專利名稱：一種具有溫敏開關的生長因子控釋微球及其制備方法
技術領域：
本發明涉及藥物控釋領域，尤其涉及一種具有溫敏開關的生長因子控釋微球及其制備方法，該具有溫敏開關的生長因子控釋微球應用于牙科。
背景技術：
牙周炎是世界范圍內慢性炎癥性疾病，是人類口腔健康的“頭號殺手”，并與心血管疾病、糖尿病等全身疾病的發病密切相關。牙周炎導致的牙周組織缺損是成人牙齒喪失的主要原因。傳統牙周治療如潔/刮治術、翻瓣術等雖然在一定程度上控制了牙周炎癥的進一步發展和牙周支持組織的進一步喪失，卻不能使喪失的牙周組織獲得良好的再生；牙周骨移植、引導組織再生和引導骨再生技術的廣泛開展和臨床應用，大大提高了牙周病治療的臨床療效，但在恢復牙周組織的生理結構和功能上遠未達到所期望的目標。近年來，干細胞生物學和組織工程研究取·得了突飛猛進的發展，利用干細胞治療結合組織工程的原理、技術和方法促進牙周組織再生的研究正引起越來越廣泛的重視和關注，并日益成為牙周再生研究的重點和核心。然而，利用體外培養的(干)細胞，通過組織工程、基因工程手段實現牙周組織再生還停留在實驗室研究階段，離真正的臨床應用還有較遠的距離；這是由于圍繞干細胞治療、基因治療的臨床轉化還有很多“瓶頸”問題沒有得到根本解決。最近研究表明，機體干細胞龕中的干細胞在一定條件下可以參與多種組織創傷的修復過程，實現內源性組織再生(endogenous tissueregeneration)。因此,刺激和增強機體自我修復創傷的能力，募·集機體內源性干細胞促進牙周組織再生具有重要臨床意義，可以加速臨床轉化。外源性高效生物活性因子作為一種有效的治療工具，在一定程度上可以激發機體組織自我修復再生的潛能，實現內源性牙周組織再生。牙周組織具有復雜的生理結構和功能，至少涉及到牙槽骨、牙周膜和牙骨質三種完全不同的組織，是組織再生研究領域的難點，因此牙周缺損可以作為模型缺損用于再生策略研究從而為多種組織缺損修復提供經驗。多種生長因子在牙周組織修復再生過程中起到的關鍵作用已經引起了廣泛關注，研究表明不同生長因子可以調節牙周相關細胞的增殖、趨化、分化和細胞外基質的生物合成，能明顯促進牙周組織的再生和修復。骨形態發生蛋白(BMP)-2在動物實驗和臨床應用中均顯示出良好的促進牙周及骨組織再生的潛能。但外源性生長因子價格昂貴、半衰期短，局部使用很快被稀釋和代謝，或因體內生物酶降解作用而失活；因此，只有借助合適的載體/緩釋系統才能使生長因子在組織缺損局部持續高效發揮作用，更好地促進組織再生。實際上，生長因子緩/控釋系統的研制與開發已經成為再生醫學特別是內源性再生醫學研究領域的重要研究內容之一。生長因子載體與緩/控釋系統可以避免生長因子在體內被組織液稀釋、代謝或因酶的降解而失活；同時借助緩/控釋系統也可以使活性因子向缺損組織定位、持續釋放，極大刺激缺損區域組織自身的修復再生潛能。生長因子與多種支架材料直接復合后，雖然可以取得比單純支架好的效果，但這種簡單復合(add-on或absorb-1n)不能實現生長因子的生物緩釋，只有借助緩釋系統的作用，才有望實現良好的組織再生。發明人認為，天然生物材料微球生長因子緩釋系統，具有傳統緩釋載體無與倫比的優良性能，主要包括微球結構可以保護藥物免受外界環境的破壞，將不可混合的多種藥物隔離，使不同類的材料具有良好的親和性；可以通過制備工藝改變，調節微球系統的釋藥性能；生物相容性好，在生物體內易吸收、易游走；穩定性好，易功能化，制備簡單；同時微載體可以進行體外釋藥的動態觀察研究，根據不同需要制備具有不同釋藥效能的緩釋系統，從而適應不同組織再生的要求。

發明內容
