經修飾的革蘭氏陽性細菌及其用途
【專利摘要】本發明涉及具有提高的脅迫抗性和/或改善的貯藏特征的革蘭氏陽性細菌。特別地，本發明涉及積累細胞內海藻糖的革蘭氏陽性細菌。根據本發明的革蘭氏陽性細菌缺乏纖維二糖特異性PTS系統IIC組分(PtcC)活性。所述革蘭氏陽性細菌還可以缺乏海藻糖6-磷酸磷酸化酶(TrePP)活性。所述革蘭氏陽性細菌還可以過表達海藻糖轉運蛋白。本發明還涉及包含所述革蘭氏陽性細菌的組合物及其方法和用途。
【專利說明】經修飾的革蘭氏陽性細菌及其用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及具有改善的脅迫抗性和改善的制造、加工和貯藏特征的微生物(例如革蘭氏陽性細菌)。本發明特別地涉及積累細胞內海藻糖的經遺傳修飾的微生物。本發明還涉及這些微生物在食品技術和醫療應用中的用途。
【背景技術】
[0002]革蘭氏陽性細菌共同地因具有單脂質雙層質膜而分類。革蘭氏陽性細菌包括多種桿狀(bacilliform)和球狀(cocciform)細菌屬，其中雙歧桿菌(Bifidobacteria)和一群屬統稱為乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)。LAB包括革蘭氏陽性、低GC、酸抗性、通常無孢子形成、非呼吸的桿或球的分支，其通過其共同的代謝和生理特征而相關聯。這些細菌通常見于(分解的)植物和乳制品，產生乳酸作為碳水化合物發酵的主要代謝終產物。在歷史上，該特征將LAB與食物發酵相聯系，因為酸化抑制腐敗因子(spoilage agent)的生長。一個原型LAB乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)是嗜溫且微需氧發酵的乳酸菌。盡管該細菌廣泛的應用在食品發酵中(尤其地在乳品工業中)，對于其在藥物和保健品中的用途(作為藥物來治療體腔中的感染如陰道感染，或者作為遞送生物活性分子的載體)有越來越高的興趣。在所有這些案例中，對具有高度活力的起子培養物或者包含高比例有活力細菌的藥物或營養物制劑有需要。然而，乳酸乳球菌(L.1actis)傾向于在貯藏期間或加
工(對于干粉配方、片劑形成等的生產......)期間失去活力。當細菌在冷凍干燥后經受
額外的脅迫(例如高酸度或存在膽汁鹽)時，活力的下降甚至更為明顯。
[0003]已經提出了數種方法來克服該問題。海藻糖的使用是特別有感興趣的。海藻糖(a -D-吡喃葡糖基-1，Ι-a-D-吡喃葡萄糖苷)是在多種生物(從細菌到無脊椎動物)中存在的非還原性二糖。海藻糖(有時與葡聚糖組合)經常用作外部添加的深低溫保藏劑。外部添加的海藻糖具有糖類基質的功能(Conrad等，2000，)，并且發揮其保護作用(尤其在冷凍干燥期間)，其中它充當玻璃成形劑(glass former)。此外,海藻糖被公認為脅迫代謝物，并且其已經在真菌中尤其是在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中被廣泛的研究。高濃度的內部海藻糖的確改善貯藏能力并導致深低溫保藏后的較高活力。此外，重要的是注意到外部添加的海藻糖幾乎不導致微生物中內部海藻糖積累，無論是因為其未被攝取還是其在攝取后被迅速地代謝。
[0004]Termont 等(Appl Environ Microbiol72:7694 ;2006)報道通過質粒驅動的QtsA (海藻糖-6-磷酸合酶)和otsB (海藻糖-6-磷酸磷酸酶)之過表達在乳酸乳球菌中細胞內積累來從頭合成的海藻糖。細胞內的海藻糖積累而非外部添加的海藻糖保護乳酸乳球菌免受膽汁裂解以及通過冷凍干燥的細胞死亡。由于乳酸乳球菌極度敏感，對膽汁裂解的保護可被用作細胞內海藻糖積累的重要功能性測定。
[0005] Andersson等(J Biol Chem276:42707 ；2001)已經描述了用于在乳酸乳球菌中的海藻糖利用的新途徑。該途徑使用海藻糖-6-磷酸磷酸酶(trePP)的活性將海藻糖_6_磷酸轉換為葡萄糖1-磷酸和葡萄糖6-磷酸。他們描述了在乳酸乳球菌中trePP的插入失活導致失去在海藻糖上生長的能力。
[0006]對于海藻糖的細胞內積累，Carvalho等(Appl Environ Microbiol77:4189 ;2011)描述了利用質粒驅動的乳酸乳球菌trePP和β-葡糖磷酸變位酶(pgmB)過表達的方法。如由這些作者表明的，考慮到細菌缺乏海藻糖6-磷酸磷酸酶，來自食品級生物費氏丙酸桿菌(P.freudenreichii)的對應基因otsB用于提供所需的活性。所產生的細胞表現出改善了對冷休克、熱休克和酸性的抗性。然而作者指出所產生的海藻糖的至少67%見于生長培養基中。因此，所產生的海藻糖看來沒有在細胞內高效地保留或積累。
[0007]盡管這些方法的確導致貯藏的改善，還需要有可以導致革蘭氏陽性細菌(例如LAB或雙歧桿菌)之貯藏改善的方法，不僅在細菌用于在醫學應用中遞送生物活性化合物的那些情況中，而且在當細菌用于食品工業(例如乳品工業)時也是如此。
[0008]Lowes 等 2006 (Oral Microbiol Tmmunol.21 ⑴:21_7)公開了變異鏈球菌(Streptococcus mutans)細菌的一些突變體，被他命名為PTS系統IIC組分(PtcC)突變體。被Lowes研究的變異鏈球菌(S.mutans)是導致頻齒的病原體,并且Lowes首要關注研究變異鏈球菌在其致病的情況下的基因組變異。β-葡糖苷碳水化合物源的利用可以在變異鏈球菌的致病性和存活中發揮作用，并且從這個角度研究PtcC。Lowes沒有提出PtcC在海藻糖內部積累或在改善細菌的脅迫抗性中的任何作用。值得注意的是，Lowes等2006研究了葡糖苷的代謝，而海藻糖是α-葡糖苷。Lowes不關心非致病性細菌的PtcC突變體或者此類突變體的任何效用。[0009]發明概述
[0010]細胞內海藻糖可保護微生物(例如乳酸菌(LAB))，如乳酸乳球菌細胞免受有害的試劑或條件。實例是膽酸裂解(活LAB在腸轉移期間所經歷的)，或者用于LAB之保存的冷凍、干燥、噴霧干燥、冷凍干燥期間的冷凍和/或干燥脅迫。
[0011]僅有限數量的方法可用來允許海藻糖在細胞內的積累。這些方法利用質粒驅動同源性或異源性基因的過表達。然而這并不是用于藥物或食物產品的期望構造。
