專利名稱：透明質酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂質體及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種脂質體，尤其涉及ー種透明質酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂質體及其制備方法。
背景技術：
腫瘤治療是當今的未解難題，是醫學界一直面臨的ー個重大挑戰。藥物治療是腫瘤治療的ー個重要手段，傳統抗腫瘤藥物雖取得一定的療效，但其造成的過敏反應、骨髄造血系統抑制、脫發等毒副作用，極大限制 了其在臨床應用，成為臨床治療的難題之一。如何提高腫瘤治療的療效是當今醫學一個亟待解決的問題。針對這ー缺點，靶向治療成為腫瘤治療的研究熱點，以納米作為祀向載體成為醫藥學者研究的焦點。所謂靶向藥物治療就是使藥物瞄準腫瘤部位，在局部保存相對高的濃度，延長藥物的時間，提高對腫瘤的殺傷力，而對正常組織細胞作用較小。目前，用于腫瘤靶向治療的藥物有化療藥(如緩釋化療藥，脂質體化療藥)，化學消融藥(如無水こ醇，冰醋酸，鹽酸，硫酸等蛋白凝固劑)，基因及分子靶向藥，中藥等。藥物可通過多條途經給予，如經皮穿刺給藥、術中給藥、內鏡或腔鏡下腫瘤局部給藥、血管介入給藥、藥物經皮超聲電導療法、腔內藥物灌注等。同時，還衍生出冷凍化學療法、熱化學療法、放化療同步療法等新的治療方法，大大減輕了患者痛苦，明顯提高了療效。紫杉醇(Paclitaxel, PTX)是ー種常用的廣譜抗腫瘤藥，由紅豆杉屬植物提取,具有獨特抗癌機制，屬于新型抗微管藥物，通過促進微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白穩定，抑制細胞有絲分裂，對卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多種晚期癌癥有一定療效。但由于其在水中的溶解度極小，ロ服無法吸收，現臨床應用的PTX注射液以聚氧こ烯蓖麻油及無水こ醇作為助溶載體，但使用時引起多種毒副作用，其中過敏反應最為嚴重，加上其缺乏靶向性，用量較大，更加増加其毒副作用，使其應用嚴重受限。針對PTX水溶性差、缺乏靶向性，現有技術中，將PTX制成脂質體。脂質體為ー種新型納米藥物載體，在藥物運送方面具有高效、穩定等優點，是磷脂依靠疏水締合作用在水中自發形成的ー種分子有序組合體，為多層囊泡結構，疏水性藥物通過疏水作用嵌在脂質體疏水雙分子層中，以脂質體為載體，不僅可減少機體的超敏反應，還可提高疏水性藥物在水中的溶解量，降低藥物的應用劑量。近些年納米顆粒連接靶向分子，進行腫瘤靶向治療，有了很大的進展。如中國發明專利申請號200610137900. 6 (公開號為101176719A)，該發明提供了
一種紫杉醇多烯紫杉醇脂質體組合藥物及其制備方法，所提供藥物減少藥物劑量近一倍，而療效可以提高15%以上，藥物的毒副作用大大減少。又如中國發明專利申請號200710010448. 1，該發明提供了一種紫杉醇脂質體及其制備方法，解決了紫杉醇水不溶性缺點，紫杉醇熱敏長循環脂質體不僅具有紫杉醇普通脂質體制劑的低毒性、高穩定性和減少毒副作用等特點，還同時具有長循環脂質體的長循環性以及熱敏脂質體的熱敏性，可延長紫杉醇在體內的循環時間，提高對腫瘤的靶向性，從而提高其抗腫瘤作用。但是，目前國內外有關透明質酸寡聚糖(hyaluronan oligosaccharides, oHA)制備PTX納米材料的方法，尚未見報道。oHA作為靶點分子靶向腫瘤細胞表面CD44有效殺傷腫瘤細胞的同時，不對正常細胞造成影響。與普通脂質體相比，具有穩定性強、包封率高的特點，是ー種理想的抗腫瘤藥物，因此，如果開發出oHA-PTX-Lipid靶向治療腫瘤的潛力，將對腫瘤治療產生巨大的影響。