有鑒于此，本發明的目的在于利用純天然材料，提供一種具有溫敏開關的生長因子控釋微球的材料配方和相應制備方法、以及具有溫敏開關的生長因子控釋微球制劑和相應制備方法。為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案予以實現。技術方案一一種具有溫敏開關的生長因子控釋微球，其特征在于，包含骨形態發生蛋白_2、重均分子量為100-105kDa的甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐、重均分子量為IOOkDa的明膠、重均分子量為17kDa聚丙基丙烯酰胺，以及助溶劑、乳化劑和穩定劑。上述技術方案的特點和進一步改進在于優選地，所述骨形態發生蛋白-2、甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐、明膠和聚丙基丙烯酰胺的質量比為(O. 8-1. 2) (1. 8X 104-2. 2X 104) :(1. 2X IO4-L 8X IO4)(2. 4Χ103-3· 6X10 3)。優選地，所述助溶劑包含磷酸鹽緩沖液；所述乳化劑包含體積比為(2-4) :1的二氯甲烷和丙酮混合溶劑；所述穩定劑包含重均分子量為40-60kDa的海藻酸鈉。更優選地，磷酸鹽緩沖溶液的PH值為7. 1-7.3 ;乳化劑也可選自二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、二氧六環、丙酮、四氫呋喃、冰醋酸、苯、甲苯中的一種或兩者以上的混合物。優選地，所述甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐中，右旋糖酐分子量為37-39. 6kDa，甲基丙烯酸縮水甘油酯和右旋糖酐的聚合比例為1:(80-120);所述甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐、明膠和聚丙基丙烯酰胺的聚合比例為1:(0. 6-1. 2) (0. 05-0. 09)。優選地，所述生長因子控釋微球的平均粒徑為5. 9-21. 5 μ m。技術方案二上述具有溫敏開關的生長因子控釋微球的制備方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1:稱取質量為8. OXlO4-L 2 X IO5份的磷酸鹽緩沖液，將質量為O. 8-1. 2份的骨形態發生蛋白-2溶于磷酸鹽緩沖液中，制成質量濃度為6. 7X 10_4-1. 5X 10_3%的水相溶液；步驟2 :將質量為1. 8X104-2. 2 X IO4份的重均分子量為100_105kDa的甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐、1. 2X IO4-LSX IO4份的重均分子量為IOOkDa的明膠、
2.4X 103-3. 6X 103份的重均分子量為17kDa聚丙基丙烯酰胺依次溶于8. OX IO5-L 2 X IO6份的體積比為(2-4) :1的二氯甲烷和丙酮混合溶劑中，冰浴超聲分散O. 8-1.2min，制成質量濃度為2% -4. 5%的油相溶液；步驟3 :將所述水相溶液和所述油相溶液制備成油包水型乳液，將質量為4. OXlO4份的重均分子量為4-6萬的海藻酸鈉溶于剩余質量份的磷酸緩沖液中，與所述油包水型乳液混合后冰浴超聲分散O. 8-1. 2min,制成微乳液；步驟4 :將所述微乳液在室溫下低速攪拌3_5min，自然揮發或抽提去除二氯甲烷，制得所述具有溫敏開關的生長因子控釋微球。技術方案三技術方案一或技術方案二所述的制備方法制得的具有溫敏開關的生長因子控釋微球在治療牙周炎藥物中的應用。技術方案四一種具有溫敏開關的生長因子控釋微球制劑，其特征在于，包括具有溫敏開關的生長因子控釋微球以及藥學上可接受的輔料。優選地，所述藥學上可接受的輔料為聚氧乙烯聚氧丙烯醚。技術方案五技術方案四所述的具有溫敏開關的生長因子控釋微球制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟在低于20°C的溫度下，將技術方案二所述的制備方法制得的具有溫敏開關的生長因子控釋微球邊攪拌邊加入6. OX 103-9. OX IO3重量`份的聚氧乙烯聚氧丙烯醚，溶解后制得具有溫敏開關的生長因子控釋微球制劑。