[0012]本文中我們報道了允許海藻糖細胞內積累的新方法，僅基于在革蘭氏陽性細菌中不存在纖維二糖特異性PTS系統IIC組分(PtcC)活性，優選地通過導致編碼內源性PtcC的基因部分地或完全地缺失、破壞或失活(例如不能產生功能性PtcC基因產物)。本發明人出乎意料地觀察到隨著時間的推移而積累的海藻糖在一定程度上通過目前未曾預料的并且未被鑒別的海藻糖出口(exit port)泄漏到細胞外，由此，可以在上清液中檢測海藻糖。令人驚訝的是，他們發現PtcC的失活阻止了海藻糖的釋放。這些發現更是未曾料到的，因為PtcC到目前為止從未與海藻糖轉運相關，并且未曾被提出作為負責海藻糖泄漏并釋放至周圍環境的海藻糖出口。還讓人驚訝的是，已知的和已描述的海藻糖轉運蛋白(trehalosetransporter)似乎并不負責這一海藻糖泄漏的機制。
[0013]在一方面中，本發明涉及革蘭氏陽性細菌，例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，并且優選缺乏纖維二糖特異性PTS系統IIC組分(PtcC)活性的乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌。
[0014]另一方面提供了缺乏PtcC活性的革蘭氏陽性細菌，其用作藥物，所述革蘭氏陽性細菌例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，并且優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌。這樣的藥物可以例如涵蓋藥物制劑、營養品(nutraceutical)、醫療食品(medical food)或功能性食品(functional food)或益生菌劑(probiotics)。[0015]在另一方面中，本發明提供藥物、起子培養物(starter culture)、益生菌組合物或食品添加劑，更特別的是非藥用益生菌組合物或食品添加劑，其包含缺乏PtcC活性的革蘭氏陽性細菌，例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，并且優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌。非限制性地，這樣的食品添加劑可以是起子培養物，優選地用于制備食品產品的起子培養物。因此，相關的方面提供起子培養物，優選用于制備食品產品的起子培養物，其包含缺乏PtcC活性的革蘭氏陽性細菌例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，并且優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌。
[0016]在另一方面中，本發明提供缺乏PtcC活性的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌作為藥物、起子培養物、益生菌和/或食品添加劑，更特別地作為非藥用起子培養物、益生菌或食品添加劑)的用途。非限制性地，這樣的食品添加劑可以是起子培養物，優選用于制備食品產品的起子培養物。因此，相關方面提供使用缺乏PtcC活性的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌作為起子培養物，優選用于制備食品產品的起子培養物，更特別地其中所述食品產品是非藥用食品產品)的用途。
[0017]還通過本發明的一方面提供了用于制備食品產品的方法，其包括將缺乏PtcC活性的革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌并且優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)、或者所述食品添加劑或者所述起子培養物與能夠被革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)發酵的底物物質混合。在一些實施方案中，這樣的方法還可以包括將所述底物物質發酵的步驟。以及提供可通過任意這樣的方法獲得的這樣的食品產品。食品產品可以非限制性地涵蓋益生菌劑。
[0018]另一方面提供了用于制備藥物例如藥物制劑、營養品、醫療食品或功能性食品或益生菌，或者用于制備益生菌組合物或食品添加劑(更特別地非藥用益生菌組合物或食品添加劑)，或者用于制備起子培養物(優選地用于制備食品產品的起子培養物)的方法，所述方法包括以下步驟:i)在培養基中繁殖缺乏PtcC活性的革蘭氏陽性細菌，例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌并且優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌，所述培養基包含能夠被所述革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)發酵的底物物質，以及ii)將如此繁殖的革蘭氏陽性細菌例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌并且優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌分別配制到藥物或益生菌組合物或食品添加劑或起子培養物中。因此，還涵蓋了缺乏PtcC活性的革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌并且優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)用于制備藥物(例如藥物制劑或營養品、醫療食品或功能性食品或益生菌)，或者用于制備益生菌組合物或食品添加劑(更特別地非藥用益生菌組合物或食品添加劑)，或者用于制備起子培養物(優選地用于制備食品產品的起子培養物)的用途。