發明內容
針對現有技術中PTX水溶性差、缺乏靶向性的弱點，本發明的目的在于提供ー種透明質酸寡聚糖包裹紫杉醇脂質體(oHA-PTX-Lipid)及其制備方法。oHA-PTX-Lipid可以有效提高PTX在水中的溶解量，通過oHA靶向腫瘤細胞表面CD44受體，有效提高其在腫瘤部位的濃度，減少PTX的用藥劑量，增強其生物利用度。根據本發明的另ー個方面，提供ー種透明質酸寡聚糖包裹紫杉醇脂質體的制備方 法，即首先通過薄膜水化法，用磷脂制得載藥脂質體，然后，將其與OHA孵育過夜，雙蒸水充分透析，經高壓均質機均質，即得透明質酸寡聚糖包裹紫杉醇脂質體oHA-PTX-Lipid，該法步驟簡單，操作簡便，獲得的oHA-PTX-Lipid大小均一，包封率高，性質穩定。具體地，本發明提供了ー種透明質酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂質體的制備方法，包括以下步驟
步驟I，稱取磷脂和紫杉醇，制備磷脂-紫杉醇蜂窩狀薄膜，其中，磷脂與紫杉醇的質量比為(20 50) :1 ；
步驟2，將制得的薄膜水化，使磷脂的質量百分濃度為19T5% ；
步驟3，將透明質酸寡聚糖與こ基ニ甲基胺丙基碳化ニ亞胺在pH值為3飛的醋酸鹽緩沖液中35 50°C預孵育，得到透明質酸寡聚糖-醋酸鹽緩沖液；
步驟4，將步驟2獲得的懸濁液加入到步驟3獲得的透明質酸寡聚糖-醋酸鹽緩沖液中，35 50°C孵育；
步驟5，將步驟4獲得的混合物分離，制得透明質酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂質體；
其中，磷脂、紫杉醇、透明質酸寡聚糖和こ基ニ甲基胺丙基碳化ニ亞胺的質量比為(20 50):1: (0.25 I): (2. 5 10)，透明質酸寡聚糖與醋酸鹽緩沖液的質量體積比為(2 8)g:1mL0其中，制備所述蜂窩狀薄膜可以采用的方法如將磷脂和紫杉醇溶解在溶劑中，并優選為溶解在易揮發溶劑中，然后溶劑揮發制得透明質酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂質體。所述易揮發溶劑可以選自三氯甲烷、こ醇、ニ氯甲烷、こ酸こ酷、丙酮、叔丁基醚、正庚烷、こ醚、甲醇、甲苯、苯等中的至少ー種。優選地，所述易揮發性溶劑為三氯甲烷和甲醇的混合物，兩者體積比為65: 35。優選地，步驟I中，所述磷脂選自ニ烷酰基磷脂酰膽堿、ニ油酰基磷脂酰膽堿(D0PC)、ニ烷酰基磷脂酰醇胺、ニ油酰基磷脂酰醇胺、ニ烷酰基磷脂酰甘油和ニ烷酰基磷脂酰氨基酸等中的至少ー種。優選地，所述ニ烷酰基磷脂酰膽堿為ニ CltT C20烷酰基磷脂酰膽堿，如ニ C12烷酰基磷脂酰膽堿(DLPC )、ニ C14烷酰基磷脂酰膽堿(DMPC )、ニ C16烷酰基磷脂酰膽堿(DPPC )、ニC18烷酰基磷脂酰膽堿(DSPC)等。優選地，所述ニ烷酰基磷脂酰醇胺為ニ烷酰基磷脂酰こ醇胺。優選地，所述ニ烷酰基磷脂酰こ醇胺為ニ CltT C20烷酰基磷脂酰こ醇胺，如ニ C12烷酰基磷脂酰こ醇胺(又名為二月桂酰磷脂酰こ醇胺，DLPE)、ニ C14烷酰基磷脂酰こ醇胺(DMPE)、ニ C18烷酰基磷脂酰こ醇胺(DSPE)等。優選地，所述ニ油酰基磷脂酰醇胺為ニ油酰基磷脂酰こ醇胺(DOPE)。優選地，所述ニ烷酰基磷脂酰甘油為ニCltT C2tl烷酰基磷脂酰甘油，如ニ- C12烷酰基磷脂酰甘油(又名為二月桂酰磷脂酰甘油，DLPG)等。