本發明采用含“溫敏”開關的聚丙基丙烯酰胺(PNIPAM)的甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐(Dex-GMA)/明膠(gelatin)凝膠微球包封骨形態發生蛋白_2后制成生長因子控釋微球，可以控制藥物僅在低臨界溫度(LCST) (37. 2°C)以一定的速度釋放，延長藥物的生理活性，提高藥物的穩定性和靶向性；將“溫敏”開關的聚丙基丙烯酰胺(PNIPAM)加入到生長因子微球中制得的生長因子控釋微球凝膠制劑具有溫敏控釋的優點，可有效發揮藥理活性。多聚體類生物材料有良好的生物相容性和降解能力，降解產物無毒、可吸收，因此聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)以及它們的共聚物(PLGA)是報道最多的用來制備微球藥物輸送系統(drug delivery system, DDS)的生物原材料。盡管這些人工合成的多聚體生物材料有很多優良性能，但作為蛋白類活性藥物的載體，卻有一定的局限性。首先，多聚體生物材料制備微球DDS過程中，有機溶劑的使用會造成部分藥物活性喪失；其次，多聚體生物材料降解過程中產酸，酸性產物也會造成其攜帶的藥物進一步失活；同時，藥物從多聚體生物材料DDS中釋放的可控性也較差。雖然近年來通過改性、復合其它生物材料、增加功能基團的方法，很多研究已經克服了這些材料的缺點，但工藝復雜，離臨床應用還十分遙遠。而膠原、多糖基水凝膠等天然生物材料來源廣泛，具有良好的生物相容性，且大多是美國食品和藥物管理局FDA允許臨床應用、有些甚至已經應用于臨床的生物材料(如膠原、右旋糖酐)；其作為制備生長因子DDS原材料，制備方便(可以制備不同的劑型)、工藝簡單、反應條件溫和，是較為理想的用來制備生長因子等活性藥物DDS的原材料，具有廣闊的臨床應用前景。明膠(gelatin, Gtn)是來源于動物膠原的一種天然生物材料,其等電點可以通過制備工藝進行調節，從而制備成酸性明膠和堿性明膠。不同等電點的明膠會與荷電相反的信號分子通過離子間的相互作用而結合，因此酸性明膠可以與堿性生長因子(bFGF、TGF-β、IGF等)結合，而堿性明膠可以與酸性生長因子(BMP、VEGF等)結合，這種結合可以使生長因子的釋放得到有效的延長，由此可見明膠基生物材料可以作為不同生長因子的載體。然而水性環境中，單純明膠的快速增溶(rapid solubilization)作用會破壞這種靜電吸附，仍然導致生長因子產生極為明顯的“突釋”效應，體外24h內釋藥甚至可達70%以上，達不到預期的緩釋效果，這在我們的前期實驗中已經得到證實。右旋糖酐(Dextran, Dex)是一種天然多糖材料,作為血衆替代品很早就已經應用于臨床。右旋糖酐基水凝膠作為抗癌藥物、蛋白、脂質體載體國內外學者已經積累大量的研究經驗，制備方法包括結晶化、物理交聯、化學交聯、輻射交聯共聚合等等，其制備工藝簡單；可以制備不同粒徑的微球或者微囊，載藥量大、包封率高；其降解依賴生物酶(葡聚糖酶，dextranase)的作用，交聯度(degree of substitution, DS)可以通過制備工藝進行調節，水解增溶作用小；改良后的右旋糖酐基水凝膠載體材料，可以賦予其溫度敏感、PH敏感特性，對周圍環境變化具有可“感知”能力，具有智能給藥的材料基礎，有望達到智能控釋給藥的目的。然而作為生長因子載體，右旋糖酐基生物材料缺乏與明膠相似的與生長因子的靜電作用，只能形成一種物理的包封與吸附，藥物極易通過“擴散、滲透作用”而快速釋放，因此“突釋”效應也非常明顯。但是，利用明膠對生長因子的靜電吸附作用和右旋糖酐基水凝膠的酶降解特征，通過物理或化學的方法將這兩種材料進行耦合，目標產物的藥物釋放就會大大延長。材料降解控制釋藥，包封葡聚糖酶控制降解，為減少藥物的初期“突釋”、實現生長因子的長時間釋放提供了新的契機。我們在前期的實驗中，利用甲基丙烯酸縮水甘油酯-右旋糖酐(Dex-GMA)和明膠(Gtn)在水成溶液PEG中的不混溶性和甲基丙烯酸激進分子與明膠的交聯耦合作用，在反應促進劑的存在的條件下成功制備了 Dex-GMA/Gtn凝膠微球，避免了有機溶劑的使用，不同的BMP包封方法均達到了對生長因子的生物緩釋作用。