[0019]本發明人發現革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，例如本文中所述的LAB或雙歧桿菌)不僅能夠細胞內海藻糖積累(甚至不依賴碳源)，而且所述革蘭氏陽性細菌顯示出極大增強的對多種脅迫或貯藏相關條件的抗性。例如，所述革蘭氏陽性細菌更加耐受貯藏相關的操作，例如干燥、冷凍、噴霧干燥或冷凍干燥(凍干)。該革蘭氏陽性細菌還展示出在腸胃系統中增強的存活(不依賴進食或禁食狀態)，表明改善了對酸性和膽汁裂解的抗性。本文中所述的革蘭氏陽性細菌的表現，無論在藥用裝置(medicinalsetting)或在食品工業中，比之前已知的更加可繁殖。因此體現了本發明原理的革蘭氏陽性細菌提供了更加穩健的環境以及生物抗性。[0020]在一方面中，本發明因此還涉及用于在革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，并且優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)中內部積累海藻糖的方法，其包括繁殖缺乏PtcC活性的革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，并且優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)，優選地其中在包含能夠被所述革蘭氏陽性細菌發酵的底物物質的培養基中，編碼內源性PtcC的基因已被部分地或完全地被缺失、破壞或失活，例如不能產生功能性PtcC基因產物。
[0021]在另一方面中，本發明涉及用于改善革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，并且優選LAB或雙歧桿菌)的脅迫抗性或制造、加工和/或貯藏特征的方法，其包括對革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，并且優選LAB或雙歧桿菌)進行修飾，例如使其缺乏PtcC活性。優選地，所述脅迫抗性或制造、加工和/或貯藏特征可以是選自以下的一種或更多種:對酸條件的抗性，對膽汁鹽的抗性，對熱的抗性，對鹽的抗性，對干燥、冷凍、噴霧干燥或冷凍干燥的抗性，以及滲透抗性。
[0022]優選地，在之前提到的缺乏PtcC活性的革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，并且優選LAB或雙歧桿菌)中，編碼內源性PtcC的基因已被部分地或全部地缺失、破壞或失活(例如不能產生功能性PtcC基因產物)。應當理解的是，這樣的缺失、破壞或失活可以靶向例如PtcC基因的編碼序列和/或啟動子(ptcC從通過所述啟動子表達)。
[0023]在一些優選的實施方案中，本文中公開的或使用的缺乏PtcC活性的革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，并且優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)可以缺乏海藻糖6-磷酸磷酸化酶(TrePP)活性。優選地，在這樣的革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，并且優選缺乏PtcC活性的乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)中還缺乏TrePP活性，編碼內源性TrePP的基因已被部分地或全部地缺失、破壞或失活(例如不能產生功能性TrePP基因產物)。應當理解的是，這樣的缺失、破壞或失活可以靶向例如trePP基因的編碼序列和/或啟動子(trePP通過所述啟動子表達)。本發明人出人意料地發現缺乏PtcC活性的革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，并且優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)還細胞內積累海藻糖。與本方法相反，現有工作(W02006/018446)教導編碼異源性海藻糖6-磷酸磷酸酶(例如otsB)以實現海藻糖積累。Carvalho等2011 (同上)甚至教導過表達TrePP以獲得細胞內海藻糖積累。此外，盡管LAB(例如乳酸乳球菌)或許能利用海藻糖，直到目前為止還沒有描述過合成海藻糖的乳酸乳球菌菌株。尚未鑒定內源性海藻糖-6-磷酸合酶和海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因，其被認為是從葡萄糖-6-磷酸(乳酸乳球菌中存在的代謝物)起始海藻糖產生的先決條件。
[0024]在一些優選的實施方案中，本文中公開的或使用的缺乏PtcC活性的革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，并且優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)可以過表達一種或更多種海藻糖轉運蛋白，優選的內源性海藻糖轉運蛋白，例如包含在海藻糖操縱子中的一種或更多種磷酸轉移酶系統基因。本發明人出人意料地發現這樣的過表達(與天然海藻糖誘導的表達相反)還增強革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，并且優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)積累和/或保留細胞內海藻糖的能力。
[0025] 在一些優選的實施方案中，本文中使用的缺乏PtcC活性的革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，并且優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)包含功能性異源性海藻糖6-磷酸磷酸酶。本發明人認識到異源性表達海藻糖6-磷酸磷酸酶還提高海藻糖積累。在一些優選的實施方案中，所述海藻糖6-磷酸磷酸酶是otsB，優選來自大腸桿菌(E.coli)的 OtsB0
[0026]概括來講，在一些實施方案中，本文中公開的或使用的缺乏PtcC活性的革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，并且優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)還可以表現出以下特征中的任意一個、任意兩個或所有三個:(a)革蘭氏陽性細菌包含功能性異源性海藻糖6-磷酸磷酸酶；(b)革蘭氏陽性細菌缺乏TrePP活性；(c)革蘭氏陽性細菌過表達一種或更多種海藻糖轉運蛋白。在一些優選的實施方案中，缺乏PtcC活性的革蘭氏陽性細菌還可以顯示特征(b)，或者更優選還可以顯示特征(a)和(b)，或者甚至還更優選顯示特征(b)和(C)，或者還可以非常優選顯示特征(a)和(b)和(C)。