優選地，所述ニ烷酰基磷脂酰氨基酸為ニ烷酰基磷脂酰絲氨酸。優選地，所述ニ烷酰基磷脂酰絲氨酸為ニ CltTC2tl烷酰基磷脂酰絲氨酸，如ニ C18烷酰基磷脂酰絲氨酸(DSPS)等。優選地，所述磷脂為DLPE和DLPG的混合物，其中，DLPE和DLPG的質量比為(9 1):1o優選地，步驟2中，水化至少2h。優選地，步驟2中，薄膜在45°C旋轉水化至少2h。優選地，步驟3中，所述醋酸鹽緩沖液的pH為4. 5。優選地，步驟3中預孵育至少f 3h，步驟4中孵育為至少4 12h。優選地，步驟3中預孵育至少2h，步驟4中孵育為至少8h。優選地，步驟3中預孵育溫度為37°C，步驟4中孵育溫度為37°C。優選地，步驟5中，將步驟4獲得的混合物透析，均質，干燥，制得透明質酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂質體。優選地，所述透析具體為將步驟4所得混合物轉移至截留分子量為10000的透析袋中，雙蒸水充分透析24h。優選地，所述均質具體為采用高壓均質機均質,壓カL 5-2萬PSI，循環次數5-10次。本發明還提供了ー種上述制備方法制備的透明質酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂質體。優選地，所述透明質酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂質體中紫杉醇的含量為2 5wt%，透明質酸寡聚糖含量為0. 8 1. 2wt%。優選地，所述透明質酸寡聚糖含量為lwt%。本發明提供的透明質酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂質體大小均一，包封率高，性質穩定，能長期保存克服了 PTX水溶性差、缺乏靶向性等缺點，可用于乳腺癌，卵巣癌，頭頸癌等CD44高表達的惡性腫瘤的靶向治療，有效提高PTX的生物利用度。實驗研究結果表明，本發明制備的oHA-PTX-Lipid在體外、體內都表現出良好的抗腫瘤效果，與傳統的PTX相比，明顯提高其抗腫瘤效果。
具體實施例方式以下通過具體的實施例對本發明的技術方案作進ー步描述，以更好地理解本發明。實施例1稱取820mg DLPE、380mg DLPG和40mg PTX，加20ml有機溶劑溶于250ml圓底燒瓶，50°C混勻10-20min，真空抽干4h，-80°C冰箱2h，冷凍干燥過夜后，用26ml雙蒸水水化，45°C，150r/min,至少2h ;同時將IOmg透明質酸寡聚糖(oHA )與200mgこ基ニ甲基胺丙基碳化ニ亞胺(EDAC)溶于5ml醋酸鹽緩沖液中，37°C，150 r/min，預孵育2h ;將水化完成后懸濁液加入到預孵育后緩沖液中，37°C，150 r/min，孵育過夜；然后雙蒸水透析24h ;高壓均質，壓カ1. 5萬左右，循環10次；超凈臺0. 22 y m濾器過濾；分裝，-80°C凍過夜，抽干成粉末，制得透明質酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂質體(oHA-PTX-Lipid)。測量本實施例制得的oHA-PTX-Lipid的平均粒徑在120nm左右，大小均一，性質穩定。高效液相法測量計算PTX的含量為3wt%，咔唑法測量計算oHA的含量為lwt%。將其作用于乳腺腫瘤細胞MDA-MB-231上，檢測其對乳腺腫瘤細胞的殺傷作用，結果顯示與相同濃度的單純PTX-市售藥泰素相比其殺傷作用增強2倍，說明本實施例制備的oHA-PTX-Lipid達到了靶向殺傷腫瘤細胞的作用，降低了 PTX的使用劑量，有效提高了 PTX的生物利用度。實施例2