我們取得的實驗結果主要包括①首先成功對右旋糖酐基生物材料進行改性，枝接激進分子實現了明膠與右旋糖酐基生物材 料的有機結合，其釋藥主要由材料降解決定；③在國外學者研究的基礎上，建立了避免有機溶劑參與的完全水性環境(All-aqueous enviroment)中合成生長因子微載體的方法；④在一定程度上實現了生長因子的生物緩/控釋。本發明將智能給藥的經驗引入活性生長因子的控制釋放，制備生長因子控釋微球，成為外源性生長因子開發和利用的得力手段，將為組織再生、組織工程、器官移植等多領域的研究提供更為廣闊的空間。溫敏型智能載體由于在應用過程中很容易實現，是目前控釋給藥研究的重點。由于微球系統的“突釋效應”主要是由于其表面的膜孔在釋藥早期廣泛開放引起的，因此采用膜孔內接枝溫敏“開關”堵塞部分藥物釋放通道，不僅可以較好地減小“突釋效應”，而且可以通過溫度控制微囊膜內接枝鏈的膨脹/收縮特性從而達到生長因子的可控釋放。因此我們在前面的實驗基礎上，將溫敏“開關”聚丙基丙烯酰胺(PNIPAM)接枝到微凝膠緩釋系統(微球)的膜孔中，在解決藥物的“突釋效應”的同時，又可以通過溫度的改變控制生長因子的釋放，是生長因子智能化控釋的一種全新的嘗試。溫敏型藥物載體的低臨界溫度(LCST)是其實現藥物可控釋放的關鍵溫度在LCST以下，藥物載體釋藥減慢甚至不釋藥；而溫度達到或超過LCST，釋藥則明顯加快。正是利用這個原理，我們制備的生長因子控釋系統的LCST在37°C左右。這樣體外低于37°C情況下，藥物釋放很少，只有在植入體內時，藥物才真正釋放，從而實現我們牙周的智能化控釋給藥。本發明利用智能化微球包裹技術，以天然生物材料為載體的控釋微球不但可以控制藥物以一定的速度釋放，而且可以通過合適的釋藥途徑延長藥物的生理活性，提高藥物的穩定性，而且具有一定的靶向性，從而使藥物的藥理活性達到較理想的效果。本發明中采用的天然包埋材料甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐(Dex-GMA) /明膠(gelatin)，由甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐(Dex-GMA)和明膠(gelatin)按一定比例通過交聯聚合得到，為無定型聚合物，共聚物具有更大的親水性，可用于藥物控釋載體和組織工程細胞培養支架，具有組織相容性好，對人體安全無害等特點。骨形態發生蛋白-2通過含“溫敏”開關的聚丙基丙烯酰胺(PNIPAM)的甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐(Dex-GMA) /明膠(gelatin)凝膠微球包封后制成的控釋微球具有長時間和溫敏控釋特點。本發明采用的明膠(gelatin, Gtn)是來源于動物膠原的一種天然生物材料,化學性質比較穩定，無毒，具有吸濕性，絕大多數都易溶于水，可溶于乙醇、丙酮、氯仿等多數有機溶劑，通常情況下不活潑、不水解、耐熱，可用熱壓滅菌。在室溫條件下，分子量在100以下的明膠通常為無色或幾乎無色的透明澄清粘稠液體，分子量在2000以上的為固體。明膠水溶液PH值成微酸性或微堿性，其分子鏈上兩段的羥基都具有反應活性，能發生所有脂肪族羥基所能進行的化學反應。明膠目前應用極為廣泛，它可應用于醫藥、衛生、食品、化工等綜合能更多領域，具有以下優點首先明膠是無毒和低免疫原性親水聚合物，具有良好的生物相容性；其次，明膠是種兩親性物質，既可以溶解于水，又可以溶解于絕大多數的有機溶齊U，明膠具有化學惰性，對絕大多數化學反應穩定，但在其羥基火化后又易于跟含有氨基等化合物進行鍵合，把許多優良性質轉移到結合物中；除此以外，明膠價格相對低廉，適宜規模化生產。 本發明采用的右旋糖酐(Dextran, Dex)對人體無毒無害,是經美國FDA批準用作血漿代替品的材料，具有良好的生物可降解性，使用后能被自然界中微生物完全降解，最終生成二氧化碳和水，不污染環境，是公認的環境友好材料。