專利名稱：殼寡糖/細菌纖維素海綿的制備方法
技術領域：
本發明涉及的是一種創傷敷料技術領域的方法，具體是一種在木醋桿菌培養基中添加殼聚糖制備吸水性和透濕性更佳、凝血效果更好、生物相容好的殼寡糖/細菌纖維素海綿的方法。
背景技術：
在生物醫學領域，細菌纖維素由于其獨特的生物相容性和生物適應性以及高的持水性和結晶度，在人工血管、醫用敷料及組織工程支架的研究越來越多，被認為是目前世界上性能最好的纖維素，因而成為近年來國際上新型生物醫學材料的研究熱點。殼寡糖具有良好的水溶性，易被人體吸收，使殼寡糖展現出更獨特的功能特性和生理活性。殼寡糖具有抗氧化和抑菌性等多種獨特的生理功效。此外，殼寡糖還具有良好 的吸水性和透濕性。近年來，殼寡糖作為一種新型的功能性低聚糖，不斷引起世界各國研究者的濃厚興趣。傳統的創傷敷料往往不能兼具吸水性、透濕性、凝血效果和生物相容性都好的特點，因而其應用受到了限制。經過對現有技術的檢索發現，中國專利文獻號101288778，
公開日2008_10_22，該技術通過將細菌纖維素水凝膠與冰晶充分混合，在-20 _50°C下進行預凍并制成均相分散體系，利用冷凍干燥法制備出細菌纖維素海綿。海綿不良的透濕效果限制了其在臨床上的應用。進一步檢索發現，中國專利文獻號CN202005908，
公開日2011_10_12，記載了一種“細菌纖維素膜創可貼”，該專利采用的技術路線是底層為膠布層，膠布層中間粘貼表面上粘貼細菌纖維素膜，細菌纖維素膜上面為覆蓋面膜，膠布層兩端粘貼表面上有保護膜，覆蓋面膜與膠布層對應部位開有透氣孔。其缺點是工藝復雜，吸水性和凝血效果達不到要求。

發明內容
本發明的目的是提供了一種呈三維網狀結構，孔隙率高，孔隙致密均勻、吸水性和透濕性更佳，凝血效果更好的殼寡糖/細菌纖維素海綿。為了實現上述目的，本發明的技術方案為提供殼寡糖/細菌纖維素海綿的制備方法，其特征在于包括以下步驟(I)木醋桿菌的活化活化培養基成分葡萄糖3% w/v,蛋白胨O. 75% w/v,酵母粉1% w/v，磷酸氫二鈉 O. 75% w/v，檸檬酸 O. 05% w/v ;培養基 pH 5. O ;30°C培養 24h ；(2)添加殼寡糖活化后的木醋桿菌菌種接種到培養基上30°C培養7天，得殼寡糖-細菌纖維素復合物；培養基成分包括殼寡糖、葡萄糖、蛋白胨O. 75% w/v、酵母粉1% w/V、磷酸二氫納O. 75% w/v、朽1檬酸O. 05% w/v,殼寡糖與葡萄糖含量比例為0. 5:2. 5 2:1%w/v ；(3)將殼寡糖-細菌纖維素復合物，經蒸餾水漂洗，1%氫氧化鈉溶液煮沸4h，室溫O. 5%乙酸浸泡O. 5h，蒸餾水沖洗5次后進行冷凍干燥，得殼寡糖-細菌纖維素海綿。所述步驟(2)的培養方式是靜置培養。所述木醋桿菌菌種是細菌纖維素高產菌Ax HN001。所述步驟(3)的冷凍干燥時間是48小時。采用MTT法檢測木醋桿菌的生長周期，篩選出活力最佳時期的木醋桿菌。所述的MTT法是經過因素篩選的MTT法。所述的篩選因素是MTT劑量、離心力和作用時間。
所述的篩選方法是正交試驗。所述的檢測波長是570nm。本發明制備得到的殼寡糖-細菌纖維素海綿呈三維網狀結構，孔隙率高，孔隙致密均勻。經實驗證實，與傳統創傷敷料相比，殼寡糖-細菌纖維素海綿的吸水性和透濕性更佳，凝血效果更好，生物相容性檢測的細胞毒性為O級，同時原料便宜易得，制備工藝簡單。本發明所制備的殼寡糖-細菌纖維素海綿易于實現工業化生產且生物相容性好，在生物醫用材料領域將有著廣泛的應用。


