專利名稱：S100家族蛋白的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物醫藥技術領域的方法，具體是一種SlOO家族蛋白的應用。
背景技術：
肝纖維化(hepatic fibrosis)是肝臟在受到損傷后,細胞外基質在損傷處過度沉積的病理過程。大多數慢性肝臟疾病均可引起肝纖維化，其病因大致可分為感染性(病毒性肝炎，寄生蟲感染等)，化學毒物性(如酒精、對乙酰氨基酚、氨甲喋呤、過量維生素A等)，自身免疫反應(自身免疫性肝炎，原發性膽汁性肝硬化等)，先天性代謝缺陷(威爾遜氏病、血色病和各種貯積病等)，肥胖以及慢性炎癥性疾病(如結節病)等。肝纖維化的長期積累，會最終導致肝硬化(hepatic cirrhosis)的發生，肝臟中肝小葉結構和血液循環途徑逐漸被改建，肝臟慢慢變形、變硬，后期則出現不同程度的門靜脈高壓和肝臟功能紊亂、代謝功能受損，直至導致上消化道出血、肝腹水，甚至肝癌等并發癥的發生，從而造成患者死亡。
肝硬化在人類主要死亡原因中居4-6位，是除幾種癌癥之外最易致死的疾病，患者在5年內的死亡率為50%。全世界每年死于肝硬化的人數超過了 50萬，并有逐漸增加的趨勢。在西方國家中，肝硬化患者多為酒精性肝病或者慢性丙型肝炎所致。在中國，由于慢性乙型肝炎病人達到了 2000萬人，導致我國肝纖維化的發病率較高，而且其中近25% 30% 慢性乙肝病人可發展為肝硬化。越來越多的病人急需藥物和肝移植的救治，因此對于肝纖維化以及肝硬化的治療，是我國乃至全世界都急切需要解決的問題。但是目前在臨床上還并沒有太多有效的藥物。
肝纖維化的形成一般長達十多年，是一個相當復雜的過程，它包括了肝實質細胞的壞死，肝星狀細胞的激活，細胞外基質的沉積等過程。肝纖維化是一個復雜的生理過程， 受多種因素的影響，隨著研究的深入，發現越來越多的信號通路和細胞因子參與到肝星狀細胞的激活和調節肝纖維化的作用中。因此，肝纖維化是一個復雜的調控網絡。
SlOO是最大的EF手型結構鈣離子結合蛋白家族，已發現該家族有超過20個成員。SlOO蛋白家族都為酸性小分子量蛋白，分子量在10到12kDa之間，并且僅存在于脊椎動物中。通過對這些基因的序列進行比對，發現它們在物種間具有高度的同源性。此家族的蛋白在結構上由兩個不同的EF手型結構所組成，這兩個手型結構通過一個疏水的鉸鏈區相連[Schafer B. ff. , Heizmann C. ff. Trends Biochem Sci, 1996 (4) :134-40. ]。SlOO 蛋白多以非共價鍵結合的二聚體形式存在，當SlOO蛋白與鈣離子結合后，構象會發生變化， 暴露出蛋白內部的疏水區域，用于與其它蛋白相互結合[DempseyA. C. , Walsh M. P. , Shaw G. S. Structure, 2003 (7) :887-97.]。研究發現，SlOO蛋白家族在蛋白磷酸化，調節酶活性，維持鈣離子平衡，細胞骨架動力學，細胞生長、遷移、分化和凋亡等生理活動中起重要作用[Donato R.1nt J Biochem Cell Biol, 2001(7) :637-68. ; Santamaria-Kisiel L.， Rintala-Dempsey A. C. , Shaw G. S. Biochem J, 2006 (2) :201-14.]。此外，還發現它們和人類的一些疾病相關聯，如神經系統疾病，心肌癥，癌發生和炎癥等[Marenholz1,HeizmannC. ff. , Fritz G. Biochem Biophys Res Commun,2004(4) :1111-22.]。
近年來，越來越多的研究發現，許多SlOO家族成員能被分泌到細胞外，進入外周血液循環系統，發揮類似細胞因子的作用，包括S100A4、S100A6、S100A7、S100A8、S100A9、 S100A11、S100B、S100P等，而且這些成員的受體都是晚期糖基化終產物受體(receptor for advanced glycation end products, RAGE) [Sparvero L. J. , Asafu-A djei D. , Kang R., et al.J Transl Med，2009 :17. ]。RAGE最初被鑒定為一系列蛋白及脂類的糖基化和氧化中間產物的受體，在炎癥、腎衰竭、神經變性疾病和糖尿癥中都發揮作用[Ramasamy R.， Vannucci S. J. , Yan S. S. , et al. Glycobiology, 2005 (7) :16R_28R·]。最近的研究發現， RAGE同樣也作為SlOO家族成員的受體，通過與SlOO蛋白結合，從而激活細胞內的信號通路，調節細胞的增殖或者凋亡[LeclercE.，Fritz G.，Weibel M.，et al.J Biol Chem, 2007(43) :31317-31.]。
經過對現有技術的檢索發現，中國專利文獻號CN101275951，
公開日2008_10_01， 記載了一種《鑒定肝纖維化及肝硬化的分子標記及其微陣列系統板》，該技術包括白蛋白； 丙氨酰(膜)氨肽酶；膜聯蛋白A2;載脂蛋白F ;淀粉狀蛋白β (Α4)前體蛋白；α2_糖蛋白1，鋅結合；甜菜堿高半胱氨酸甲基轉移酶；補體成分8，α肽；趨化因子(C-C基元)配基 19 ;補體因子H相關4 ;補體因子H相關5 ;膠原，I，α 2;膠原，III，α I;膠原，XVIII，α I ； 核心蛋白聚糖；皮膚橋蛋白；亞胺甲基轉移酶環化脫氨酶；糖原合成酶2 ;凝溶膠蛋白；干擾素Y ;乳酸脫氫酶B ;內腔蛋白；中間α (球蛋白)抑制因子Hl ;血小板衍生生長因子受體，α肽；SlOO鈣結合蛋白Α4;甲狀腺素受體相關蛋白I;金屬肽酶抑制因子I;以及腫瘤壞死因子；其中之一或者至少包括編碼這些蛋白質的基因其中之一，在這些蛋白質或基因其中有8個為上調節基因，13個為下調節基因，9個為治療標靶，該技術為具篩選能力的分子標記，以早期警告嚴重肝纖維化或肝硬化的發生，該分子標記也是做為對藥物設計具潛力的標靶。但該技術僅公開了 S100A4在肝纖維化過程的表達上調，但并未給出任何工業應用。發明內容