本發明采用的甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐由右旋糖酐與甲基丙烯酸縮水甘油酯按一定比例通過共聚得到，為無定型聚合物，玻璃化轉變溫度為40_55°C，粘度IV (dl/g)范圍0. 10 1. O。作為優選，甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐(Dex-GMA)中，右旋糖酐(Dextran T40)分子量為37-39. 6kDa，甲基丙烯酸縮水甘油酯和右旋糖酐的聚合比例為1:80-120。甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐(Dex-GMA)、明膠和聚丙基丙烯酰胺的聚合比例為I (0. 6-1. 2) (0. 05-0. 09)。本發明優選穩定劑米用重均分子量為4_6萬的海藻酸鈉,分子式為(C6H708Na)n,主要由海藻酸的鈉鹽組成，由a-L-甘露糖醛酸(Μ單元)與b-D-古羅糖醛酸(G單元)依靠1，4-糖苷鍵連接并由不同GGGMMM片段組成的共聚物。海藻酸鈉是一種天然多糖，具有藥物制劑輔料所需的穩定性、溶解性、粘性和安全性。本發明在具有溫敏開關的生長因子控釋微球制劑中，包括具有溫敏開關的生長因子控釋微球以及藥學上可接受的輔料；優選藥學上可接受的輔料為聚氧乙烯聚氧丙烯醚。其中，聚氧乙烯聚氧丙烯醚(泊洛沙姆)是一種高分子非離子型表面活性劑，為美國國家處方集新增加的藥物輔助材料，具有在低溫下(4-5°C )為液體，體溫下為凝膠的獨特性質。凝膠具有黏附性能好，不易在骨創傷組織脫落和揮發的優點。本發明提供的具有溫敏開關的生長因子控釋微球制劑在4-5 V為可流動的膠體，20-38 °C為凝膠。


下面結合附圖和具體實施例，對本發明作進一步詳細說明。圖1為本發明的具有溫敏開關的生長因子控釋微球的掃描電鏡圖，其中，(A)微球膠體溶液電鏡圖；(B)單個微球電鏡放大圖；(C) (D) (E)均為溫敏開關電鏡放大圖。圖2為本發明的具有溫敏開關的生長因子控釋微球粒徑分布圖。圖3為本發明的具有溫敏開關的生長因子控釋微球中不同溫度下生長因子體外釋藥曲線圖。
具體實施例方式本發明中，右旋糖酐購自夏斯生物科技公司；甲基丙烯酸縮水甘油酯購自百靈威科技有限公司，明膠、海藻酸鈉、骨形態發生蛋白-2和骨形態發生蛋白_2Elisa試劑盒購自SIGMA公司；磷酸鹽緩沖液，購自西 安化學試劑廠；聚氧乙烯聚氧丙烯醚(泊洛沙姆)，購自上海醫藥公司。

實施例1 :制備具有溫敏開關的生長因子控釋微球(膠體溶液)稱取5 μ g骨形態發生蛋白-2藥物溶于O. 5g磷酸鹽緩沖液中，待其全部溶解后作為水相；稱取150mg甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐和明膠(甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐的重均分子量為100-105kDa，明膠的重均分子量為IOOkDa,聚丙基丙烯酰胺的重均分子量為17kDa，甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐(Dex-GMA)、明膠和聚丙基丙烯酰胺的聚合比例為1:0.6 :0. 05)溶于5g有機溶劑中(二氯甲烷丙酮=6 :2)作為油相；將上述水相、油相混合，超聲分散Imin制備乳劑，備用。將上述乳劑緩慢加入20g磷酸鹽緩沖液(磷酸鹽緩沖液中含200mg海藻酸鈉)，超聲分散lmin，并繼續在室溫低速攪拌3h，除去有機溶劑，即得制得具有溫敏開關的生長因子控釋微球。