[0027] 在一些優選的實施方案中，本文中公開的或使用的革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，并且優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)還可以含有一種或更多種異源性基因產物。在一些優選的實施方案中，特別是其中革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，并且優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)旨在用于藥用用途，這樣的基因產物可以是預防性和/或治療性基因產物或抗原。
[0028]在某些實施方案中，本文中公開的或使用的革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，并且優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)，或藥物或食品添加劑或起子培養物或益生菌組合物可以被干燥、噴霧干燥、冷凍或冷凍干燥(凍干)。因此，在一些實施方案中，用于制備藥物，或用于制備食品添加劑，或用于制備起子培養物，或用于制備益生菌組合物，或用于在革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，并且優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)中內部積累海藻糖，或者用于改善革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，并且優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)的脅迫抗性或制造、加工和/或貯藏特征的任何前述方法還可以包含干燥、噴霧干燥、冷凍或冷凍干燥(凍干)革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，并且優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)、藥物、食品添加劑、益生菌組合物或起子培養物。
[0029]在用于制備藥物，或用于制備食品添加劑，或用于制備起子培養物的前述方法的某些實施方案中，或者在用于在革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，并且優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)中內部積累海藻糖的前述方法的某些實施方案中，培養基還可以包含麥芽糖或葡萄糖或者麥芽糖與葡萄糖的組合，作為碳源，優選地作為主要或甚至唯一碳源。在某些實施方案中，培養基基本上不包含外部(外源性)添加的海藻糖。本發明人出人意料地發現本文中公開的革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，并且優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)已經獲得了利用碳源(例如麥芽糖或葡萄糖)在細胞內積累海藻糖的能力。因此，根據本發明的革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌，并且優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)可以有利地在例如作為唯一碳源的麥芽糖(其比海藻糖便宜)上生長，還將積累細胞內海藻糖。然而，應當理解的是，在某些實施方案中，培養物培養基可以含有外部(外源性)添加的海藻糖。
[0030]在某些優選的實施方案中，在本發明書中意指的革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌)可以是乳酸菌(LAB),更優選乳球菌屬(Lactococcus sp.)或乳桿菌屬(Lactobacillus sp.)細菌。[0031]在另一些優選實施方案中，在本發明書中意指的革蘭氏陽性細菌(例如特別是非致病性革蘭氏陽性細菌)可以是雙歧桿菌屬(Bifidobacterium sp.)細菌。
[0032]本發明的以上和另一些方面以及優選的一些實施方案將在以下部分和在所附的權利要求中描述。所附加權利要求的主題在此具體地并入本說明書。
[0033]附圖簡述
[0034]圖1:在trePP失活之后、otsB表達之后或其組合，細胞內海藻糖積累是可能的。
[0035]圖2:外源性海藻糖在乳酸乳球菌細胞中的積累提供了針對膽汁裂解的保護。(A)存活；和(B)海藻糖含量。
[0036]圖3:細胞內海藻糖的積累和穩定性。㈧海藻糖隨時間的釋放；和⑶海藻糖在上清液中提高。[0037]圖4:在表2中描述了海藻糖在多種菌株中的積累和釋放。菌株補充了 IOOmM⑷或500mM⑶海藻糖。
[0038]圖5:ptcC的失活阻止(在M9鹽中，圖A)或延遲(在0.5%牛膽汁(oxgal)，圖B)細胞內海藻糖的釋放。
[0039]圖6:外源性海藻糖在乳酸乳球菌細胞中的積累提供了針對膽汁裂解的保護。(A)細胞內海藻糖隨時間的釋放；和(B)在0.5%牛膽汁中隨時間的存活。
[0040]圖7: trePP KO菌株(ptcC wt以及ptcC KO 二者)能夠將葡萄糖或麥芽糖轉變為細胞內海藻糖。
[0041]圖8:當豬被禁食24小時(A)以及在隨意可獲得食物期間⑶時，都提高了在經豬腸腸內通過期間的存活。
[0042]圖9:產生生物質后海藻糖的積累。
[0043]圖10:通過麥芽糖刺激細胞內海藻糖的積累。
[0044]圖11:生物質產生期間或之后將麥芽糖轉變為細胞內海藻糖。
[0045]發明詳述
[0046]除非上下文另有清楚規定，否則本文中使用的沒有數量詞修飾的名詞表示一個/種或更多個/種。
[0047]本文中使用的術語“包含”與“包括”或“含有”是同義，并且是包括性或開放式的，并且不排除另外的未記載的成員、要素或方法步驟。應當理解的是，本文中使用的術語“包含”包括術語“由......組成”以及術語“基本由......組成”。
[0048]通過端點記載的數值范圍包括歸入在各個范圍內的所有數字和部分，以及所記載的端點。
