備接種木醋桿菌(Acetobacter xyIinum)到種子培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng),再接種到發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，得到醫(yī)用細菌纖維素膜，然后經(jīng)純化處理后，再采用脫水的方式制備細菌纖維素含量0. 05 2%質(zhì)量分數(shù)的細菌纖維素濕膜塊；(2)高分子溶液的配制在高溫95 130°C，高壓0. 05 0. 15MPa的條件下，配制質(zhì)量濃度20 40%的聚乙烯醇水溶液，靜置過夜去除氣泡，制得的溶液為高分子溶液I ;或者在上述配制聚乙烯醇水溶液的過程中加入聚乙烯基吡咯烷酮，其中聚乙烯基吡咯烷酮的質(zhì)量濃度0. 5 15%，制得的溶液為高分子溶液II ；或者在高分子溶液I中還加入模擬體液，制得的溶液為高分子溶液III ;(3)細菌纖維素濕膜塊浸潰高分子溶液將細菌纖維素濕膜塊裁成所需尺寸，浸泡于所配制的高分子溶液I或II中f 10天，保溫8(T105°C ;取出充分滲透平衡的復(fù)合膜塊I或II，清除表面多余的溶液待用；
或者將上述復(fù)合膜塊I或II部分浸泡于高分子溶液III中，控制浸泡高度不超過2mm，浸泡4 72h，取出充分滲透平衡的復(fù)合膜塊IIIi或III n，清除表面多余的溶液待用；(4)凍融交聯(lián)將步驟(3)制得的復(fù)合膜塊I、11、111;或111^于-30 -201 /15 25°C反復(fù)凍融，rio次，物理交聯(lián)形成復(fù)合材料I、Ii、iiii或in ii0
優(yōu)選地，步驟(I)所述振蕩培養(yǎng)的條件為180rpm、培養(yǎng)16 18h ;發(fā)酵培養(yǎng)的條件為接種量10% (質(zhì)量份數(shù))，靜置培養(yǎng):T20d。優(yōu)選地，步驟(I)所述醫(yī)用細菌纖維素膜的純化處理將步驟(I)制得的細菌纖維素膜，用自來水沖洗去除培養(yǎng)基，然后用去離子水浸泡至水無色透明，然后用0. 19T3%質(zhì)量分數(shù)的十二烷基磺酸鈉溶液浸泡2 4次，每12 24h更換十二烷基磺酸鈉溶液一次；0. 05M^1M氫氧化鈉溶液浸泡2 4次，每12 24h更換一次氫氧化鈉溶液，超聲波60min，超純水浸泡2飛次，每12 24h更換超純水一次。優(yōu)選地，所述聚乙烯基卩比咯燒酮分子量8000 200000,聚乙烯醇分子量85000 186000。優(yōu)選地，步驟(4)得到的復(fù)合材料I或II部分浸泡于模擬體液中，控制浸泡高度不超過2mm，浸泡4 72h。優(yōu)選地，所述高分子溶液I中聚乙烯醇的質(zhì)量濃度為28 40%。上述方法制備的復(fù)合材料，其壓縮模量為30MPa以上。優(yōu)選地，該材料的壓縮模量為 50 60MPa。上述復(fù)合材料用于制備半月板或軟骨組織的替換物，或制備半月板或軟骨組織的修復(fù)制品。優(yōu)選地，所述半月板替換物或修復(fù)制品的制備電子計算機X射線斷層掃描技術(shù)或者核磁共振成像掃描半月板得到其斷層掃描圖片，使用Mimicsl4. 0軟件進行三維重建，并在MagicslO. 11軟件中基于重建后的外輪廓設(shè)計模板，采用光敏樹脂光固化成型，制得半月板模具，將步驟(3)制得的復(fù)合膜塊I或II壓入上述模具，按照步驟(4)進行凍融交聯(lián)，以制備半月板替換物或修復(fù)制品。優(yōu)選地，所述軟骨替換或修復(fù)制品的制備電子計算機X射線斷層掃描技術(shù)或者核磁共振成像掃描軟骨得到其斷層掃描圖片，使用Mimicsl4. 0軟件進行三維重建，并在MagicslO. 11軟件中基于重建后的外輪廓設(shè)計模板，采用光敏樹脂光固化成型，制得軟骨模具，將步驟(3)制得的復(fù)合膜塊I、IIJIIi或IIIii壓入上述模具，按照步驟(4)進行凍融交聯(lián)，以制備成復(fù)合材料I或II，或軟骨替換物或修復(fù)制品IIIi或IIIii，所述復(fù)合材料I或II部分浸泡于模擬體液中，控制浸泡高度不超過2mm，浸泡4 72h，制備成軟骨替換物或修復(fù)制品I或II。