實施例2 :制備具有溫敏開關的生長因子控釋微球(膠體溶液)稱取10 μ g骨形態發生蛋白-2藥物溶于Ig磷酸鹽緩沖液中，待其全部溶解后作為水相；稱取300mg甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐和明膠(甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐的重均分子量為100-105kDa，明膠的重均分子量為IOOkDa,聚丙基丙烯酰胺的重均分子量為17kDa，甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐(Dex-GMA)、明膠和聚丙基丙烯酰胺的聚合比例為I 1 0. 07)溶于IOg有機溶劑中(二氯甲烷丙酮=6 :2)作為油相；將上述水相、油相混合，超聲分散Imin制備乳劑，備用。將上述乳劑緩慢加入40g磷酸鹽緩沖液(磷酸鹽緩沖液中含400mg海藻酸鈉)，超聲分散lmin，并繼續在室溫低速攪拌5h，除去有機溶劑，即得制得具有溫敏開關的生長因子控釋微球。實施例3 :制備具有溫敏開關的生長因子控釋微球(膠體溶液)稱取20μ g骨形態發生蛋白-2藥物溶于2g磷酸鹽緩沖液中，待其全部溶解后作為水相；稱取600mg甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐和明膠(甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐的重均分子量為100-105kDa，明膠的重均分子量為IOOkDa,聚丙基丙烯酰胺的重均分子量為17kDa，甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐(Dex-GMA)、明膠和聚丙基丙烯酰胺的聚合比例為1:1.2 :0. 09)溶于20g有機溶劑中(二氯甲烷丙酮=6 :2)作為油相；將上述水相、油相混合，超聲分散Imin制備乳劑，備用。將上述乳劑緩慢加入80g磷酸鹽緩沖液(磷酸鹽緩沖液中含800mg海藻酸鈉)，超聲分散lmin，并繼續在室溫低速攪拌4h，除去有機溶劑，即得制得具有溫敏開關的生長因子控釋微球。實施例4 :制備具有溫敏開關的生長因子控釋微球(膠體溶液)稱取4 μ g骨形態發生蛋白-2藥物溶于O. 6g磷酸鹽緩沖液中，待其全部溶解后作為水相；稱取120mg甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐和明膠(甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐的重均分子量為100-105kDa，明膠的重均分子量為IOOkDa,聚丙基丙烯酰胺的重均分子量為17kDa，甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐(Dex-GMA)、明膠和聚丙基丙烯酰胺的聚合比例為1:1 :0. 09)溶于6g有機溶劑中(二氯甲烷丙酮=6 2)作為油相；將上述水相、油相混合，超聲分散1. 2min制備乳劑，備用。將上述乳劑緩慢加入16g磷酸鹽緩沖液(磷酸鹽緩沖液中含160mg海藻酸鈉)，超聲分散O. 8min，并繼續在室溫低速攪拌3h，除去有機溶劑，即得制得具有溫敏開關的生長因子控釋微球。實施例5 :制備具有溫敏開關的生長因子控釋微球(膠體溶液)稱取6 μ g骨形態發生蛋白-2藥物溶于O. 4g磷酸鹽緩沖液中，待其全部溶解后作為水相；稱取150mg甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐和明膠(甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐的重均分子量為100-105kDa，明膠的重均分子量為IOOkDa,聚丙基丙烯酰胺的重均分子量為17kDa，甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐(Dex-GMA)、明膠和聚丙基丙烯酰胺的聚合比例為1:1.2 :0. 07)溶于4g有機溶劑中(二氯甲烷丙酮=6 :2)作為油相；將上述水相、油相混合，超聲分散O. Smin制備乳 劑，備用。將上述乳劑緩慢加入24g磷酸鹽緩沖液(磷酸鹽緩沖液中含240mg海藻酸鈉)，超聲分散1. 