稱取 1440. 3mgDLPE、175. OmgDLPG 和 50. OmgPTX，加 15ml 有機溶劑溶于 250ml 圓底燒瓶，50°C混勻10-20min，真空抽干2h，-80°C冰箱2h，冷凍干燥過夜后，用35ml雙蒸水水化，45°C，150 r/min，至少2h ;同時將14mg oHA與240mg EDAC溶于7ml醋酸鹽緩沖液中，37°C，150 r/min，預孵育2h ;將水化完成后懸濁液加入到預孵育后緩沖液中，37°C，150 r/min,孵育過夜；雙蒸水透析24h ;高壓均質,壓カ1. 5萬左右，循環10次,超凈臺0. 22 y m濾器過濾，分裝，-80°C凍過夜，抽干成粉末，制得透明質酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂質體(oHA-PTX-Lipid)o測量本實施例制得的oHA-PTX-Lipid的平均粒徑在120nm左右，大小均一，性質穩定。高效液相法測量計算PTX的含量為5wt%，咔唑法測量計算oHA的含量為lwt%。將其作用于乳腺腫瘤細胞MDA-MB-231上，檢測其對乳腺腫瘤細胞的殺傷作用。結果顯示與相同濃度的單純PTX-市售藥泰素相比其殺傷作用增強2倍，說明本實施例制備的oHA-PTX-Lipid達到了靶向殺傷腫瘤細胞的作用，降低了 PTX的使用劑量，有效提高了 PTX的生物利用度。實施例3
稱取 600. Omg DLPE、600. Omg DLPG 和 40. Omg PTX，加 15ml 有機溶劑溶于 250ml 圓底燒瓶，50°C混勻10-20min，真空抽干2h，-80°C冰箱2h，冷凍干燥過夜后，用35ml雙蒸水水化，45°C，150 r/min，至少2h ;同時將14mg oHA與240mg EDAC溶于7ml醋酸鹽緩沖液中，37°C, 150 r/min，預孵育2h ;將水化完成后懸濁液加入到預孵育后緩沖液中，37°C，150 r/min,孵育過夜；雙蒸水透析24h,高壓均質,壓カ1. 5萬左右,循環10次,超凈臺0. 22 y m濾器過濾，分裝，_80°C凍過夜，抽干成粉末，制得透明質酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂質體。測量本實施例制得的oHA-PTX-Lipid的平均粒徑在120nm左右，大小均一，性質穩定。高效液相法測量計算PTX的含量為2wt%，咔唑法測量計算oHA的含量為lwt%。將其作用于乳腺腫瘤細胞MDA-MB-231上，檢測其對乳腺腫瘤細胞的殺傷作用。結果顯示與相同濃度的單純PTX-市售藥泰素相比其殺傷作用增強2倍，說明本實施例制備的oHA-PTX-Lipid達到了靶向殺傷腫瘤細胞的作用，降低了 PTX的使用劑量，有效提高了 PTX的生物利用度。實施例4
稱取 800. Omg DLPE、600. Omg DLPG 和 40. Omg PTX，加 15ml 有機溶劑溶于 250ml 圓底燒瓶，50°C混勻10-20min，真空抽干2h，-80°C冰箱2h，冷凍干燥過夜后，用35ml雙蒸水水化，45°C，150 r/min，至少2h ;同時將16mg oHA與280mg EDAC溶于8ml醋酸鹽緩沖液中，37°C, 150 r/min，預孵育2h ;將水化完成后懸濁液加入到預孵育后緩沖液中，37°C，150 r/min,孵育過夜；雙蒸水透析24h,高壓均質,壓カ1. 5萬左右,循環10次,超凈臺0. 22 y m濾器過濾，分裝，_80°C凍過夜，抽干成粉末，制得透明質酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂質體。實施例5
稱取 900. Omg DLPE、600. Omg DLPG 和 40. Omg PTX，加 15ml 有機溶劑溶于 250ml 圓底燒瓶，50°C混勻10-20min，真空抽干2h，-80°C冰箱2h，冷凍干燥過夜后，用35ml雙蒸水水化，45°C，150 r/min，至少2h ;同時將20mg oHA與300mg EDAC溶于IOml醋酸鹽緩沖液中，37°C，150 r/min，預孵育2h ;將水化完成后懸濁液 加入到預孵育后緩沖液中，37°C，150 r/min,孵育過夜；雙蒸水透析24h,高壓均質,壓カ1. 