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點I、優(yōu)化天然細菌纖維素的純化處理步驟，進一步去除雜質(zhì)提高細胞相容性，細胞毒性實驗結(jié)果見圖I。2、制備不同質(zhì)量含量的細菌纖維素濕膜塊，同時保證最大程度上其晶體結(jié)構(gòu)不破壞，結(jié)晶度不降低，XRD結(jié)果見圖2。3、制備高濃度PVA (醇解度99%以上)溶液，由于高濃度PVA溶液粘度極高，通常的95°C加熱攪拌法無法制備濃度在20%以上的PVA溶液，本發(fā)明通過高溫高壓法，制備高濃度PVA溶液，其濃度可達40%。4、通過反復(fù)凍融交聯(lián)制備高含量PVA的PVA/BC復(fù)合水凝膠(電鏡照片見圖3)，PVA與BC復(fù)合，可極大提高BC的力學(xué)強度，其中PVA含量越高，復(fù)合材料的力學(xué)強度越高，本發(fā)明制備的PVA/BC復(fù)合系列材料，當(dāng)PVA濃度達到20%時，壓縮模量達到30MPa以上，尤其是PVA濃度達到28%時，壓縮模量達到50MPa以上，(實驗結(jié)果見圖4)，可滿足軟骨、半月板等承重型組織的力學(xué)強度需要。5、PVA/BC復(fù)合材料降低了 BC的親水性，有利于細胞粘附，提高粘附性細胞的增殖能力(細胞實驗見圖5)。6、在PVA/BC復(fù)合材料中增加PVP復(fù)合，除了可進一步提高復(fù)合材料的力學(xué)強度夕卜，可降低復(fù)合材料的摩擦系數(shù)。
7、聯(lián)合MRI(Magnetic Resonance Imaging,MRI)或CT技術(shù)(electronic computerX-ray tomography technique, CT)、三維重建技術(shù),及光敏樹脂光固化成型技術(shù),制造個體化的半月板模具。8、采用個體化的半月板模具，制備個體化BC/PVA/PVP半月板替換物，結(jié)果見圖6，使其在臨床應(yīng)用中不僅在力學(xué)性能上接近天然組織，外形上也最大限度的與天然組織匹配。9、采用模擬體液對復(fù)合水凝膠進行可控部分礦化，形成層漸的BC/PVA/PVP/HA結(jié)構(gòu)，從而滿足修復(fù)復(fù)合材料與軟骨下骨層的牢固結(jié)合。


圖I為實施例I中BC改良純化法提高材料細胞相容性的效果圖。圖2為實施例I中低溫脫水法對BC結(jié)晶度影響的XRD圖。圖3為實施例I條件下，不同PVA濃度制得的PVA/BC復(fù)合材料的SEM照片(A BC ；B 5%PVA ；C 1%PVA/BC ；D 20%PVA/BC ；E 30%PVA/BC ；F :40%PVA/BC)。圖4為實施例I條件下，不同PVA濃度制得的PVA/BC復(fù)合材料的壓縮模量結(jié)果圖，PVA/BC復(fù)合材料的壓縮模量與PVA在復(fù)合材料中的含量基本正相關(guān)，隨著PVA的實際含量增加而增加。圖5為實施例I制得的PVA/BC復(fù)合材料的細胞相容性結(jié)果圖。圖6為實施例7制得的PVA/BC復(fù)合材料的個體化半月板替換物圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步具體詳細描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此，對于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進行。實施例I一種BC/PVA復(fù)合材料的制備方法，具體步驟如下I醫(yī)用細菌纖維素膜制備培養(yǎng)基成分酵母粉10g,蛋白胨6g, MgS04 :0. 2g, CaC12 :0. lg，葡萄糖:20g,椰汁1000ml,滅菌后加入IOml無水乙醇。