本發明針對現有技術存在的上述不足，提出一種SlOO家族蛋白的應用，為治療肝纖維化提供了更多的作用靶點，以篩選肝纖維化治療藥物。
本發明是通過以下技術方案實現的
本發明涉及一種SlOO家族蛋白的應用，將SlOO家族蛋白作為藥靶分子用于篩選肝纖維化治療藥物。
所述的SlOO 家族蛋白包括但不限于為 S100A4、S100A6、S100A7、S100A8、S100A9、 S100A11、S100B、S100P 等，優選為 S100A4、S100A6、S100A8、S100A9 或 S100A11 中之一；進一步優選為S100A6蛋白及其突變體，其功能性活性片段或其類似物。
所述的S100A6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的應用， 具體通過按照高通量藥物篩選的方法和步驟，通過評價待篩選化合物拮抗SlOO家族蛋白生物活性，經過初篩、復篩、深入篩選、確定篩選等步驟，獲得活性先導化合物。
本發明還涉及所述的sRAGE蛋白作為活性成分可以治療肝纖維化疾病的方法，該方法包括給予患者有效劑量的上述sRAGE蛋白。
所述的有效劑量，即治療量，是指足以產生療效的量。有效量可分一或多次給藥。 通常，有效量足以緩和、改善、穩定、減慢或延遲疾病的進一步發展。
所用的活性成分，其有效劑量可隨給藥模式和待治療疾病的嚴重程度而變化。對大部分大型哺乳動物而言，每天施以有效成分的總劑量約為O. Ol-1OOOmgo通常，成人臨床給藥量的范圍為O. 01-200mg/日，優選為O. 05-100mg/日。
所述的篩選肝纖維化治療藥物是指將經過饑餓培養的細胞中加入所述SlOO家族蛋白后，施加肝纖維化治療藥物并培養后根據細胞活力進行藥物篩選，獲得活性化合物。
所述的饑餓培養是指將細胞接種在96孔細胞板里，在無血清的條件下培養，誘導細胞凋亡。
所述的SlOO家族蛋白的用量為50μ gmL。
所述的施加肝纖維化治療藥物是指在加入SlOO家族蛋白的同時加入不同濃度的待篩選化合物并培養兩天。
所述的細胞包括但不限于動物離體細胞細胞，優選為腫瘤細胞，進一步優選為神經母細胞瘤細胞。
本發明進一步涉及一種sRAGE蛋白在制備肝纖維化治療藥物中的用途。
所述的sRAGE蛋白，即可溶性RAGE (soluble RAGE, sRAGE)為RAGE (晚期糖基化終產物受體，receptor for advanced glycation end products)的胞外區，sRAGE 通過與外周系統中的RAGE配體相結合，導致這些配體無法與膜上的正常RAGE受體相結合，從而起到了阻斷配體的刺激作用，sRAGE是體內RAGE配體的天然拮抗劑。
本發明的所述的sRAGE蛋白優選為hsRAGE及其突變體；其功能性活性片段或其類似物；具有高度同源性的同系物以及編碼包含SEQ IDN0. 2描述的氨基酸序列的蛋白質的載體例如DNA載體(質粒或病毒)。功能性活性片段或類似物可通過添加、插入、修飾、取代或缺失以上所列的氨基酸序列中的一或多個氨基酸殘基而形成。
所述的sRAGE蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
本發明涉及一種藥物組合物，包含作為活性成分的上述sRAGE蛋白以及載體或賦形劑。
所述的藥物組合物的劑型包括片劑、膠囊、散劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液劑、口服液、醑劑、酊劑、氣霧劑、粉霧劑、注射劑、注射用無菌粉末、栓劑等，優選為固態組合物，尤其是凍干粉針劑。
所述的載體是指用于將本發明的融合體蛋白傳送給動物或人的藥學上或食品上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。載體可以是液體或固體。
另一方面，本發明公開了所述的sRAGE作為活性成分可以預防或治療肝纖維化疾病的方法，該方法包括給予患者有效劑量的上述sRAGE 。
本發明首次發現S100家族蛋白與肝纖維化的發生有著緊密的聯系，證明了過量的S100A6能加重肝纖維化，并以S100家族蛋白作為藥靶分子在篩選肝纖維化治療性蛋白 sRAGE，其能有效治療肝纖維化，為肝纖維化的治療提供了新的研究思路，也為治療肝纖維化提供了新的候選藥物篩選平臺和候選藥物。
本發明的藥用組合物可根據熟知的及公認的制藥生產要求的方法制備。藥用組合物適宜包含本發明的蛋白質以及藥學上可接受的載體，并適宜為單位劑量形式。本發明的 藥用組合物可包含前藥形式的本發明的蛋白質，該前藥可在接受者宿主體內代謝轉化成本 發明物的活性形式。本發明的藥用組合物還可與其它療法聯合應用，如同時、序貫或分別應用。本發明 的藥用組合物可包含有其它活性作用物。