圖1細菌纖維素和殼寡糖/細菌纖維素表面的SEM示意圖；a :細菌纖維素，b_d 殼寡糖的添加量(w/v%)分別為O. 5%、1%和2% ；圖2細菌纖維素和殼寡糖-細菌纖維素橫截面的SEM示意圖；a :細菌纖維素，b_d 殼寡糖的添加量(w/v%)分別為O. 5%、1%和2% ；圖3細菌纖維素和殼寡糖/細菌纖維素對3T3細胞生長的增值抑制示意圖^Ctl 細菌纖維素，BC1' BC2和BC3 :殼寡糖的添加量(w/v%)分別為O. 5%、1%和2% ；圖4細菌纖維素和殼寡糖/細菌纖維素對金黃色葡萄糖球菌的抑菌圈直徑(平均值)；(Benzylpenicillin Sodium 簡寫 B. Sodium);Β· Sodium :青霉素,BCtl :細菌纖維素，BC1' BC2和BC3 :殼寡糖的添加量(w/v%)分別為O. 5%、1%和2%;圖5細菌纖維素和殼寡糖/細菌纖維素對綠膿桿菌的抑菌圈直徑(平均值);B. Sodium :青霉素，BCtl :細菌纖維素，BQ、BC2和BC3 :殼寡糖的添加量(w/v%)分別為O. 5%、1% 和 2% ；圖6細菌纖維素和殼寡糖/細菌纖維素促凝血性能隨時間的變化ACtl :細菌纖維素,BC1, BC2和BC3:殼寡糖的添加量(w/v%)分別為O. 5%、1%和2%。
具體實施例方式實例1:取木醋桿菌細胞培養液，8000 g離心，棄上清，沉淀用PBS洗滌，離心棄上清，加入40 μ I O. 5 mg/ml的MTT，30°C孵育lh，每組4個平行樣本，在570nm處采用酶標儀測定OD57tl值，求平均值；測得OD值為O. 2191。實例2:取木醋桿菌細胞培養液，8000 g離心，棄上清，沉淀用PBS洗滌，離心棄上清，加入40 μ I O. 5 mg/ml的MTT，30°C孵育2h，每組4個平行樣本，在570nm處采用酶標儀測定OD57tl值，求平均值；測得OD值為O. 2412。實例3:取木醋桿菌細胞培養液，8000 g離心，棄上清，沉淀用PBS洗滌，離心棄上清，加入40 μ I O. 5 mg/ml的MTT，30°C孵育3h，每組4個平行樣本，在570nm處采用酶標儀測定OD570值，求平均值；測得OD值為O. 3188。實例4:取木醋桿菌細胞培養液，8000 g離心，棄上清，沉淀用PBS洗滌，離心棄上清，加入40 μ I O. 5 mg/ml的MTT，30°C孵育4h，每組4個平行樣本，在570nm處采用酶標儀測定OD57tl值，求平均值；測得OD值為O. 4717。實例5:取木醋桿菌細胞培養液，8000 g離心，棄上清，沉淀用PBS洗滌，離心棄上清，加入40 μ I O. 5 mg/ml的MTT，30°C孵育5h，每組4個平行樣本，在570nm處采用酶標儀測定OD57tl值，求平均值；測得OD值為O. 4705。實例6 :取木醋桿菌細胞培養液，在離心力為5000g離心，棄上清，PBS洗滌，離心棄上清加入40 μ I O. 5 mg/ml的MTT，30°C孵育4 h，每組4個平行樣本，在570 nm處采用酶標儀測定OD57tl值，求平均值；測得OD值為O. 1232。實例7 :取木醋桿菌細胞培養液，在離心力為6000g離心，棄上清，PBS洗滌，離心棄上清加入40 μ I O. 5 mg/ml的MTT，30°C孵育4 h，每組4個平行樣本，在570 nm處采用酶標儀測定OD57tl值，求平均值；測得OD值為O. 1438。實例8 :取木醋桿菌細胞培養液，在離心力為7000g離心，棄上清，PBS洗滌，離心棄上清加入40 μ I O. 5 mg/ml的MTT，30°C孵育4 h，每組4個平行樣本，在570 nm處采用酶標儀測定OD57tl值，求平均值；測得OD值為O. 3382。實例9 :取木醋桿菌細胞培養液，在離心力為8000g離心，棄上清，PBS洗滌，離心棄上清加入40 μ I O. 5 mg/ml的MTT，30°C孵育4 h，每組4個平行樣本，在570 nm處采用酶標儀測定OD57tl值，求平均值；測得OD值為O. 4607。