培養(yǎng)方法接種木醋桿菌到種子培養(yǎng)液，180rpm震蕩培養(yǎng)18h后，以10%的比例接種發(fā)酵培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)20d。2醫(yī)用天然細菌纖維素產(chǎn)品的純化處理發(fā)酵所得的細菌纖維素膜，用自來水沖洗去除培養(yǎng)基，然后用去離子水浸泡至水無色透明。然后用3%的SDS浸泡4次，每12h更換SDS液一次；0. IM氫氧化鈉溶液浸泡4次,每12更換一次氫氧化鈉溶液,超聲波60min,超純水浸泡6次,每12h更換超純水一次。如圖I所示，采用L929細胞株(小鼠成纖維細胞株)檢測經(jīng)過改良純化處理與常規(guī)純化處理的樣品BC的體外細胞相容性，并以多孔組織培養(yǎng)板 作為對照。由實驗結(jié)果，同樣實驗條件下，BC樣品經(jīng)過改良純化處理步驟后細胞增殖能力與細胞培養(yǎng)孔板接近，比常規(guī)純化處理的樣品BC有較大的提高，說明改良純化步驟可有效提高BC的細胞相容性。3細菌纖維素濕膜塊的制備采用低溫(37°C )脫水法(烘干24h)，制備細菌纖維素質(zhì)量分數(shù)為0. 1%的細菌纖維素濕膜塊。如圖2所示，低溫脫水法比凍干法結(jié)晶峰位置幾乎沒有改變，峰形更尖銳，衍射相對強度更高，說明此法制備的BC樣品晶體結(jié)構(gòu)不變，結(jié)晶度相對更高一些。4高分子溶液的配制采用高溫(126°C)高壓法(0. 15MPa)，配制PVA溶液，靜置過夜去除氣泡，所制得的PVA溶液濃度為40%，PVA分子量(146000 186000)。5細菌纖維素浸潰高分子溶液將細菌纖維素濕膜塊裁成IcmX lcmXO. 8cm，浸泡于所配制的PVA溶液5天，保溫800C。取出充分滲透平衡的BC/PVA膜塊，清除表面多余的溶液待用。6凍融交聯(lián)將步驟5制備的BC/PVA膜塊于_20°C /25°C反復(fù)凍融8次，物理交聯(lián)形成復(fù)合材料BC/PVA。如圖3所示，BC與PVA復(fù)合后，PVA在低含量時，附著于BC纖維(如圖3C) ;PVA含量高時，PVA填充于整個BC纖維網(wǎng)絡(luò)中(如圖3D，3E，3F)。 如圖4所示，PVA/BC復(fù)合材料的壓縮模量與PVA在復(fù)合材料中的含量基本正相關(guān)，隨著PVA的實際含量增加而增加。如圖5所示，通過采用L929細胞株(小鼠成纖維細胞株)在PVA/BC復(fù)合材料與BC樣品的細胞的細胞增殖能力，檢測PVA/BC復(fù)合材料的細胞相容性，以多孔組織培養(yǎng)板作為對照。PVA/BC復(fù)合材料的細胞增殖能力相對BC純樣品更高，有更好的細胞相容性。實施例2一種BC/PVA/PVP復(fù)合材料的制備方法，具體步驟如下I醫(yī)用細菌纖維素膜制備培養(yǎng)基成分酵母粉10g,蛋白胨6g, MgS04 :0. 2g, CaC12 :0. lg，葡萄糖:20g,椰汁1000ml,滅菌后加入IOml無水乙醇。培養(yǎng)方法接種木醋桿菌到種子培養(yǎng)液，180rpm震蕩培養(yǎng)18h后，以10%的比例接種發(fā)酵培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)20d。2醫(yī)用天然細菌纖維素產(chǎn)品的純化處理
發(fā)酵所得的細菌纖維素膜，用自來水沖洗去除培養(yǎng)基，然后用去離子水浸泡至水無色透明。然后用3%的SDS浸泡4次，每12h更換SDS液一次；0. IM氫氧化鈉溶液浸泡4次,每12更換一次氫氧化鈉溶液,超聲波60min,超純水浸泡6次,每12h更換超純水一次。3細菌纖維素濕膜塊的制備采用低溫(37°C)烘干法，烘干24h，制備細菌纖維素質(zhì)量分數(shù)為0. 1%的細菌纖維素濕膜塊。4高分子溶液的配制采用高溫(110 °C)法，高壓法(0.08MPa)，可配制PVA/PVP混合的水溶 液，靜置過夜去除氣泡。配制所得PVA/PVP混合的水溶液，其中PVA濃度30%，PVA分子量(85000^124000), PVP 濃度 5%，PVP 分子量(45000 50000)。5細菌纖維素浸潰高分子溶液將細菌纖維素濕膜塊裁成IcmX lcmXO. 8cm,浸泡于所配制的PVA/PVP混合溶液5天，保溫80°C。取出充分滲透平衡的BC/PVA/PVP膜塊，清除表面多余的溶液待用。6凍融交聯(lián)將步驟5制備的BC/PVA/PVP膜塊于_20°C /25°C反復(fù)凍融，8次，物理交聯(lián)形成復(fù)合材料 BC/PVA/PVP。實施例3聚乙烯醇/細菌纖維素/羥基磷灰石一體化軟骨修復(fù)制品的制備I醫(yī)用細菌纖維素膜制備培養(yǎng)基成分酵母粉10g,蛋白胨6g, MgS04 0. 2g, CaC12 :0. lg，葡萄糖:20g,椰汁1000ml,滅菌后加入IOml無水乙醇。