圖1為肝纖維化過程中S100家族成員的轉錄變化示意圖。圖2為肝纖維化造模后小鼠肝臟切片的Masson染色示意圖。圖3為肝纖維化形成及恢復過程中S100家族成員的轉錄變化示意圖。圖4為不同程度肝纖維化造模小鼠肝纖維化面積統計示意圖。圖5為不同程度肝纖維化造模小鼠肝臟中羥脯氨酸的含量示意圖。圖6為不同肝纖維化程度下S100家族成員的轉錄變化示意圖。圖7為免疫組織化學鑒定S100A6在肝纖維化過程中的表達和細胞定位示意圖。圖8為正常人肝臟組織和肝纖維化病人肝臟組織切片Masson染色和S100A6的免 疫組化示意圖。圖9為rhS100A6重組蛋白在小鼠肝纖維化過程中的作用實驗肝臟組織切片 Masson染色示意圖。圖10為rhS100A6重組蛋白在小鼠肝纖維化過程中的作用實驗的肝纖維化面積統 計示意圖。圖11為血清中層粘連蛋白的含量測定示意圖。圖12為肝臟中羥脯氨酸含量的測定示意圖。圖13為Coll a 1基因的轉錄變化示意圖。圖14為rhS100A6重組蛋白單獨誘導小鼠肝纖維化的發生實驗的Masson染色示 意圖。圖15為rhS100A6能提高原代肝星狀細胞的細胞活力示意圖。圖16為流式細胞分析rhS100A6對原代肝星狀細胞的細胞周期的影響示意圖。圖17為rhsRAGE蛋白生物活性的測定圖18為rhsRAGE重組蛋白在小鼠肝纖維化過程中的作用實驗肝臟組織切片 Masson染色示意圖。圖19為rhsRAGE重組蛋白在小鼠肝纖維化過程中的作用實驗的肝纖維化面積統 計示意圖。圖20為肝臟中羥脯氨酸含量的測定示意圖。圖21為Collal and Col3 a 1基因的轉錄變化示意圖。
具體實施例方式下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施 例。
一、動物模型的制備
1、小鼠肝纖維化形成及恢復模型
參照文獻(AoyamaT. , Inokuchi S. , Brenner D. A. , Seki E. . CX3CL1-CX3CR1Interaction Prevents Carbon Tetrachloride-1nduced Liver Inflammation and fibrosis in mice. Hepatology，2010，52 (4) : 1390-400)建立小鼠動物模型，大致步驟如下
將雄性C57BL/6小鼠，按O. 5mL/kg體重的劑量腹腔注射CCl4，連續注射9周，每周兩次，9周后停止注射，使小鼠開始自我恢復；分別在注射前CCl4，造模后6周，造模后9周， 停止注射后6周，停止注射后12周取6只小鼠，用苯巴比妥按10 μ L/g體重的劑量麻醉小鼠，通過眼球采集外周血后處死小鼠，獲取肝臟組織；
2、不同程度小鼠肝纖維化模型
參照文獻(AoyamaT. , Inokuchi S., Brenner D. A. , Seki E. . CX3CL1-CX3CR1Interaction Prevents Carbon Tetrachloride-1nduced Liver Inflammation and fibrosis in mice. Hepatology, 2010，52 (4) : 1390-400)建立小鼠動物模型，大致步驟如下
將雄性C57BL/6分為4組，每組6只。一組為對照組，另外三組為實驗組。對實驗組用腹腔分別注射高中低不同劑量的CCl4溶液，連續注射9周，每周兩次；9周后，用苯巴比妥按10yL/g體重的劑量麻醉小鼠，通過眼球采集外周血后處死小鼠，獲取肝臟組織；
二、原代肝星狀細胞的制備和培養
參照文獻(WeiskirchenR. ,Gressner A. M. .1solation and Culture of Hepatic Stellate Cells, Methods Mol Med，2005，117:99-113.)，分離純化和培養小鼠原代肝星狀細胞，大致步驟如下
向小鼠肝臟灌注IV型膠原酶，將肝臟消化成單個細胞，利用梯度離心將非實質細胞與肝實質細胞分離，再利用差速貼壁的方法，將肝星狀細胞與其它非實質細胞分離，從而得到原代的小鼠肝星狀細胞。
三、重組人S100A6蛋白的制備
參照文獻(HeH, Yang T, Jia S, Zhang R, Tu P, Gao J, Yuan Y, Han ff, Yu Y. Expression and purification of bioactive high-purity human S100A6in Escherichia col1. Protein Expr Purif, 2012,83 (I) :98-103.)利用大腸桿菌原核表達系統來表達S100A6，純化得到的重組rhS100A6蛋白，大致步驟如下
通過從H印G2細胞中得到人的S100A6基因插入到pET28質粒中，從而得到 hS100A6原核表達載體，再將構建好的質粒轉化到大腸桿菌中，通 過IPTG誘導表達，再將大腸桿菌超聲破碎，獲得總蛋白液，接下來經過陰離子柱交換層析以及分子篩兩步方法對蛋白進行純化，最終得到的重組rhS100A6蛋白。
所述的H印G2細胞購自上海市岳陽路320號中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，用含20%的胎牛血清和10%的DMSO的DMEM培養液懸浮后保存在液氮中。
四、重組rhsRAGE蛋白的制備
參照文獻(OstendorpT. , Weibel M. , Leclerc E. , et al. Biochem Biophys Res Commun, 2006 (I) :4_11)利用畢赤酵母真核表達系統來表達sRAGE，純化得到的重組rhsRAGE蛋白，大致步驟如下
將人的sRAGE基因插入到pPICZ a A質粒中，從而得到hsRAGE酵母表達載體，再將構建好的質粒轉化到酵母中，通過誘導表達，將培養上清中的蛋白采用陽離子柱交換層析以及分子篩兩步方法對蛋白進行純化，最終得到的重組rhsRAGE蛋白。
五、實驗方法
1、肝臟組織切片制備以及Masson染色觀察
按照常規方法進行肝臟組織切片制備以及Masson染色，同時Masson染色的肝臟組織切片通過對每個個體隨機選取了 5飛個100倍視野，大約O. 3mm2的肝臟組織面積，利用NIS-Elements軟件統計了其中的肝纖維化面積，計算出纖維化面積占肝臟面積的百分比。
2、肝臟組織中脯氨酸含量的測定
采用南京建成羥脯氨酸測試盒來測定小鼠肝臟組織中羥脯氨酸的含量，具體步驟按照試劑盒說明書進行操作。