實例10 :取木醋桿菌細胞培養液，在離心力為9000 g離心，棄上清，PBS洗漆，離心棄上清加入40 μ I 0.5 mg/ml的MTT，30°C孵育4 h，每組4個平行樣本，在570 nm處采用酶標儀測定OD57tl值，求平均值；測得OD值為O. 4603。實例11 :取木醋桿菌細胞培養液，8000 g離心一定時間，棄上清，沉淀用PBS洗滌，離心棄上清加入10 μ I O. 5 mg/ml的MTT, 30°C孵育4 h,每組4個平行樣本,在570 nm處采用酶標儀測定OD57tl值，求平均值；測得OD值為O. 1833。實例12 :取木醋桿菌細胞培養液，8000 g離心一定時間，棄上清，沉淀用PBS洗滌，離心棄上清加入20μ1 O. 5 mg/ml的MTT，30°C孵育4 h，每組4個平行樣本，在570 nm處采用酶標儀測定OD57tl值，求平均值；測得OD值為O. 2497。實例13 :取木醋桿菌細胞培養液，8000 g離心一定時間，棄上清，沉淀用PBS洗滌，離心棄上清加入30μ1 O. 5 mg/ml的MTT，30°C孵育4 h，每組4個平行樣本，在570 nm處采用酶標儀測定OD57tl值，求平均值；測得OD值為O. 4753。實例14 :取木醋桿菌細胞培養液，8000 g離心一定時間，棄上清，沉淀用PBS洗滌，離心棄上清加入40 μ I O. 5 mg/ml的MTT, 30°C孵育4 h,每組4個平行樣本,在570 nm處采用酶標儀測定OD57tl值，求平均值；測得OD值為O. 4751。實例15 :取木醋桿菌細胞培養液，8000 g離心一定時間，棄上清，沉淀用PBS洗滌，離心棄上清加入50μ1 O. 5 mg/ml的MTT，30°C孵育4 h，每組4個平行樣本，在570 nm處采用酶標儀測定OD57tl值，求平均值；測得OD值為O. 4752。實例16 :配制培養基Mtl (w/v%):殼寡糖O、葡萄糖3、蛋白胨O. 75、酵母粉1、磷酸二氫納O. 75、檸檬酸O. 05 ;以木醋桿菌為生產菌，挑取活化好的菌種接入種子培養基，30°C培養3d，以6%的接種量接入150mL的M1培養基，30°C培養7天。取樣經蒸餾水漂洗，1%氫氧化鈉溶液煮沸4h,室溫O. 5%乙酸浸泡O. 5h,蒸懼水沖洗5次。采用冷凍干燥法干燥得到BCtl海綿樣品。實例17 :配制培養基M1 (w/v%):殼寡糖O. 5、葡萄糖2. 5、蛋白胨O. 75、酵母粉1、磷酸二氫納O. 75、檸檬酸O. 05 ；以木醋桿菌為生產菌，挑取活化好的菌種接入種子培養基，30°C培養3d，以6%的接種量接入150mL的M1培養基，30°C培養7天。取樣經蒸餾水漂洗，1%氫氧化鈉溶液煮沸4h,室溫O. 5%乙酸浸泡O. 5h,蒸懼水沖洗5次。采用冷凍干燥法干燥得到BC1海綿樣品。實例18 :配制培養基M2 (w/v%):殼寡糖1、葡萄糖2、蛋白胨O. 75、酵母粉1、磷酸 二氫納O. 75、檸檬酸O. 05 ;以木醋桿菌為生產菌，挑取活化好的菌種接入種子培養基，30°C培養3d，以6%的接種量接入150mL的M2培養基，30°C培養7天。取樣經蒸餾水漂洗，1%氫氧化鈉溶液煮沸4h,室溫O. 5%乙酸浸泡O. 5h,蒸懼水沖洗5次。采用冷凍干燥法干燥得到BC2海綿樣品。實例19 :配制培養基M3 (w/v%):殼寡糖2、葡萄糖1、蛋白胨O. 75、酵母粉1、磷酸二氫納O. 75、檸檬酸O. 05 ;以木醋桿菌為生產菌，挑取活化好的菌種接入種子培養基，30°C培養3d，以6%的接種量接入150mL的M3培養基，30°C培養7天。取樣經蒸餾水漂洗，1%氫氧化鈉溶液煮沸4h,室溫O. 5%乙酸浸泡O. 5h,蒸懼水沖洗5次。采用冷凍干燥法干燥得到BC3海綿樣品。實例20 :配制培養基M4 (w/v%):殼寡糖3、葡萄糖O、蛋白胨O. 75、酵母粉1、磷酸二氫納O. 