培養(yǎng)方法接種木醋桿菌到種子培養(yǎng)液，180rpm震蕩培養(yǎng)16h后，以10%的比例接種發(fā)酵培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)IOcL2醫(yī)用天然細菌纖維素產(chǎn)品的純化處理發(fā)酵所得的細菌纖維素膜，用自來水沖洗去除培養(yǎng)基，然后用去離子水浸泡至水無色透明。然后用3%的SDS浸泡4次，每12h更換SDS液一次；0. IM氫氧化鈉溶液浸泡4次,每12h更換一次氫氧化鈉溶液,超聲波60min,超純水浸泡6次,每12h更換超純水一次。3細菌纖維素濕膜塊的制備采用低溫(37°C)烘干法，烘干24h，制備細菌纖維素質(zhì)量分數(shù)為0. 1%的細菌纖維素濕膜塊。4高分子溶液的配制采用高溫(110°C)高壓法(0.08MPa)，配制PVA的水溶液，靜置過夜去除氣泡。所制得的PVA溶液濃度為40%，PVA分子量(89000 98000)。5細菌纖維素浸潰高分子溶液將細菌纖維素濕膜裁成2cmX3cmX0. 8cm，浸泡于所配制的PVA溶液中，7天，保溫960C。取出充分滲透平衡的BC/PVA膜，清除表面多余的高分子溶液待用。6 壓模將步驟5得到的BC/PVA膜壓入個體化豬軟骨模具中成型。上述個體化豬軟骨模具的制備過程為Micix)CT掃描豬軟骨得到其斷層掃描圖片，使用Mimicsl4. O進行三維重建,并在MagicslO. 11中基于重建后的外輪廓設(shè)計模板。采用光敏樹脂光固化成型豬軟骨模具。7凍融交聯(lián)將步驟6得到的BC/PVA成型膜于 20°C /25°C反復(fù)凍融8次，物理交聯(lián)形成BC/PVA復(fù)合材料。8 礦化將步驟7得到的BC/PVA復(fù)合材料，置于模擬體液SBF中，控制模擬體液的高度不超過2mm，礦化I天，得到BC/PVA/HA豬的軟骨替換物。上述的模擬體液SBF 配方NaCl 8. 035g, NaHC030. 355g, KCl 0. 225g, K2HP04. 3H20 0. 231g, MgC12. 6H206. 311g,IM HCl 0. 39ml,無水 CaC120. 292g，無水Na2S040. 072g，三(羥甲基)氨基甲烷(tris) 6. 118g, IMHCl 5ml。本實施例所制備的聚乙烯醇/細菌纖維素復(fù)合水凝膠，力學(xué)強度最高可達到60MPa左右，基本上可以匹配人體關(guān)節(jié)軟骨所需。采用模擬體液對復(fù)合水凝膠進行部分礦化(控制礦化層厚度)，使其形成層漸的羥基磷灰石結(jié)構(gòu)，從而滿足復(fù)合修復(fù)材料與軟骨下骨層的牢固結(jié)合。實施例4聚乙烯醇/細菌纖維素/羥基磷灰石一體化軟骨修復(fù)制品的制備I醫(yī)用細菌纖維素膜制備培養(yǎng)基成分酵母粉10g，蛋白胨6g, MgS04 0. 2g，CaCl2 :0. lg，葡萄糖:20g，椰汁1000ml,滅菌后加入IOml無水乙醇。培養(yǎng)方法接種木醋桿菌到種子培養(yǎng)液，180rpm震蕩培養(yǎng)18h后，以10%的比例接種發(fā)酵培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)15d。2醫(yī)用天然細菌纖維素產(chǎn)品的純化處理發(fā)酵所得的細菌纖維素膜，用自來水沖洗去除培養(yǎng)基，然后用去離子水浸泡至水無色透明。然后用3%的SDS浸泡4次，每12h更換SDS液一次；0. IM氫氧化鈉溶液浸泡4次,每12h更換一次氫氧化鈉溶液,超聲波60min,超純水浸泡6次,每12h更換超純水一次。3細菌纖維素濕膜塊的制備采用低溫(37°C)烘干法，烘干24h，制備不同細菌纖維素含量0. 1%的細菌纖維素濕膜塊。4高分子溶液的配制采用高溫(110°C)高壓法(0.08MPa)，配制PVA的水溶液，靜置過夜去除氣泡。配制所得的PVA溶液濃度為40%，PVA分子量(89000 98000)。模擬體液SBF 配方(I 倍濃度)=NaCl 8. 035g, NaHC030. 355g, KCl 0. 225g,K2HP04. 3H20 0. 231g, MgC12. 6H206. 311g,IM HCl 0. 39ml,無水 CaC120. 292g，無水Na2S040. 072g，三(羥甲基)氨基甲烷(tris) 6. 118g, IMHCl 5ml。配制PVA/SBF混合溶液將40%濃度的PVA溶液與2倍濃度的SBF溶液，等比例混合，攪拌均勻，靜置過夜去除氣泡，得到單倍濃度的PVA/SBF混合液。配制所得PVA/SBF混合液，其中PVA濃度為20%，PVA分子量(89000 98000)，SBF為I倍濃度。5細菌纖維素浸潰高分子溶液