2min,并繼續在室溫低速攪拌5h，除去有機溶齊U，即得即得制得具有溫敏開關的生長因子控釋微球。實施例6 :制備具有溫敏開關的生長因子控釋微球制劑在實施例1制備的骨形態發生蛋白-2控釋微球膠體溶液中，在低溫(溫度低于200C )攪拌下，少量多次加入3. 75g聚氧乙烯聚氧丙烯醚，使之完全溶解即得。實施例7 :制備具有溫敏開關的生長因子控釋微球制劑在實施例2制備的骨形態發生蛋白-2控釋微球膠體溶液中，在低溫(溫度低于200C )攪拌下，少量多次加入7. 5g聚氧乙烯聚氧丙烯醚，使之完全溶解即得。實施例8 :制備具有溫敏開關的生長因子控釋微球制劑在實施例3制備的骨形態發生蛋白-2控釋微球膠體溶液中，在低溫(溫度低于200C )攪拌下，少量多次加入15g聚氧乙烯聚氧丙烯醚，使之完全溶解即得。實施例9 :制備具有溫敏開關的生長因子控釋微球制劑在實施例4制備的骨形態發生蛋白-2控釋微球膠體溶液中，在低溫(溫度低于200C )攪拌下，少量多次加入3. Og聚氧乙烯聚氧丙烯醚，使之完全溶解即得。實施例10 :制備具有溫敏開關的生長因子控釋微球制劑在實施例5制備的骨形態發生蛋白-2控釋微球膠體溶液中，在低溫(溫度低于200C )攪拌下，少量多次加入4. 5g聚氧乙烯聚氧丙烯醚，使之完全溶解即得。實施例11分別取實施例1至5中制備的生長因子控釋微球膠體溶液各10 μ L，共5份樣本，用光學顯微鏡觀察微球的表面形態，微球表面光滑圓整，球體大小較均勻。將微球置于載玻片上，盡量對微球進行分散后，在顯微鏡下隨機選取I個視野進行拍照，以照片上的標尺為依據對每一個微球的直徑進行測量。每5 μ m為單位，直徑±2. 5 μ m的全部計入，平均粒徑為5. 9-21. 5 μ m，粒徑分布范圍較窄。實施例12取骨形態發生蛋白-2對照品約10mg，精密稱重，置于IOOg量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，依次稀釋，使實際配置的對照品溶液濃度分別為O. 1,0. 2,0. 5，1，5，10，20，50ng/L，加入到微量反應板的微孔中。按照SIGMA公司提供的操作程序，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)在HTS7000紫外熒光高效分析儀測定標準樣品在在490nm波長的吸光度(0D)。以OD值為縱坐標，標準的骨形態發生蛋白-2濃度C進行對數直線回歸，繪制標準曲線。回歸方程為A=0. 48899+0. 08602C n=7, r=0. 9973，由圖像分析可知，在l_600nm范圍內為線性關系較好的直線方程，骨形態發生蛋白-2濃度的對數與吸收度有定量關系。將實施例1制備的生長因子控釋微球的膠體溶液在4°C、40000rpm條件下離心，2h后分離樣品中上清液，測定骨形態發生蛋白-2濃度，分別計算骨形態發生蛋白-2的載藥量和包封率。其中，載藥量公式
權利要求
1.一種具有溫敏開關的生長因子控釋微球，其特征在于，包含骨形態發生蛋白-2、重均分子量為100-105kDa的甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐、重均分子量為IOOkDa的明膠、重均分子量為17kDa聚丙基丙烯酰胺，以及助溶劑、乳化劑和穩定劑。
2.如權利要求1所述的具有溫敏開關的生長因子控釋微球，其特征在于，所述骨形態發生蛋白-2、甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐、明膠和聚丙基丙烯酰胺的質量比為(O. 8-1. 2) (1. 8X 104-2. 2X 104) :(1. 2X IO4-L 8X IO4) :(2. 4X 103_3· 6X 103)。
3.如權利要求1所述的具有溫敏開關的生長因子控釋微球，其特征在于，其特征在于，所述助溶劑包含磷酸鹽緩沖液；所述乳化劑包含體積比為(2-4) :1的二氯甲烷和丙酮混合溶劑；所述穩定劑包含重均分子量為40-60kDa的海藻酸鈉。