[0049]本文中使用的術語“約”或“大約”當涉及可測量值(例如參數、量、時距(temporalduration)等)時意指涵蓋給定值的+/-20%或更小、優選+/-10%或更小、更優選+/-5%或更小以及又更優選+/-1%或更小的變化，其程度為這些變化適用于在所公開的本發明中執行。應理解修飾詞“約”或“大約”涉及的值自身也是具體的并優選地公開的。
[0050]盡管術語“一個/種或更多個/中”或“至少一個/種”，例如一組成員的一個或更多個或者至少一個成員自身通過進一步舉例本身清楚，但是術語尤其涵蓋其中涉及所述成員的任意一個或者所述成員的任意兩個或更多個，例如，所述成員的任意> 3、> 4、> 5、≥6或≥7等，并且多至所有的所述成員。[0051]本說明書引用的所有參考文獻均通過引用整體并入本文。特別地，本文所具體引用的所有參考文獻的教導通過引用并入本文。
[0052]除非另有定義，否則用于公開本發明的所有術語(包括技術術語和科學術語)具有如本發明所屬領域普通技術人員通常理解的含義。通過進一步的指導，包括術語定義以更好地理解本發明的教導。
[0053]在下文中，更詳細地定義了本發明的不同方面。除非明確指明有矛盾，否則如此定義的每個方面可與任意其他方面組合。特別地，指示為優選的或有利的任意特性可與指示為優選的或有利的任意其他任意特性組合。
[0054]在整個本說明書中，提及“一個實施方案”意指關于所述實施方案所描述的具體特性、結構或特征包括在本發明的至少一個實施方案中。因此，貫穿本說明書在不同地方短語“在一個實施方案中”的出現不一定都指的是相同的實施方案，而是可以。此外，如本領域技術人員從本公開內容顯而易見的，在一個或更多個實施方案中，可以以任意合適方式組合具體特性、結構或特征。此外，如本領域技術人員所理解的，雖然本文中所述的一些實施方案包括包括在另一些實施方案中的一些特性而不包括其另一些特征，但是不同實施方案之特性的組合旨在包括在本發明的范圍內，并且構成不同的實施方案。例如，在所附權利要求中，可以以任意組合使用所要求保護的實施方案中的任意一個。
[0055]在以下的本發明詳述中，參照了構成其一部分的附圖，并且其中僅通過闡明本發明可實施的一些具體實施方案的方式示出。應理解，可利用另一些實施方案并且可作出結構或邏輯改變而不偏離本發明的范圍。因此，以下的詳細描述不應視為限制含義，并且本發明的范圍由所附權利要求書限定。
[0056]列出重組DNA技術一般原理的標準參考書包括Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第 2 版，第 1-3 卷,Sambrook 等編，Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N.Y., 1989 ；Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 等編，Greene Publishing and ffiley-1nterscience, New York, 1992 (定期更新)("Ausubel等.1992" ) ;Innis等,PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,AcademicPress:San Diego,1990。例如在 Davis, B.D.等，Microbiology,第 3 版，Harper&Row,出版商，Philadelphia，Pa.(1980)中列出了微生物學的一般原則。
[0057]本發明人發現海藻糖在一定程度上通過目前未被鑒別的或未曾預料的海藻糖出口從細胞泄漏，并且可以在上清液中回收。出人意料的是，本發明人發現PtcC的破壞避免了海藻糖的釋放。
[0058]本文中所公開的是缺乏纖維二糖特異性PTS系統IIC組分(PtcC)活性的革蘭氏陽性細菌，優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌。
[0059]在一個方面中，革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)可以用作藥物，即用在治療中。另一方面提供包含缺乏PtcC活性的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)的藥物。還公開了缺乏PtcC活性的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)用于制備藥物的用途。例如，可以提供這樣的藥物作為藥物制劑、營養品、益生菌、醫療或功能食物。
[0060]另一方面提供了缺乏PtcC活性的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)作為益生菌或食品添加劑，更特別地作為非藥用益生菌或食品添加劑的用途。相關的方面提供了缺乏PtcC活性的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)作為起子培養物的用途，優選用于制備食品產品的起子培養物，更特別地其中所述食品產品是非藥用食物產品。
[0061]因此，另一方面提供了包含缺乏PtcC活性的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)的益生菌或食品添加劑，更具體地非藥用益生菌或食品添加劑。相關的方面提供了起子培養物，優選用于制備食品產品的起子培養物，更特別地其中所述食品產品是非藥用食品產品，所述起子培養物包含缺乏PtcC活性的革蘭氏陽性細菌，優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌。
[0062]本文中使用的術語“革蘭氏陽性細菌”具有其在本領域中已知的通常含義。通過進一步的指導，革蘭氏陽性細菌可通過保留結晶紫染色的革蘭氏染色來鑒別。
[0063]在一個優選實施方案中，根據本發明的革蘭氏陽性細菌是非致病性的，即其在施用于目的對象時不造成傷害或不引起有害作用。