將細菌纖維素濕膜裁成2cmX3cmX0. 8cm，浸泡于所配制的PVA溶液中，7天，保溫96。。。取出與PVA溶液充分滲透平衡的BC/PVA膜，清除表面多余的高分子溶液。將上述的BC/PVA膜，置于PVA/SBF混合溶液中，控制混合液的高度不超過2mm，浸泡I天，得到BC/PVA/HA膜塊。6 壓模將步驟5得到的BC/PVA/HA膜塊壓入個體化軟骨模具中成型。上述個體化豬軟骨模具的制備過程為Micix)CT掃描豬軟骨得到其斷層掃描圖片，使用Mimicsl4. 0進行三維重建,并在MagicslO. 11中基于重建后的外輪廓設(shè)計模板。采用光敏樹脂光固化成型豬軟骨模具。
7凍融交聯(lián)將BC/PVA/HA成型膜于 20°C /25°C反復(fù)凍融，8次，物理交聯(lián)形成BC/PVA/HA豬的軟骨替換物。本實施例所制備的聚乙烯醇/細菌纖維素復(fù)合水凝膠，力學(xué)強度基本可以匹配人體關(guān)節(jié)軟骨所需，采用模擬體液對復(fù)合水凝膠進行部分礦化(控制礦化層厚度)，使其形成層漸的羥基磷灰石結(jié)構(gòu)，從而滿足復(fù)合修復(fù)材料與軟骨下骨層的牢固結(jié)合。實施例5聚乙烯醇/聚乙烯吡咯烷基酮/細菌纖維素/羥基磷灰石一體化軟骨修復(fù)制品的制備I醫(yī)用細菌纖維素膜制備培養(yǎng)基成分酵母粉10g,蛋白胨6g, MgS04 :0. 2g, CaC12 :0. lg，葡萄糖:20g,椰汁1000ml,滅菌后加入IOml無水乙醇。培養(yǎng)方法接種木醋桿菌到種子培養(yǎng)液，180rpm震蕩培養(yǎng)18h后，以10%的比例接種發(fā)酵培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)20d。2醫(yī)用天然細菌纖維素產(chǎn)品的純化處理發(fā)酵所得的細菌纖維素膜，用自來水沖洗去除培養(yǎng)基，然后用去離子水浸泡至水無色透明。然后用3%的SDS浸泡4次，每12h更換SDS液一次；0. IM氫氧化鈉溶液浸泡4次,每12h更換一次氫氧化鈉溶液,超聲波60min,超純水浸泡6次,每12h更換超純水一次。3細菌纖維素濕膜塊的制備采用低溫(37°C)烘干法，烘干24h，制備細菌纖維素質(zhì)量分數(shù)為1%的細菌纖維素濕月吳塊。4高分子溶液的配制采用高溫(Il(TC)高壓法(0. 08MPa)，配制PVA/PVP混合的水溶液，靜置過夜去除氣泡。配制所得PVA/PVP混合的水溶液，其中PVA濃度30%，PVA分子量(89000 98000)，PVP 濃度 1%，PVP 分子量(45000 50000)。5細菌纖維素浸潰高分子溶液將細菌纖維素濕膜裁成2cmX 3cmX0. 8cm,浸泡于所配制的PVA/PVP混合溶液中，7天，保溫96°C。
取出與PVA/PVA混合高分子溶液充分滲透平衡的BC/PVA/PVP膜，清除表面多余的高分子溶液待用。6 壓模將步驟5得到的BC/PVA/PVP膜壓入個體化豬軟骨模具中成型。上述個體化豬軟骨模具的制備過程為Micix)CT掃描豬軟骨得到其斷層掃描圖片，使用Mimicsl4. 0進行三維重建,并在MagicslO. 11中基于重建后的外輪廓設(shè)計模板。采用光敏樹脂光固化成型豬軟骨模具。7凍融交聯(lián) 將步驟6得到的BC/PVA/PVP成型膜于 20°C /25°C反復(fù)凍融8次，物理交聯(lián)形成BC/PVA/PVP復(fù)合材料。8 礦化將步驟7得到的BC/PVA/PVP復(fù)合材料，置于模擬體液SBF中，控制模擬體液的高度不超過2mm，礦化I天，得到BC/PVA/PVP/HA豬的軟骨替換物。上述的模擬體液SBF 配方NaCl 8. 035g, NaHC030. 355g, KCl 0. 225g,K2HP04. 3H20 0. 231g, MgC12. 6H206. 311g,IM HCl 0. 39ml,無水 CaC120. 292g，無水Na2S040. 072g，三(羥甲基)氨基甲烷(tris) 6. 118g, IMHCl 5ml。本實施例所制備的聚乙烯醇/聚乙烯吡咯烷基酮/細菌纖維素復(fù)合水凝膠，力學(xué)強度基本可以匹配人體關(guān)節(jié)軟骨所需，采用模擬體液對復(fù)合水凝膠進行部分礦化(控制礦化層厚度)，使其形成層漸的羥基磷灰石結(jié)構(gòu)，從而滿足復(fù)合修復(fù)材料與軟骨下骨層的牢固