4.如權利要求1所述的具有溫敏開關的生長因子控釋微球，其特征在于，所述甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐中，右旋糖酐分子量為37-39. 6kDa，甲基丙烯酸縮水甘油酯和右旋糖酐的聚合比例為1:(80-120);所述甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐、明膠和聚丙基丙烯酰胺的聚合比例為I (O. 6-1. 2) (O. 05-0. 09)。
5.如權利要求1所述的具有溫敏開關的生長因子控釋微球，其特征在于，所述生長因子控釋微球的平均粒徑為5. 9-21. 5 μ m。
6.如權利要求1所述的具有溫敏開關的生長因子控釋微球的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟1:稱取質量為8. OX IO4-L 2 X IO5份的磷酸鹽緩沖液，將質量為O. 8-1. 2份的骨形態發生蛋白-2溶于磷酸鹽緩沖液中，制成質量濃度為6. 7 X 10_4-1. 5 X 10_3%的水相溶液； 步驟2 :將質量為1. 8X 104-2. 2X IO4份的重均分子量為100_105kDa的甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐、1.2X 104-1.8X 104份的重均分子量為IOOkDa的明膠、2.4X 103-3. 6X 103份的重均分子量為17kDa聚丙基丙烯酰胺分別溶于8. OX IO5-L 2 X IO6份的體積比為(2-4) :1的二氯甲烷和丙酮混合溶劑中，冰浴超聲分散O. 8-1.2min，制成質量濃度為2% -4. 5%的油相溶液； 步驟3 :將所述水相溶液和所述油相溶液制備成油包水型乳液，將質量為4. OX IO4份的重均分子量為4-6萬的海藻酸鈉溶于剩余質量份的磷酸緩沖液中，與所述油包水型乳液混合后冰浴超聲分散O. 8-1. 2min,制成微乳液； 步驟4 :將所述微乳液在室溫下低速攪拌3-5min，自然揮發或抽提出去二氯甲烷，制得所述具有溫敏開關的生長因子控釋微球。
7.如權利要求1至5任一項或如權利要求6所述的制備方法制得的具有溫敏開關的生長因子控釋微球在治療牙周炎藥物中的應用。
8.一種具有溫敏開關的生長因子控釋微球制劑，其特征在于，包括權利要求1至5任一項或權利要求6所述的制備方法制得的具有溫敏開關的生長因子控釋微球以及藥學上可接受的輔料。
9.如權利要求8所述的具有溫敏開關的生長因子控釋微球制劑，其特征在于，所述藥學上可接受的輔料為聚氧乙烯聚氧丙烯醚。
10.一種具有溫敏開關的生長因子控釋微球制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟在低于20°C的溫度下，將權利要求6所述的制備方法制得的具有溫敏開關的生長因子控釋微球邊攪拌邊加入6. OX 103-9. OX IO3重量份的聚氧乙烯聚氧丙烯醚，溶解后制得具有溫敏開關的生長因子控釋微球制劑。
全文摘要
本發明涉及藥物控釋領域，公開了一種具有溫敏開關的生長因子控釋微球及其制備方法、以及具有溫敏開關的生長因子控釋微球制劑及其制備方法。該具有溫敏開關的生長因子控釋微球可應用于牙科。該具有溫敏開關的生長因子控釋微球，其特征在于，包含骨形態發生蛋白-2、重均分子量為100-105kDa的甲基丙烯酸縮水甘油酯右旋糖酐、重均分子量為100kDa的明膠、重均分子量為17kDa聚丙基丙烯酰胺，以及助溶劑、乳化劑和穩定劑。
文檔編號A61K47/34GK103054812SQ201210591459
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月29日 優先權日2012年12月29日
發明者陳發明, 吳禮安, 孫海花, 魯紅 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學