[0064]本文中使用的術語“LAB”的“乳酸菌”涉及革蘭氏陽性細菌，所述革蘭氏陽性細菌是非致病性的，即其在施用于目的對象時不造成傷害或不引起有害作用，并且其優選屬于以下細菌屬:乳球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pediococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、氣球菌屬(Aerococcus)、肉桿菌屬(Carnobacterium)、腸球菌屬(Enterococcus)、酒球菌屬(Oenococcus)、芽抱乳桿菌屬(Sporolactobacillus)、四聯球菌屬(Tetragenococcus)、漫游球菌屬(Vagococcus)和魏斯氏菌屬(Weisella)。更優選地，LAB可以是乳球菌屬物種例如但不限于乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)、格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)、魚乳球菌(Lactococcus piscium)、植物乳球菌(Lactococcus pi ant arum)和棉子糖乳球菌(Lactococcus raffinolactis)及其任意亞種和菌株。最優選地,乳球菌屬物種可以是乳酸乳球菌及其任意亞種和菌株，例如但不限于乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcuslactis ssp.cremoris)、乳酸乳球菌霍氏亞種(Lactococcus lactis ssp.hordniae)、乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactis ssp.lactis)、乳酸乳球菌亞種雙乙酰乳酸變種(Lactococcus lactis ssp.bv.diacetylactis)。進一步優選地，乳酸乳球菌可以是乳酸乳球菌乳脂亞種或乳酸乳球菌乳酸亞種，更優選是乳酸乳球菌乳脂亞種，并且涵蓋其任意菌株，例如，乳酸乳球菌乳脂亞種SKl1、乳酸乳球菌乳脂亞種MG1363或乳酸乳球菌乳酸亞種IL1403。還優選地，LAB可以是腸球菌屬優選糞腸球菌Ginterococcus faecalis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)及其任意亞種和菌株，例如但不限于屎腸球菌菌株LMG15709。
[0065]雙歧桿菌是革蘭氏陽性的、非運動性的、通常分支的厭氧細菌的屬。本文中使用的雙歧桿菌可包括青春雙歧桿菌(B.adolescentis)、有角雙歧桿菌(B.angulatum)、動物雙歧桿菌(B.animalis)、星形雙歧桿菌(B.asteroides)、兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)、波恩雙歧桿菌(B.bourn)、短雙歧桿菌(B.breve)、鏈狀雙歧桿菌(B.catenulatum)、小豬雙歧桿菌(B.choerinum)、棒狀雙歧桿菌(B.coryneforme)、兔雙歧桿菌(B.cuniculi)、寓齒雙歧桿菌(B.denticolens)、齒雙歧桿菌(B.dentium)、嘉利肯雙歧桿菌(B.galIicum)、雞雙歧桿菌(B.gal I inarum)、印 度雙歧桿菌(B.1ndicum)、嬰兒雙歧桿菌(B.1nfantis)、殊形雙歧桿菌(B.1nopinatum)、乳雙歧桿菌(B.lactis)、長雙歧桿菌(B.1ongum)、巨大雙歧桿菌(B.magnum)、瘤胃雙歧桿菌(B.merycicum)、微小雙岐桿菌(B.minimum)、假鏈狀雙歧桿菌(B.pseudocatenulatum)、假長雙歧桿菌(B.pseudolongum)、小雞雙歧桿菌(B.pul1rum)、反會雙岐桿菌(B.ruminantium)、沙庫來雙岐桿菌(B.saeculare)、沙布提雙岐桿菌(B.subtile)、豬雙歧桿菌(B.suis)、熱嗜酸性雙岐桿菌(B.thermacidophilum)、嗜熱雙歧桿菌(B.thermophilum)。優選地，雙歧桿菌是青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌。應理解，還包括雙歧桿菌的所有亞種和菌株。
[0066]本文所使用的“纖維二糖特異性PTS系統IIC組分”或“ptcC”或“PtcC”是指磷酸轉移酶系統組分。磷酸轉移酶系統參與催化磷酰基從磷酸烯醇式丙酮酸轉移到伴隨著其跨細胞膜轉運進入的糖底物。PtcC是纖維二糖特異性PTS系統的跨膜組分。PtcC到目前為止還沒有牽涉到海藻糖轉運中，更不用說參與海藻糖從革蘭氏陽性細菌(乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)泄漏。例如，乳酸乳球菌乳脂亞種MG1363的核酸和蛋白質序列分別如SEQ ID NO:7和 8 (分別對應于 Genbank 登錄號 NC_009004.1 (區域 430271-431608)和 ΥΡ_001031790.I)所示。在一個實施方案中，本文所使用的PtcC涉及分別具有SEQ ID NO:7和8的核酸或氨基酸序列的基因或蛋白質，或者具有編碼SEQ ID NO:8的核酸。
[0067]在另一個實施方案中，本文所使用的ptcC涉及具有分別與SEQ ID NO:7和8有至少75%同一性(例如至少75%、80%、85%、90%、95%或更高％同一性)之核酸或氨基酸序列的基因或蛋白質。在另一個實施方案中，本文所使用的PtcC編碼與SEQ ID Ν0:8有至少75%同一性(例如至少75%、80%、85%、90%、95%或更高％同一性)的蛋白質。在另一個實施方案中，本文所使用的PtcC涉及具有與SEQ ID NO:7至少55%同一性(例如至少60^^65^^70%或更高％同一性)之核酸或氨基酸序列的基因。在另一個實施方案中，本文所使用的PtcC涉及具有與SEQ ID NO:8有至少45%同一性(例如至少50%、55%、60%、65%、70%或更高％同一性)之氨基酸序列的蛋白質。在另一個實施方案中，本文所使用的PtcC編碼與SEQ ID NO:8有至少45%同一性(例如至少50%、55%、60%、65%、70%或更高％同一性)的蛋白質。優選地，以上描述的序列涉及或編碼功能性PtcC蛋白質。在另一個實施方案中，本文所使用的PtcC是SEQ ID NO:7和8的LAB直系同源物(orthologue)。優選地，但不限于此，當革蘭氏陽性細菌是乳酸菌(LAB)更優選乳球菌屬，甚至更優選乳酸乳球菌時，可以特別地應用在本段中個體化的序列同一性。