彡口口 實施例6聚乙烯醇/聚乙烯吡咯烷基酮/細菌纖維素/羥基磷灰石一體化軟骨修復(fù)制品的制備I醫(yī)用細菌纖維素膜制備培養(yǎng)基成分酵母粉10g,蛋白胨6g, MgS04 0. 2g, CaC12 :0. lg，葡萄糖:20g,椰汁1000ml，滅菌后加入IOml無水乙醇培養(yǎng)方法接種木醋桿菌到種子培養(yǎng)液，180rpm震蕩培養(yǎng)18h后，以10%的比例接種發(fā)酵培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)20d。2醫(yī)用天然細菌纖維素產(chǎn)品的純化處理發(fā)酵所得的細菌纖維素膜，用自來水沖洗去除培養(yǎng)基，然后用去離子水浸泡至水無色透明。然后用3%的SDS浸泡4次，每12h更換SDS液一次；0. IM氫氧化鈉溶液浸泡4次,每12h更換一次氫氧化鈉溶液,超聲波60min,超純水浸泡6次,每12h更換超純水一次。3細菌纖維素濕膜塊的制備采用低溫(37°C)烘干法，烘干24h，制備不同細菌纖維素含量1%的細菌纖維素濕膜塊。4高分子溶液的配制采用高溫(Il(TC)高壓法(0. 08MPa)，配制PVA的水溶液；PVA濃度為40%，PVA分子量(89000 98000)；采用高溫(Il(TC)高壓法(0. 08MPa)，配制PVA/PVP混合的水溶液，靜置過夜去除氣泡；配制所得PVA/PVP混合的水溶液，其中PVA濃度為30%，PVA分子量(89000 98000)，PVP 濃度為 3%，PVP 分子量(45000 50000)；模擬體液SBF 配方(I 倍濃度)NaCl 8. 035g, NaHC030. 355g, KCl 0. 225g,K2HP04. 3H20 0. 231g, MgC12. 6H206. 311g,IM HCl 0. 39ml,無水 CaC120. 292g，無水Na2S040. 072g，三(羥甲基)氨基甲烷(tris) 6. 118g, IMHCl 5ml ；配制PVA/SBF混合溶液將40%的PVA溶液與2倍濃度的SBF溶液，等比例混合，攪拌均勻，靜置過夜去除氣泡，得到單倍濃度的PVA/SBF混合液。配制所得PVA/SBF混合液，其中PVA濃度為20%，PVA分子量(89000 98000)，SBF為I倍濃度；5細菌纖維素浸潰高分子溶液將細菌纖維素濕膜裁成2cmX3cmX0. 8cm，浸泡于所配制的PVA/PVP混合的水溶液中，7天，保溫96 C。 取出充分滲透平衡的BC/PVA/PVP膜，清除表面多余的高分子溶液。將上述的BC/PVA/PVP膜，置于PVA/SBF混合溶液中，控制混合液的高度不超過2mm,浸泡I天，得到BC/PVA/PVP/HA膜塊。6 壓模將步驟5得到的BC/PVA/PVP/HA膜塊壓入個體化軟骨模具中成型。上述個體化豬軟骨模具的制備過程為Micix)CT掃描豬軟骨得到其斷層掃描圖片，使用Mimicsl4. 0進行三維重建,并在MagicslO. 11中基于重建后的外輪廓設(shè)計模板。采用光敏樹脂光固化成型豬軟骨模具。7凍融交聯(lián)將BC/PVA/PVP/HA成型膜于 20°C /25°C反復(fù)凍融，8次，物理交聯(lián)形成BC/PVA/PVP/HA豬的軟骨替換物。本實施例所制備的聚乙烯醇/聚乙烯吡咯烷基酮/細菌纖維素復(fù)合水凝膠，力學(xué)強度基本可以匹配人體關(guān)節(jié)軟骨所需，采用模擬體液對復(fù)合水凝膠進行部分礦化(控制礦化層厚度)，使其形成層漸的羥基磷灰石結(jié)構(gòu)，從而滿足復(fù)合修復(fù)材料與軟骨下骨層的牢固