3、定量 PCR
采用SYBR Premix ExTaq定量PCR試劑(TaKaRa公司)，分別檢測肝臟組織中I型和III型膠原、小鼠SlOO和β -actin進行熒光定量PCR，引物如下，對應SeqIDNo. 3 SeqIDNo. 18。
小鼠sl00a4CAGCACTTCCTCTCTCTTGGTC
CCCTCTTTGCCTGAGTATTTGT
小鼠sl00a6CCAGACTGCGACACATTCCAT
TTGTCACCTTCCTTGCCAGAGT
小鼠sl00a8ATGCCCTCTACAAGAATGACT
AGATGCCACACCCACTTTTAT小鼠sl00a9CGACACCTTCCATCAATACTCTA
ATCAGCATCATACACTCCTCAAA
小鼠 SlOOallGCCACCGTCAGCCACAGTC
TTGTTTCCATCCTTCCCGCT
小鼠 β-actin AGCCTTCCTTCTTGGGTATG
GTGTTGGCATAGAGGTCTTTAC
小鼠colIalCAGACCTGTGTGTTCCCTACTCA
GGATAGCGACATCGGCGG
小鼠col3alGCGAGCGGCTGAGTTTTATG
TAGGACTGACCAAGGTGGCTG
4、S100A6 和 RAGE免疫組織化學染色
按照常規免疫組織化學方法，采用抗小鼠S100A6和RAGE分別檢測肝臟組織中S100A6和 RAGE。
5、放射性免疫法檢測血清中層粘連蛋白的含量
采用上海海研醫學生物技術有限公司層粘連蛋白放射性免疫測試試劑盒來對小鼠血清中羥脯氨酸的含量進行測定，具體步驟按照試劑盒說明書的要求進行操作。
6、細胞周期檢測
按照常規流式細胞方法，檢測原代肝星狀細胞的細胞周期。
7、細胞活力的檢測
按照CCK-8法，檢測原代肝星狀細胞的細胞活力。實施例1
CC14誘導的小鼠肝纖維化模型基因芯片檢測
CC14誘導的小鼠肝纖維化模型，通過連續9周給小鼠腹腔注射CC14，誘導肝纖維化的形成，然后分別采集了注射前，注射后6周、9周以及停止CC14注射后，肝臟開始自我恢復6周、12周的小鼠肝臟組織，通過基因芯片(Affymetrix公司)檢測
結果
進行聚類分析，對整個過程中表達變化的基因進行分類。發現隨著纖維化的發生約有254條基因的表達量呈明顯增加的趨勢，但到了恢復階段，它們的表達量又恢復到了正常水平。在這些基因中，除了包括膠原蛋白，基質金屬蛋白酶，炎癥因子等與肝纖維化相關聯的基因外，從中還發現了一類鈣離子結合蛋白家族——SlOO蛋白家族，其很多成員都會隨著肝纖維化的發生，出現基因表達量上調的情況(圖1)。實施例2
肝纖維化過程中SlOO家族基因表達變化
2.1小鼠肝纖維化形成及恢復模型的SlOO家族基因表達變化
參照前面動物模型的步驟，制備小鼠肝纖維化形成及恢復模型，收集了包括注射前正常小鼠的肝臟樣本，以及造模6周和9周的肝纖維化發病過程的肝臟樣本，還有停止注射后讓小鼠自我恢復6周和12周的肝臟樣本，將這些肝臟組織做成石蠟切片，進行Masson 染色，驗證肝纖維化的程度，如圖2，通過Masson染色，細胞核被蘇木精染成紫色，細胞質被麗春紅染成紅色，而纖維組織會被固綠染成綠色(圖2中箭頭所指部位)，從切片中可以看到，正常的肝臟組織很少有纖維化的存在(圖2-A)。而在造模6周后，在肝臟中的中央靜脈區開始出現纖維組織(圖2-B)，造模9周后，纖維組織不斷增多，并沿著中央靜脈區向四周擴散(圖2-C) 。停止CC14注射，讓肝臟自我恢復6周后，發現纖維組織逐漸減少，僅集中在中央靜脈區域(圖2-D)。當恢復到12周時，肝臟中幾乎沒有纖維組織(圖2-E)。從染色結果可以清楚地看到，所造模型符合小鼠肝纖維化的形成以及恢復整個過程。
采集不同時期的肝臟樣本，通過定量PCR驗證SlOO基因家族在肝纖維化的形成以及恢復過程的基因表達變化。選取了 SlOO家族中的五個成員——S100A4、S100A6、S100A8、 S100A9和S100A11作為定量PCR的目標基因。
結果如圖3。由圖中可以看到，隨著肝纖維化的發生，S100A4、S100A6、S100A8、 S100A9和S100A11這5個基因的轉錄水平都發生了明顯的升高，到第9周時達到最高值。 相比于正常肝臟，在第9周時，S100A4和S100A6均提高了 2倍多，S100A11提高了 3倍，而 S100A8和S100A9分別提高了 5倍和7倍。9周之后，隨著肝纖維化的恢復，5個基因的轉錄水平表現出很快的下降趨勢，到第15周時，其轉錄水平基本上與正常時的水平相當，僅 S100A4表達量仍高于正常肝臟，但也已經明顯下降。到第21周時，5個基因的轉錄水平基本回到了正常水平。
以上的結果基本與前期基因芯片的結果相吻合，SlOO家族的基因轉錄水平都是隨著肝纖維化的發生而提高，并隨著肝臟自身的恢復，表達量又恢復到正常水平。
2. 2不同程度的小鼠肝纖維化模型的SlOO家族基因表達變化
參照前面動物模型的步驟，通過向小鼠腹腔注射不同劑量的CC14，獲得不同程度的小鼠肝纖維化模型，將肝臟組織做成石蠟切片，進行Masson染色，驗證肝纖維化的程度， 計算出纖維化面積占肝臟面積的百分比，如圖4。注射O. 25mL/kg體重CC14劑量的小鼠肝臟，其纖維化占整個肝臟的3. 5%，注射O. 5mL/kg體重CC14劑量的小鼠肝臟，其纖維化占整個肝臟的6%，而注射lmL/kg體重CC14劑量的小鼠肝臟，其纖維化占到了整個肝臟的8%左右。
羥脯氨酸是合成膠原纖維的必需氨基酸，所以羥脯氨酸的含量能反應纖維合成的速度，在一定程度上表明肝纖維化的程度。因此，采用羥脯氨酸檢測試劑盒對肝臟中的羥脯氨酸進行了測定，發現隨著CC14注射劑量的增加，肝臟內羥脯氨酸的含量也隨之升高，注射lmL/kg體重CC14劑量時，肝臟內羥脯氨酸的含量能達到O. 5μ g/mg濕重，接近正常肝臟的2倍(圖5)。