75、檸檬酸O. 05 ;以木醋桿菌為生產菌，挑取活化好的菌種接入種子培養基，30°C培養3d，以6%的接種量接入150mL的M4培養基，30°C培養7天。結果無產物生成。1、殼寡糖一細菌纖維素海綿的微觀結構由圖1可以看出，與BCtl的網狀結構相比較，BCp BCjP BC3海綿表面具有相互連通的孔隙，三維網狀結構致密，大孔壁間還具有小孔，孔隙率高、孔隙致密均勻，并且隨著殼寡糖量的增加孔徑是先變小后變大。由圖1還可以看出未經殼寡糖改性的細菌纖維素BCci的纖維網狀結構疏松，纖維絲帶纏繞不緊密，BC1和BC2纖維絲帶纏繞緊密，纖維絲帶寬度比BCtl大，網孔比BCtl密集，BC3和BC1相似。由圖可以看出在木醋桿菌培養體系中加入殼寡糖改變了細菌纖維素的物理結構。圖2細菌纖維素和殼寡糖-細菌纖維素橫截面的SHM示意圖；a :細菌纖維素，b-d :殼寡糖的添加量(w/v%)分別為O. 5%、1%和2%。2、殼寡糖改變細菌纖維素的滲透性由于細菌纖維素具有三維網狀結構，存在分子間孔隙，故細菌纖維素不能阻擋住氣體和蒸汽分子的滲透。表2-1結果顯示細菌纖維素海綿BCtl和改性細菌纖維素海綿BCpBC2和BC3的透濕性小于醫用紗布，且BC3和醫用紗布之間存在組間顯著性差異(p〈0. 05)，BC2與醫用紗布的透濕率相差不大。表2-1殼寡糖對細菌纖維素透濕性的影響(i ± , ,n=5)Tab. 2~1 The effect of chitosan on the permeability of bacterialcellulose (n=5，7士 λ )
權利要求
1.殼寡糖/細菌纖維素海綿的制備方法，其特征在于包括以下步驟 (1)木醋桿菌的活化活化培養基成分葡萄糖3%w/v，蛋白胨O. 75% w/v,酵母粉1%w/v，磷酸氫二鈉 O. 75% w/v，檸檬酸 O. 05% w/v ;培養基 pH 5. O ;30°C培養 24h ； (2)添加殼寡糖活化后的木醋桿菌菌種接種到培養基上30°C培養7天，得殼寡糖-細菌纖維素復合物；培養基成分包括殼寡糖、葡萄糖、蛋白胨O. 75% w/v、酵母粉1% w/v、磷酸二氫納O. 75% w/v、梓檬酸O. 05% w/v,殼寡糖與葡萄糖含量比例為:0. 5:2. 5 2:1% w/v ； (3)將殼寡糖-細菌纖維素復合物，經蒸餾水漂洗，1%氫氧化鈉溶液煮沸4h，室溫O.5%乙酸浸泡O. 5h，蒸餾水沖洗5次后進行冷凍干燥，得殼寡糖/細菌纖維素海綿。
2.如權利要求1所述的殼寡糖/細菌纖維素海綿的制備方法，其特征在于所述步驟(2)的培養方式是靜置培養。
3.如權利要求1所述的殼寡糖/細菌纖維素海綿的制備方法，其特征在于所述木醋桿菌菌種是細菌纖維素高產菌Ax HN001。
4.如權利要求1所述的殼寡糖/細菌纖維素海綿的制備方法，其特征在于所述步驟(3)的冷凍干燥時間是48小時。
全文摘要
本發明公開了一種殼寡糖/細菌纖維素海綿的制備方法，通過MTT法篩選出活力最佳時期的木醋桿菌，然后在培養體系中添加殼寡糖制備殼寡糖/細菌纖維素復合物，經蒸餾水漂洗，1%氫氧化鈉溶液煮沸4h，室溫0.5%乙酸浸泡0.5h，蒸餾水沖洗5次后進行冷凍干燥制備殼寡糖/細菌纖維素海綿。本發明制備得到的殼寡糖/細菌纖維素海綿呈三維網狀結構，孔隙率高，空隙致密均勻。經實驗證實，與傳統創傷敷料相比，殼寡糖/細菌纖維素海綿的吸水性和透濕性更佳，凝血效果更好，生物相容性檢測的細胞毒性為0級，同時原料便宜易得，制備工藝簡單。本發明所制備的殼寡糖-細菌纖維素海綿易于實現工業化生產且生物相容性好，在生物醫用材料領域將有著廣泛的應用。
文檔編號A61L15/28GK103007335SQ20121057969
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者曹獻英, 陳勝杰, 操鳳, 鄭育聲, 杜杰, 陳歡 申請人:海南大學