彡口口 實施例7結(jié)合MicroCT掃描，制備聚乙烯醇/聚乙烯吡咯烷基酮/細菌纖維素復(fù)合水凝膠半月板替換物I醫(yī)用細菌纖維素膜制備培養(yǎng)基成分酵母粉10g,蛋白胨6g, MgS04 :0. 2g, CaC12 :0. lg，葡萄糖:20g,椰汁1000ml,滅菌后加入IOml無水乙醇。培養(yǎng)方法接種木醋桿菌到種子培養(yǎng)液，180rpm震蕩培養(yǎng)18h后，以10%的比例接種發(fā)酵培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)20d。2醫(yī)用天然細菌纖維素產(chǎn)品的純化處理發(fā)酵所得的細菌纖維素膜，用自來水沖洗去除培養(yǎng)基，然后用去離子水浸泡至水無色透明。然后用3%的SDS浸泡4次，每12h更換SDS液一次；0. IM氫氧化鈉溶液浸泡4次,每12h更換一次氫氧化鈉溶液,超聲波60min,超純水浸泡6次,每12h更換超純水一次。3細菌纖維素濕膜塊的制備
采用低溫烘干法，37°C烘干24h，采用低溫(37°C)烘干法，烘干24h，制備細菌纖維素質(zhì)量分數(shù)為0. 1%的細菌纖維素濕膜塊。4高分子溶液的配制采用高溫(Il(TC)高壓法(0. 08MPa)，配制PVA/PVP混合的高分子水溶液，靜置過夜去除氣泡。配制所得PVA/PVP混合的高分子水溶液，其中PVA濃度為30%，PVA分子量(89000^98000), PVP 濃度為 1%，PVP 分子量(45000 50000)5細菌纖維素浸潰高分子溶液
將細菌纖維素濕膜裁成所需尺寸，浸泡于所配制的適當(dāng)濃度的PVA/PVP混合溶液中，3天，保溫96 C。取出充分滲透平衡的BC/PVA/PVP膜，清除表面多余的高分子溶液待用。6 壓模將步驟5得到的BC/PVA/PVP膜壓入半月板模具中成型上述個體化豬半月板模具的制備過程為Micix)CT掃描豬半月板得到其斷層掃描圖片，使用Mimicsl4. 0進行三維重建,并在MagicslO. 11中基于重建后的外輪廓設(shè)計模板。采用光敏樹脂光固化成型半月板模具。7凍融交聯(lián)將成型的BC/PVA/PVP膜塊于_20°C /25°C反復(fù)凍融，8次，物理交聯(lián)形成豬的半月板BC/PVA/PVP復(fù)合替換物。實驗測得新鮮成年豬內(nèi)側(cè)半月板的壓縮模量在前后角部分較高，約為40_50MPa，體部較弱，約為15-30Mpa ;上述實施例制備的材料最大壓縮模量能達到60MPa以上，足以匹配人體半月板的要求。
權(quán)利要求
1.一種細菌纖維素/聚乙烯醇復(fù)合材料的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)醫(yī)用細菌纖維素濕膜塊的制備 接種木醋桿菌(Acetobacter xyIinum)到種子培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng),再接種到發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，得到醫(yī)用細菌纖維素膜，然后經(jīng)純化處理后，再采用脫水的方式制備細菌纖維素含量0. 05 質(zhì)量分數(shù)的細菌纖維素濕膜塊； (2)高分子溶液的配制 在高溫95 130°C，高壓0. 05 0. 15MPa的條件下，配制質(zhì)量濃度20 40%的聚乙烯醇水溶液，靜置過夜去除氣泡，制得的溶液為高分子溶液I ; 或者在上述配制聚乙烯醇水溶液的過程中加入聚乙烯基吡咯烷酮，其中聚乙烯基吡咯烷酮的質(zhì)量濃度0. 5 15%，制得的溶液為高分子溶液II ； 或者在高分子溶液I中還加入模擬體液，制得的溶液為高分子溶液III ； (3)細菌纖維素濕膜塊浸潰高分子溶液 將細菌纖維素濕膜塊裁成所需尺寸，浸泡于所配制的高分子溶液I或Ii中no天，保溫8(T105°C ;取出充分滲透平衡的復(fù)合膜塊I或II，清除表面多余的溶液待用； 或者將上述復(fù)合膜塊I或II部分浸泡于高分子溶液III中，控制浸泡高度不超過2mm，浸泡4 72h，取出充分滲透平衡的復(fù)合膜塊IIIi或IIIii,清除表面多余的溶液待用； (4)凍融交聯(lián) 將步驟(3)制得的復(fù)合膜塊I、11、111;或IIIii于-3(T-2(TC/15 25°C反復(fù)凍融，4 10次，物理交聯(lián)形成復(fù)合材料I、II >111 i或III