在建立了 3種不同程度的小鼠肝纖維化模型之后，選取了 SlOO家族中的五個成員-S100A4、S100A6、S100A8、S100A9和S100A11作為定量PCR的目標基因，研究了在不同肝纖維化程度下，這些基因相對于對照組表達量的變化情況，結果如圖6，從定量PCR的結果可以看出，S100A4、S100A6、S100A8、S100A9和S100A11這5個基因的轉錄水平，都是隨著纖維化程度的加深而升高的。在O. 25mL/kg的CC14劑量下，5個基因相對于正常小鼠， 其轉錄水平的提高程度不是很明顯，僅僅提高了不到I倍的水平。而在O. 5mL/kg的CC14 劑量下，5個基因的表達都有很大幅度的提高，提高水平在3-5倍之間。在lmL/kg的CC14 劑量下，5個基因的表達水平均為4組中最大的。相比于正常小鼠，310(^4提高了3.5倍， S100A6提高了 3. 3倍，S100A11提高了 4倍，S100A8提高了 7倍，而S100A9提高得最多，提高了 8倍。
2. 3S100A6在肝臟中表達細胞的定位
在確定了 SlOO家族基因的表達與肝纖維化具有相關性之后，通過免疫組織化學染色來鑒定肝臟中SlOO家族蛋白表達的定位。選取了 SlOO家族中的S100A6蛋白作為研究對象，對正常小鼠和纖維化小鼠的肝臟進行免疫組織化學染色。通過染色，表達S100A6 的細胞會表現出深褐色，因此，如圖7，發現，相比于正常小鼠(圖7-A和C)，纖維化小鼠肝臟中S100A6的表達量更顯著(圖7-B和D)，這與定量PCR發現肝纖維化時期S100A6的表達高于正常小鼠相一致。另外，觀察發現S100A6的表達位置都集中在血管周圍發生纖維化的部位，并且存在于非實質細胞中(圖7-B和D，箭頭所指部位)，而在肝實質細胞中的表達卻不明顯。
2. 4肝纖維化病人的肝臟中S100A6免疫組織化學
從上海市第六人民醫院獲得了人的肝臟組織切片，包括了正常的肝組織(圖8-A) 以及肝纖維化的組織，通過Masson染色，可以看到患 有肝纖維化的肝臟中已經有大量的纖維組織(圖8-B)，證實病人已經進入肝硬化早期。通過對S100A6進行免疫組化，發現在正常的肝臟中，S100A6表達量同樣保持在很低的水平(圖8-C和E)，而在肝硬化早期的肝臟中， S100A6在血管區的纖維部位存在著大量表達(圖8-D和F，如圖中箭頭所示)，而且也集中在非實質細胞中，結果與采用CC14誘導的小鼠肝纖維化模型相一致，從而也說明了 CC14誘導的小鼠肝纖維化模型能較好的反映肝纖維化臨床的表現。
分別從肝纖維化的發病過程以及肝纖維化的嚴重程度兩個方面研究了 SlOO家族成員的轉錄變化，發現隨著肝纖維化的發生，Sioo家族成員的表達量顯著提高，而肝纖維化恢復時，SlOO的表達量又回到了正常水平。另外，SlOO家族成員的表達量還與肝纖維化的嚴重程度成正相關，即肝纖維化越嚴重，其表達量越高。由此說明了 Sioo家族成員與肝纖維化的發生有著重要的關系。
采用的是CC14誘導的小鼠肝纖維化模型，由于考慮其可能與肝纖維化臨床的發病機理存在著差異，因此通過免疫組化對人的肝臟切片進行研究比較，發現在肝硬化的早期，S100A6的表達量要顯著的高于正常肝臟，其結果與的CC14誘導的小鼠肝纖維化模型相一致，因此也表明了 CC14誘導的小鼠肝纖維化模型能較好的反映肝纖維化臨床的發病機理。
由于SlOO家族的基因是以簇狀排列在基因組中的，其轉錄調控的機理也較為相似，因此除了 S100A6，SlOO其它家族的成員也很可能在非實質細胞中表達。而肝星狀細胞更是直接與肝纖維化相關聯，因此預測SlOO家族的蛋白很可能直接作用于肝星狀細胞上。實施例3
S100A6在肝纖維化過程中的作用研究
3. lrhS100A6重組蛋白的肝纖維化動物實驗
小鼠肝纖維化模型與蛋白給藥方法
將雄性C57BL/6小鼠腹腔注射lmL/kg體重劑量的CC14溶液，連續注射11周，每周注射兩次，從第9周開始將小鼠分為兩組，一組為對照組，另一組為實驗組，實驗組的小鼠皮下注射O. 5mg/kg體重的rhS100A6,對照組注射相同體積的PBS,每天注射一次,連續三周；11周結束后采集外周血并獲取肝臟組織進行后續測試；
結果顯示
通過肝臟組織的石蠟切片進行Masson染色來分析肝纖維化的程度，另外，還對血清中的層粘連蛋白含量，肝組織中羥脯氨酸含量，以及肝組織中I型膠原的表達量等幾個反映肝纖維化的指標來對實驗后的小鼠肝纖維化程度進行評定。通過對肝臟組織的石蠟切片進行Masson染色，發現相對于正常的肝臟組織，對照組和實驗組都出現了比較明顯的肝纖維化，如圖9。對照組中，纖維化都集中于中央靜脈區，部分中央靜脈之間形成了纖維橋接(圖9-A和B)。相比于對照組，注射rhS100A6的小鼠，其纖維化程度要更加嚴重，中央靜脈區纖維化區域更厚(圖9-C和D，圖中箭頭所指部位)，而且中央靜脈之間幾乎都形成了纖維橋接，甚至在匯管區也出現了纖維化。利用NIS-Elements軟件統計了其中的肝纖維化面積，計算出纖維化面積占肝臟面積的百分比，如圖所示，對照組的肝纖維面積占肝臟組織面積的10%，而實驗組的肝纖維化面積達到了 16%，兩者具有顯著的差異(p〈0. 001 )，如圖10。
然后，采用放射性免疫試劑盒檢測了正常小鼠，注射PBS小鼠以及注射rhS100A6 小鼠這三組的血清中層粘連蛋白的含量。層粘連蛋白作為細胞外基質，在肝纖維化過程中會大量表達，其表達量的多少能反映出纖維化的程度。經過檢測發現注射了 rhS100A6的小鼠血清中的層粘連蛋白的含量為36. 9ngmL，高于對照組的24. 7ngmL(p<0. 05)，如圖11。因此從血清中層粘連蛋白含量這一指標來看，注射了 rhS100A6的小鼠其肝纖維化程度要高于對照組的小鼠。