[0068]例如，兩歧雙歧桿菌PRL2010的ptcC的核酸和蛋白質序列分別如Genbank登錄號 NC_014638.1 (區域 2033198..2034538，互補)和 YP_003971775.1 所示；長雙歧桿菌長亞屬(Bifidobacterium longum subsp.longum)KACC91563 的核酸和蛋白質序列分別如Genbank 登錄號 NC_017221.1 (區域 2316679..2317218)和 YP_005588251.1 所示；以及短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)UCC2003的核酸和蛋白質序列分別如Genbank登錄號CP000303.1 (區域 2379064..2380443,互補)和 ABE96554.1 所示。
[0069] 在另一個實施方案中，本文中所用的ptcC涉及具有與兩歧雙歧桿菌PRL2010或長雙歧桿菌長亞屬KACC91563或短雙歧桿菌UCC2003之ptcC的核酸或蛋白質序列(分別如以上陳述的Genbank登錄號所定義)有至少75%同一性(例如至少75%、80%、85%、90%、95%或更多％同一性)之核酸或氨基酸序列的基因或蛋白質。優選地，以上描述的序列涉及或編碼功能性PtcC蛋白。在另一個實施方案中，本文中使用的ptcC是所述雙歧桿菌物種(species)的ptcC的雙歧桿菌直系同源物。優選地，但不受限制，當革蘭氏陽性細菌是雙歧桿菌時，可以特別地應用在本段中個體化的序列同一性。[0070]如 對技術人員來說顯而易見的，許多其他革蘭氏陽性細菌的PTS系統IIC組分的序列可以容易地從Genbank核苷酸數據庫檢索，例如通過用搜索字符串“PTS系統IIC組分”或任選地與所期望的革蘭氏陽性細菌的屬(例如“乳球菌屬”、“乳桿菌屬”、“明串珠菌屬”、“腸球菌屬”、“雙歧桿菌屬”等)或種(例如“乳酸乳球菌”、“格氏乳球菌” “魚乳球菌”、“植物乳球菌”、“棉子糖乳球菌”、“糞腸球菌”、“屎腸球菌”、“青春雙歧桿菌”、“兩歧雙歧桿菌”、“短雙歧桿菌”、“乳雙歧桿菌”等)的名稱組合的類似字符串查詢數據庫，或者通過用字符串“PTS系統IIC組分”或類似字符串來查詢此類細菌的經注釋的完整基因組序列。(還)未包括在公共數據庫時，此種序列可以通過基于序列同源性的分子生物學常規技術容易地鑒別。
[0071 ] 用于比較序列和確定序列同一性的方法是本領域中已知的。例如，序列同一性百分比是指比對這些序列之后在兩個序列之間相同核酸或氨基酸的百分比。可以用本領域已知的各種不同的程序和算法進行并計算比對和同一性的百分比。優選的比對算法包括BLAST (Altschul，1990 ;例如在 NCBI 網站可獲得)和 CLustal (在 Chenna, 2003 ;中綜述；例如在EBI網站可獲得)。優選地，BALST用于計算兩個序列之間同一性的百分比，例如由Tatusova 和 Maddenl999(FEMS Microbiol Lettl74:247-250)描述的“Blast2 序列”算法，例如使用以發表的默認設置或其他合適的設置(例如，對于BLASTN算法:打開空位的代價=5,延長空位的代價=2,錯配罰分=-2,匹配的獎勵=I,空位X_跌落(gapX_dropofT)=50，期望值=10.0，字大小=28 ;或者對于BLASTP算法:矩陣=Blosum62，打開空位的代價=11 ;延長空位的代價=1，期望值=10.0,字大小=3)。
[0072]PtcC的活性可以例如以基因測序的方法直接確定。在該方法中，可以容易地鑒別部分或完整的缺失、破壞或失活突變。
[0073]本文中使用的術語“缺乏PtcC活性”意指沒有或基本上沒有PtcC活性存在。通過進一步的指導，PtcC活性低于野生型革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)之PtcC活性的20%.例如，PtcC活性低于野生型PtcC活性的15%，優選低于10%，更優選低于5%，甚至更優選低于1%。之前表明的，最優選PtcC活性是無法檢測的或者基本上或完全缺乏。
[0074]本文中使用的術語“藥物”還涵蓋了術語“藥品”、“治療劑”以及用于醫藥領域以表明具有治療或預防效果之制劑的其他術語。
[0075]本文中使用的術語“治療”指治療處理和預防或防范措施，其中對象被預防或減緩(減少)不期望的生理學改變或障礙。本文中使用的術語“治療”等還包括改善或消除已發生的疾病或病癥(一旦其已經建立)或者緩和此類疾病或病癥的特征性癥狀。本文中使用的術語還涵蓋根據患者的病癥,預防疾病或病癥或者與疾病或病癥相關之癥狀的發病,包括在遭受所述疾病或病癥之前減緩疾病或病癥或與此相關的癥狀的嚴重程度。這樣的先于遭受的預防或降低是指向在施用時未遭受到疾病或病癥的患者施用本發明的化合物或組合物。“預防”還涵蓋預防病或病癥或與其相關之癥狀的復發或復發預防，例如在改善一段時間之后。
[0076]本文中使用的“營養品”通常涵蓋提供健康和醫療益處的食品和食品產品。營養品是可食用的并且可以被人直接吃掉，但優選以添加劑或營養補充劑的形式提供，例如以在健康食品商店出售的那類片劑的形式，或者作為可食用固體中的成分，更優選經加工的食品產品例如谷類、面包、豆腐、餅干、冰淇淋、蛋糕、馬鈴薯片，脆餅干(pretzel)，奶酪等，以及可飲用液體的形式如飲料，例如乳、蘇打水、運動飲料和果汁中。尤其優選的用于產生營養品的過程僅涉及天然來源的溶劑。營養品可以優選含有相對高水平的健康增強物質。營養品也可以混合使用，彼此增強其健康增強作用。
[0077]與營養品相反，所謂的“醫療食品”不意味著被普通公眾使用并且在商店和超市不可獲得。醫療食品不是那些包括在健康食物中以降低疾病之風險的食品，例如降低脂肪的食品(reduced-fat food)或低鈉食品,它們也不是減肥產品。當患者具有特別的營養需要以控制疾病或健康狀況時，醫生開出醫療食品，并且患者受到醫生的持續關注。標簽聲明該產品旨在用于控制特別的醫療疾病或病癥。醫療食品的實例是營養上多樣的醫療食品，其被設計為用于給具有慢性腸炎病癥的患者提供針對性的營養支持。該產品的活性化合物是例如本文中所述化合物的一種或更多種。功能性食品可以涵蓋那些包括在健康食物中以降低疾病之風險的食品，例如降低脂肪的食品或低鈉食品或減肥產品。