5萬左右,循環10次,超凈臺0. 22 y m濾器過濾，分裝，_80°C凍過夜，抽干成粉末，制得透明質酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂質體。測量實施例4飛制得的oHA-PTX-Lipid的大小均一，性質穩定，且實驗結果表明實施例4飛作用于乳腺腫瘤細胞MDA-MB-231也能達到了靶向殺傷腫瘤細胞的作用，降低了PTX的使用劑量，有效提高了 PTX的生物利用度。脂質體為ー種新型納米藥物載體，在藥物運送方面具有高效、穩定等優點，是磷脂依靠疏水締合作用在水中自發形成的ー種分子有序組合體，為多層囊泡結構，疏水性藥物通過疏水作用嵌在脂質體疏水雙分子層中，以脂質體為載體，不僅可減少機體的超敏反應，還可提高疏水性藥物在水中的溶解量，降低藥物的應用劑量。本發明oHA-PTX-Lipid中脂質體可以增強PTX在水中的分散度，脂質體上連接oHA可以靶向結合細胞表面CD44受體。CD44受體是一種廣泛分布于細胞表面的跨膜糖蛋白受體，屬于黏附因子家族，介導細胞與細胞外基質粘附，淋巴細胞歸巢等多種生理和病理過程。研究發現，CD44受體在許多腫瘤細胞上高度表達，其主要配體為透明質酸(HA)。oHA是HA的降解產物，與HA具有相似的糖醛酸結構，只是oHA的雙糖単位數目較少，oHA同樣具有特異性與CD44結合的能力。但是與HA相比，oHA具有代謝清除率低、解除腫瘤細胞表面糖外衣等生物學功能優勢，同時oHA溶解度高于HA，技術制作上優于HA作為靶向分子接連。基于腫瘤細胞表面CD44可與oHA結合，使得oHA可成為治療CD44高表達腫瘤細胞的靶向性配體。運用oHA攜帯化療藥物，可以降低CD44高表達腫瘤動物模型中腫瘤大小，提高腫瘤部位藥物濃度，達到靶向治療腫瘤的效果。近些年納米顆粒連接靶向分子，進行腫瘤靶向治療，有了很大的進展。本發明脂質體表面的oHA可直接靶向腫瘤細胞表面CD44受體，解除腫瘤細胞表面HA糖外衣，提高腫瘤部位PTX濃度，增強其殺傷活性及生物利用度，為腫瘤靶向治療開辟了一條新的途徑。目前國內外有關oHA制備PTX納米材料的方法，尚未見報道。而且本發明oHA-PTX-Lipid中oHA作為靶點分子靶向腫瘤細胞表面CD44有效殺傷腫瘤細胞的同時，不對正常細胞造成影響。與普通脂質體相比，具有穩定性強、包封率高的特點，是ー種理想的抗腫瘤藥物。本發明oHA-PTX-Lipid作為靶向性抗腫瘤藥物具有進入臨床應用的潛力，在腫瘤治療方面可產生很大突破。以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發明進行的等同修改和替代也都在本發明的范疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在 本發明的范圍內。
權利要求
1.一種透明質酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂質體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1，稱取磷脂和紫杉醇，制備磷脂-紫杉醇蜂窩狀薄膜；步驟2，將制得的薄膜水化，使磷脂的質量百分濃度為19Γ5%，得到懸濁液；步驟3，將透明質酸寡聚糖與乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺在pH值為3飛的醋酸鹽緩沖液中35 50°C預孵育，得到寡聚糖-醋酸鹽緩沖液；步驟4，將步驟2獲得的懸濁液加入到步驟3獲得的透明質酸寡聚糖-醋酸鹽緩沖液中，35 50°C孵育；步驟5，將步驟4獲得的混合物分離，制得透明質酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂質體；其中，磷脂、紫杉醇、透明質酸寡聚糖和乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺的質量比為 (20 50):1: (O. 25 I): (2. 5 10)，透明質酸寡聚糖與醋酸鹽緩沖液的質量體積比為(2 8) g:1mL0