如圖12，發現對照組的小鼠肝臟內羥脯氨酸的含量為O. 5 μ g/mg濕重，而注射rhS100A6的小鼠肝臟內羥脯氨酸的含量能達到O. 7 μ g/mg濕重，比對照組高出40% (p〈0. 001)，說明注射rhS100A6的小鼠肝臟內羥脯氨酸的合成明顯增多，也從一個側面反映了膠原合成的增多，纖維化更嚴重。
通過定量PCR，發現相比于正常的肝臟組織，PBS組的小鼠肝臟中Coll α I基因的表達量提高了 10倍左右，而注射rhS100A6的小鼠肝臟中Coll α I基因的表達量提高了超過16倍，如圖13，說明其Colla I的合成遠多于對照組(ρ〈0. 05)，也表明了其纖維化比對照組小鼠要嚴重。
從上面的實驗可以總結得出，通過對CC14肝纖維化造模的小鼠注射rhS100A6重組蛋白，會顯著加重肝纖維化的程度。
3. 2rhS100A6單獨誘導小鼠肝纖維化發生的動物實驗
雄性C57BL/6小鼠分為兩組，實驗組小鼠皮下注射O. 5mg/kg體重的S100A6，對照組注射相同體積的PBS，每天注射一次，連續三周；3周結束后，采集外周血并獲取肝臟組織進行后續測試。
結果
三周后，將小鼠的肝臟組織石蠟切片進行Masson染色，如圖14，發現無論是注射 PBS，還是rhS100A6，小鼠的肝臟并沒有出現顯著的肝纖維化，也沒有出現大量肝實質細胞的壞死。由此說明了 S100A6不能單獨誘導肝纖維化的發生，也并不能獨立地激活肝星狀細胞。結合之前CC14誘導的肝纖維化實驗中，S100A6對肝纖維化的加劇作用，表明S100A6很可能不是作用于肝星狀細胞激活的第一個階段，而可能是在第二個階段發揮作用，即維持肝星狀細胞的增殖。實施例4
S100A6對原代肝星狀細胞的作用
4. 1S100A6對原代肝星狀細胞的 細胞活力的影響
I)將原代肝星狀細胞接種在RPMI1640培養液(含10%FBS)中，分于96孔板，每孔 200 μ L, 5,000 個 / 孔；
2)培養24小時后，換含1%FBS的RPMI1640培養液培養24h ；
3)換含有不同濃度的S100A6的無血清RPMI1640培養液中，培養48h，對照加入等量的PBS ；
4)小心吸去上清，加入90 μ L新鮮RPMI1640培養液，再加入10 μ L CCK-8溶液，繼續培養4h ；
5)同時設置調零孔，每組設定6個復孔；
6)每半個小時在酶聯免疫檢測儀450nm處測量各孔的吸光值；
7)相對細胞活力的計算相對細胞話J) =* 100%,
結果將分離純化得到的原代肝星狀細胞培養在96孔細胞板中，在饑餓狀態下， 加入不同濃度的rhS100A6，培養兩天后用CCK-8試劑檢測細胞的活力，如圖15，發現在O.3 μ g/mL是rhS100A6對原代肝星狀細胞幾乎無影響，但是隨著rhS100A6劑量的增加，原代肝星狀細胞的活力也明顯增加，當rhS100A6濃度為I μ g/mL時，細胞活力提高了 20%，當 rhS100A6濃度提高到10 μ g/mL時，細胞活力提高了 80%，而當rhS100A6濃度在50 μ g/mL以上時，細胞活力提高了將近100%。由此可以看出，在體外，148/1^的1^10(^6就可以顯著提高肝星狀細胞的細胞活力，并隨著rhS100A6劑量的升高而提高，直至50 μ g/mL時達到飽和。
4. 2S100A6對原代肝星狀細胞的細胞周期的調控
I)將原代肝星狀細胞培養在6cm培養皿中；
2)培養24h后，換含1%FBS的RPMI1640培養液培養24小時；
3)換含有5 μ M S100A6的1%或3%FBS的RPMI1640培養液中，培養48小時，對照加入等量的PBS ；
4)用胰酶將原代肝星狀細胞消化下來，I，000rpm離心5min，去上清；
5)加 PBS 洗一次，I, OOOrpm 離心 5min,去上清；
6)用3mL PBS將細胞懸浮，逐滴加入到_20°C C預冷的7mL無水乙醇中，使乙醇終濃度為70%，放入-20°C C冰箱過夜，使細胞充分固定；
7)過夜后，I, OOOrpm離心5min,去上清；
8)加入PI染色液，室溫避光處理30min ；
9)用 PBS 洗一次，I, OOOrpm 離心 5min,去上清；
10)加入500 μ L PBS，充分懸浮細胞，轉入到流式管中，進行流式分析。
結果通過流式細胞儀對細胞的周期進行分析，發現在1%FBS培養條件下，對照組 Gl期的細胞數量占88. 4%，多于培養液中加入rhS100A6蛋白的細胞的83. 9%。對照組S期的細胞數量占8. 6%，G2期數量只有3%，而培養液中加入rhS100A6蛋白的細胞(圖·16-A)， S期數量占8. 9%，G2期更是數量增加到7. 2% (圖16B)，對比S期和M期細胞的數量，說明 rhS100A6能促進DNA合成和細胞增殖。在3%FBS培養條件下，對照組Gl期的細胞數量占 75. 1%，同樣多于培養液中加入rhS100A6蛋白的細胞的70. 5%，對照組S期的細胞數量占 18.4%，G2期數量為6.5% (圖16C)，而培養液中加入rhS100A6蛋白的細胞，其S期數量為8.8%，相比對照組要少，但是G2期數量卻增加到了 20. 7% (圖16D)。由此可以得出，在沒有外界的刺激下，1%FBS培養條件下，對照組的細胞較多的處于Gl期，很少進行DNA合成。而在3%FBS培養條件下，對照組的細胞雖有部分進行DNA合成，但大多都處于S期。而培養液中加入rhS100A6，不僅能刺激細胞從Gl期進入到S期，還能從S期進入G2期，因此說明 S100A6具有加快肝星狀細胞的細胞周期的作用。(圖16流式細胞分析rhS100A6對原代肝星狀細胞的細胞周期的影響。1%FBS條件下加入PBS (A)或rhS100A6 (B)，3%FBS條件下加入 PBS (C)或 rhS100A6 (D))。實施例5
SlOO家族蛋白活性抑制劑的篩選