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)所述醫(yī)用細菌纖維素膜的純化處理 將步驟(I)制得的細菌纖維素膜，用自來水沖洗去除培養(yǎng)基，然后用去離子水浸泡至水無色透明，然后用0. 19T3%質(zhì)量分數(shù)的十二烷基磺酸鈉溶液浸泡2 4次，每12 24h更換十二烷基磺酸鈉溶液一次；0. 05M 1M氫氧化鈉溶液浸泡2 4次，每12 24h更換一次氫氧化鈉溶液，超聲波60min，超純水浸泡2飛次，每12 24h更換超純水一次。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的制備方法，其特征在于，所述聚乙烯基吡咯烷酮分子量8000^200000，聚乙烯醇分子量85000 186000。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)得到的復(fù)合材料I或II部分浸泡于模擬體液中，控制浸泡高度不超過2mm，浸泡4 72h。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的制備方法，其特征在于，所述高分子溶液I中聚乙烯醇的質(zhì)量濃度為28 40%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5任意一項方法制備的復(fù)合材料，其特征在于，該材料的壓縮模量為30MPa以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的復(fù)合材料，其特征在于，該材料的壓縮模量為5(T60MPa。
8.權(quán)利要求5或6或7所述復(fù)合材料的應(yīng)用，其特征在于，該復(fù)合材料用于制備半月板或軟骨組織的替換物，或制備半月板或軟骨組織的修復(fù)制品。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述半月板替換物或修復(fù)制品的制備 電子計算機X射線斷層掃描技術(shù)或者核磁共振成像掃描半月板得到其斷層掃描圖片，使用Mimicsl4. O軟件進行三維重建,并在MagicslO. 11軟件中基于重建后的外輪廓設(shè)計模板，采用光敏樹脂光固化成型，制得半月板模具，將步驟(3)制得的復(fù)合膜塊I或II壓入上述模具，按照步驟(4)進行凍融交聯(lián)，以制備半月板替換物或修復(fù)制品。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述軟骨替換或修復(fù)制品的制備 電子計算機X射線斷層掃描技術(shù)或者核磁共振成像掃描軟骨得到其斷層掃描圖片，使用Mimicsl4. 0軟件進行三維重建，并在MagicslO. 11軟件中基于重建后的外輪廓設(shè)計模板，采用光敏樹脂光固化成型，制得軟骨模具，將步驟(3)制得的復(fù)合膜塊I、IIJIIi或IIIii壓入上述模具，按照步驟(4)進行凍融交聯(lián)，以制備成復(fù)合材料I或II，或軟骨替換物或修復(fù)制品IIIi或III ，所述復(fù)合材料I或II部分浸泡于模擬體液中，控制浸泡高度不超過2mm，浸泡4 72h，制備成軟骨替換物或修復(fù)制品I或II。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種細菌纖維素/聚乙烯醇復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用，包括如下步驟(1)醫(yī)用細菌纖維素濕膜塊的制備；(2)高分子溶液的配制在高溫95~130℃，高壓0.05~0.15MPa的條件下，配制質(zhì)量濃度20~40%的聚乙烯醇水溶液，即為高分子溶液；(3)細菌纖維素濕膜塊浸漬高分子溶液(4)凍融交聯(lián)，形成復(fù)合材料。本發(fā)明制備的PVA/BC復(fù)合系列材料，當(dāng)PVA濃度達到20%時，壓縮模量達到30MPa以上，尤其是PVA濃度達到28%時，壓縮模量達到50MPa以上，可用于制備半月板或軟骨組織的替換物，或制備半月板或軟骨組織的修復(fù)制品，能滿足軟骨、半月板等承重型組織的力學(xué)強度需要。
文檔編號A61L27/48GK102961784SQ20121051034
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月29日
發(fā)明者王迎軍, 任力, 李立風(fēng) 申請人:華南理工大學(xué)