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟I中，將磷脂和紫杉醇溶解在溶劑中，然后溶劑揮發制得磷脂-紫杉醇蜂窩狀薄膜。
3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟I中，所述磷脂選自二烷酰基磷脂酰膽堿、二油酰基磷脂酰膽堿、二烷酰基磷脂酰醇胺、二油酰基磷脂酰醇胺、二烷酰基磷脂酰甘油和二烷酰基磷脂酰氨基酸中的至少一種。
4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述磷脂為二月桂酰磷脂酰乙醇胺和二月桂酰磷脂酰甘油的混合物，其中，二月桂酰磷脂酰乙醇胺和二月桂酰磷脂酰甘油的質量比為(9 1) :1。
5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟3中，所述醋酸鹽緩沖液的pH值為 4. 5。
6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟3中預孵育至少f3h，步驟4中孵育為至少4 12h。
7.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟3中預孵育溫度為37°C，步驟4 中孵育溫度為37°C。
8.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟5中，將步驟4獲得的混合物透析，均質，干燥，制得寡聚糖包裹的紫杉醇脂質體。
9.一種根據權利要求1所述制備方法制備的透明質酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂質體。
10.根據權利要求9所述的透明質酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂質體，其特征在于，所示透明質酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂質體中紫杉醇的含量為2 5wt%，透明質酸寡聚糖含量為 O. 8 1. 2 wt%0
全文摘要
本發明涉及一種透明質酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂質體的制備方法，包括以下步驟稱取磷脂和紫杉醇，制備磷脂-紫杉醇蜂窩狀薄膜；將制得的薄膜水化；將寡聚糖與乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺在醋酸鹽緩沖液中預孵育；將水化好的懸濁液加入到寡聚糖-醋酸鹽緩沖液中，孵育；將獲得的混合物分離，制得寡聚糖包裹的紫杉醇脂質體。該寡聚糖包裹的紫杉醇脂質體大小均一，包封率高，性質穩定，有效地提高了紫杉醇在水中的溶解性。另外，針對CD44高表達的腫瘤細胞(如乳腺癌等)，該復合物具有較強靶向性(透明質酸特異結合CD44)，能夠有效地提高紫杉醇在腫瘤部位的濃度，減少紫杉醇的用藥劑量，同時降低藥物對人體的毒性作用并增強其生物利用度。
文檔編號A61K9/127GK103006560SQ201210534240
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月12日 優先權日2012年12月12日
發明者高鋒, 劉鷖雯, 何怡青, 楊翠霞, 劉華 申請人:上海市第六人民醫院