已知SlOO家族蛋白通過結合到表達RAGE受體的細胞，從而誘發細胞內的信號通路，而sRAGE是體內RAGE配體的天然拮抗劑。在前面的實驗中發現SlOO家族與肝纖維化的發生有著明顯的相關性，通過S100A6的動物實驗也證明了 S100A6能刺激肝星狀細胞的增殖，導致肝纖維化的加重。因此，計劃采用sRAGE作為體內RAGE的天然的拮抗劑這一特性，來拮抗S100A6的對于RAGE的激活作用。另外，SlOO家族其它成員也是以RAGE為受體， 同樣很可能在肝纖維化過程通過RAGE來刺激肝星狀細胞，因次通過sRAGE能起到多方面的拮抗作用。由于人和小鼠的SlOO家族蛋白的相似度在85%以上，sRAGE的相似度為80%，而人和小鼠在RAGE其它配體的相似度上卻比較低，因此選擇采用人的sRAGE作為小鼠肝纖維化治療的藥物，第一，人的sRAGE同樣與有著高相似度的小鼠SlOO家族蛋白有較高的親和性，第二，可以避免人的sRAGE與小鼠RAGE其它配體的結合，避免產生更多的干擾。
將SH-SY5Y細胞(人神經母細胞瘤細胞)接種在96孔細胞板里，在無血清的條件下，對細胞進行饑餓培養，誘導細胞凋亡，在加入50 μ g/mL rhS100A6的基礎上，同時加入不同濃度的rhsRAGE，培養兩天后，用CCK-8試劑盒對細胞活力進行測定。
結果發現10μ g/mL rhsRAGE都能顯著抑制rhS100A6促進細胞凋亡的作用，而且相比于PBS對照，細胞的活力還有顯著的提高，如圖17。在濃度達到50 μ g/mL時，相比對照都能將細胞活力提高80%。
所述的人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y細胞購自上海市岳陽路320號中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，用含20%的胎牛血清和10%的DMSO的RPMI1640培養液懸浮后保存在液氣中。實施例6
sRAGE治療肝纖維化的作用
通過腹腔注射CC14，連續11周，誘導小鼠的肝纖維化，從第9周開始將小鼠分為 5組,每組10只,其中4組為實驗組,每天皮下分別注射O. 5mg/kg體重和1. 5mg/kg體重的 rhsRAGE，連續注射3周。另外一組為對照組，每天皮下注射相同體積的PBS。實驗結束后， 獲取5組小鼠的肝臟組織和血清。通過采用肝臟組織的石蠟切片進行Masson染色來分析肝纖維化的程度，另外，還檢測了肝組織中羥脯氨酸含量，以及肝組織中I型膠原，III型膠原的表達量等幾個反映肝纖維化的指標，對實驗后的小鼠肝纖維化程度進行了評定。
結果通過對肝臟組織的石蠟切片進行Masson染色，如圖18，發現對照組小鼠的肝臟在中央靜脈區形成了比較明顯的肝纖維化，中央靜脈之間形成了纖維橋接(圖18A和 B)。注射rhsRAGE的小鼠，在O. 5mg/kg體重劑量時，與對照小鼠沒有顯著的差異(圖18C和 D)，而在1. 5mg/kg體重劑量時，發現其纖維化程度有一定程度的減輕，在中央靜脈區的纖維組織區域相對較小，侵入到組織中的纖維也較少(圖18E和F)。利用NIS-Elements軟件統計了其中的肝纖維化面積，計算出纖維化面積占肝臟面積的百分比，如圖19所示，對照組的肝纖維面積占肝臟組織面積的9. 6%，注射O. 5mg/kg體重的rhsRAGE的小鼠，其纖維化面積占肝臟面積的7. 8%，雖然比對照略有降低，但同樣在統計學上沒有顯著差異。而注射1.5mg/kg體重的rhsRAGE的小鼠,其纖維化面積占肝臟面積的7. 1%,相比對照組下降了約 25%,通過統計學檢驗,與對照組小鼠存在顯著的差 異(p〈0. 01),從而說明1. 5mg/kg體重的 rhsRAGE能顯著地減輕肝纖維化。
再利用羥脯氨酸檢測試劑盒對肝臟中的羥脯氨酸進行了測定，如圖20，發現對照組的小鼠肝臟內輕脯氨酸的含量為O. 4 μ g/mg濕重,而注射O. 5mg/kg體重的和1. 5mg/kg 體重的rhsRAGE的小鼠肝臟內羥脯氨酸的含量分別為O. 30和O. 29 μ g/mg濕重，在統計學上與對照組相比均有顯著的差異，說明注射了 rhsRAGE的小鼠肝臟內羥脯氨酸的合成明顯減少，也從一個側面反映了膠原合成的減少，表明其肝纖維化程度相比對照組要輕。
又采用定量PCR的方法檢測了肝臟組織中I型膠原Colla I和III型膠原Col3a I 兩個基因的表達量變化。如圖21，發現相比于對照組，注射1. 5mg/kg體重劑量的rhsRAGE 小鼠其肝臟中Coll a I和Col3 a I兩個基因相比對照組都有明顯的下降，Coll a I基因的表達量下降了 55%，Col3a I基因的表達量下降了 40%，因此說明了注射1. 5mg/kg體重劑量的rhsRAGE能顯著降低肝臟中I型和III型膠原的表達量。
從以上的實驗可以看出，通過對CC14造模的肝纖維化小鼠注射rhsRAGE重組蛋白，來拮抗小鼠體內的RAGE配體，特別是SlOO家族蛋白，發現r rhsRAGE2卻具有明顯降低小鼠肝纖維化的療效，尤其當rhsRAGE的劑量達到1. 5mg/kg體重時，能顯著減輕小鼠肝纖維化的程度。
上述實施例中部分技術操作信息為本領域技術人員的常規認知，實踐者可參看有關細胞生物學、組織結構學以及胚胎學的標準的教科書及評論。包括Teratocarcinomas and embryonic stem cell A practical approach[E. J. Robertson 編，IRL 出版有限公司，1987] ；Guide to techniques in 小鼠 Development [P. M. Wasserman 等編，學術出版社，1993] ；Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro [Μ. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225 900,1993] !Properties and uses of Embryonic Stem Cells Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy[P. D. Rathjen等，Reprod. Fertil. Dev. 10 31,1998]。
細胞生物學、蛋白質化學、和抗體技術可以在“蛋白科學中的當前方案” [J. E. Colligan等編輯，ffiley&Sons]、“細胞生物學中的當前方案” [J. S. Bonifacino等， ffiley&Sons]和“兔疫學功時當亦方案” [J. E. Colligan等編輯，ffiley&Sons]中找到。與本發明相關的試劑、克隆載體、和基因操作試劑盒可從商業供應商那得到，例如BioRad、 Stratagene> Invitrogen、ClonTech 以及 sigma-AIdrich 公司。
細胞培養方法通常在“動物細胞培養基本技術手冊”最新版本(R.1. Freshney編輯，Wiley&Sons); “細胞培養一般技術”(M. A. Harrison和1. F. Rae，劍橋大學出版);和“胚胎干細胞方法和操作規定” (K. Turksen編輯，Humana出版)中有描 述。組織培養基和試劑可從商業供應商那得到，例如 Gibco/BRL、Nalgene-Nunc International、Sigma Chemical Co.、以及 ICN Biomedicals。
權利要求
1.一種SlOO家族蛋白的應用，其特征在于，將SlOO家族蛋白作為藥靶分子用于篩選肝纖維化治療藥物。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征是，所述的SlOO家族蛋白包括S100A4、S100A6、 S100A7、S100A8、S100A9、S100A11、S100B、S100P。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征是，所述的SlOO家族蛋白為S100A4、S100A6、 S100A8、S100A9 或 S100A11 中之一。
4.根據權利要求1所述的應用，其特征是，所述的SlOO家族蛋白為S100A6蛋白及其突變體，其功能性活性片段或其類似物。
5.根據權利要求2或3或4所述的應用，其特征是，所述的S100A6蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1 所示。
6.根據權利要求1所述的應用，其特征是，所述的篩選肝纖維化治療藥物是指將經過饑餓培養的細胞中加入所述Sioo家族蛋白后，施加肝纖維化治療藥物并培養后根據細胞活力進行藥物篩選，獲得活性化合物。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征是，所述的饑餓培養是指將細胞接種在96孔細胞板里，在無血清的條件下培養，誘導細胞凋亡。
8.根據權利要求1或6所述的應用，其特征是，所述的SlOO家族蛋白的用量為50μ g/mL
9.根據權利要求6所述的應用，其特征是，所述的施加肝纖維化治療藥物是指在加入 SlOO家族蛋白的同時加入不同濃度的待篩選化合物并培養兩天。
10.一種sRAGE蛋白的應用，其特征在于，用于制備肝纖維化治療藥物。
11.根據權利要求10所述的應用，其特征是，所述的sRAGE蛋白，即可溶性晚期糖基化終產物受體的胞外區，sRAGE通過與外周系統中的RAGE配體相結合，導致這些配體無法與膜上的正常RAGE受體相結合，從而起到了阻斷配體的刺激作用。
12.根據權利要求10或11所述的應用，其特征是，所述的sRAGE蛋白是指hsRAGE及其突變體；其功能性活性片段或其類似物；具有高度同源性的同系物以及編碼包含SEQ ID NO. 2描述的氨基酸序列的蛋白質的載體。
13.根據權利要求10或11所述的應用，其特征是，所述的sRAGE蛋白，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
14.一種藥物組合物，其特征在于，包含作為活性成分的，如權利要求13-17中任一所述的sRAGE蛋白以及載體或賦形劑。
15.根據權利要求14所述的組合物，其特征是，所述的藥物組合物的劑型包括片劑、 膠囊、散劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液劑、口服液、醑劑、酊劑、氣霧劑、粉霧劑、注射劑、注射用無菌粉末或栓劑。
16.根據權利要求14所述的組合物，其特征是，所述的藥物組合物的劑型為固態組合物。
17.根據權利要求14所述的組合物，其特征是，所述的藥物組合物的劑型為凍干粉針劑。
18.根據權利要求14所述的組合物，其特征是，所述的載體是指用于將本發明的融合體蛋白傳送給動物或人的藥學上或食品上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。
全文摘要
一種生物醫藥技術領域的S100家族蛋白的應用，將S100家族蛋白作為藥靶分子用于篩選肝纖維化治療藥物；具體通過按照高通量藥物篩選的方法和步驟，通過評價待篩選化合物拮抗S100家族蛋白生物活性，經過初篩、復篩、深入篩選、確定篩選等步驟，獲得活性先導化合物。本發明為治療肝纖維化提供了更多的作用靶點，以篩選肝纖維化治療藥物。
文檔編號A61K38/17GK103031359SQ201210579728
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月27日 優先權日2012年12月27日
發明者俞雁, 韓偉, 何虹霖 申請人:上海交通大學