[0078]本文中使用的術語“益生菌”是指在腸腔(intestines camera)中幫助維持微生物(微生物群落)之天然平衡的細菌。另外，正常人體消化道含有降低有害細菌生長并促進消化系統健康的益生菌。腸道中最大的益生菌群是LAB。本文中使用的術語“益生菌組合物”是包含益生菌的組合物，優選可食用組合物。本文中使用的術語“益生菌組合物”可以與“飲食補充劑”互換使用。發現本文中所限定的益生菌組合物可用作食物和飲料的補充劑，以及用作用于經腸或腸胃外應用的藥物制劑，其可以是固體制劑(例如膠囊或片劑)，或液體制劑(例如溶液劑或懸浮劑)。這樣的制劑可以包括但不限制于:飲料(例如
Actimef, \-akult?, DanActi￥e?...)、酸奶飲料、酸奶、新鮮干酪、奶油、酸奶油等。
因此，應當理解益生菌或益生菌組合物可以是藥用或非藥用的應用。
[0079]術語“起子培養物”是指實際上進行發酵的微生物培養物。這些起子通常由培養基(例如已經被用于發酵的微生物良好定植的谷類、種子或營養液)組成。本文中使用的術語起子培養物優選地指高密度起子培養物。因此，起子培養物可以指包含活微生物的組合物，所述活微生物能夠起始或影響有機物質的發酵，任選地在單獨的起子培養基中培養之后以獲得高密度培養物。或者，起子培養物可以是干燥的、噴霧干燥的、冷凍的或冷凍干燥的。
[0080]如以上指出的，本發明人出人意料的發現在革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)中trePP的缺乏增強細胞內海藻糖積累。與此相反，先前認為異源性海藻糖6-磷酸磷酸酶和/或異源性海藻糖6-磷酸合酶(分別例如otsB和otsA)對細胞內海藻糖積累是必須的。
[0081]因此，在一個實施方案中，本發明涉及如本文中所述的缺乏海藻糖6-磷酸磷酸化酶活性的革蘭氏陽性細菌，優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌。
[0082]本文中使用的術語“海藻糖6-磷酸磷酸化酶”、“trePP”或“TrePP”涉及磷酸化海藻糖6-磷酸的酶，優選催化α，α-海藻糖-6-磷酸與磷酸產生葡萄糖-6-磷酸和β-D-葡萄糖-1-磷酸的反應(或反之亦然)(優選可逆反應)的酶。trePP的同義詞例如海藻糖-6-磷酸:磷酸β -D-糖基轉移酶和α，α -海藻糖-6-磷酸:磷酸β -D-糖基轉移酶。例如，乳酸乳球菌乳脂亞種MG1363的trePP之核酸和蛋白質序列分別如SEQ ID NO:1和
2(分別對應于 Genbank 登錄號 NC_009004.1 (區域 449195-451504)和 YP_001031805.1)所示。在一個實施方案中，本文所使用的trePP涉及基因或蛋白質，其分別具有SEQ ID NO:1和2的核酸或氨基酸序列，或者具有編碼SEQ ID NO:2的核酸。在另一個實施方案中，本文所使用trePP涉及具有分別與SEQ ID NO:1和2有至少75%同一性(例如至少75 %、80%、85%、90%、95%或更高％同一性)之核酸或氨基酸序列的基因或蛋白質。在另一個實施方案中，本文所使用trePP編碼與SEQ ID NO:2有至少75%同一性(例如至少75%、80%、85%、90%、95%或更高％同一性)的蛋白質。優選地，上述序列涉及或編碼功能性trePP蛋白。在另一個實施方案中，本文所使用的trePP是SEQ ID NO:1和2的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)直系同源物。
[0083] 可以直接或間接測量trePP的活性。間接確定活性的一種方法是借助基因測序。在這個方法中，可容易地鑒別部分或完全缺失、破壞或失活突變。確定活性的直接方法可例如基于用細胞提取物的測定，其中測量底物消耗或反應產物形成(例如，底物海藻糖6-磷酸或反應產物葡萄糖-6-磷酸和β-D-葡萄糖-1-磷酸)，可能先前的代謝標簽組合。還可通過例如高效陰離子交換色譜法(HPAEC)容易地確定底物和產物，例如Andersson等2001(見上)的描述。本文中使用的術語“缺乏TrePP活性”意味著不存在或基本上不存在TrePP活性。通過進一步的指導，TrePP活性低于野生型革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)之PtcC活性的20%。例如，TrePP活性低于野生型TrePP活性的15%，優選低于10 %，更優選低于5 %，甚至更優選低于I %。如之前指出的，最優選TrePP活性是無法檢測的或者基本上或完全不存在。
[0084]本發明人已經發現異源性海藻糖6-磷酸合酶和/或異源性海藻糖6-磷酸磷酸酶的存在還可以增強細胞內海藻糖積累。因此，在一個實施方案中，本發明涉及如本發明所述的含有功能性異源性海藻糖6-磷酸磷酸酶的革蘭氏陽性細菌，優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌。在另一個實施方案中，本文中所述的革蘭氏陽性細菌，優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌含有功能性異源性海藻糖6-磷酸合酶。還在另一個實施方案中，本文中所述的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)含有功能性異源性海藻糖6-磷酸合酶并含有功能性異源性海藻糖6-磷酸磷酸酶。在一些優選的實施方案中，海藻糖6-磷酸合酶是otsA，優選來自大腸桿菌的otsA。在另一個優選的實施方案中，海藻糖6-磷酸磷酸酶是otsB,優選來自大腸桿菌的otsB。
[0085]特別優選的是海藻糖6-磷酸磷酸酶和/或合酶的基因組整合，其中所述整合優選如具有申請號為11168495.7和11173588.2的歐洲專利申請所公開。這些申請涉及涉及雙順反子表達系統并且通過參考以其整體并入本文。如本文中使用的海藻糖6-磷酸磷酸酶(優選otsB)和/或海藻糖6-磷酸合酶(優選otsA)的優選位置為作為在內源性usp45基因之后的第二順反子。
[0086]本文中使用的術語“含有”優選涉及表達特定基因產物的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)，即在所述革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)中產生功能性或活性蛋白質。
[0087]本文所使用的術語“海藻糖6-磷酸磷酸酶”涉及使海藻糖6-磷酸去磷酸的酶，優選催化海藻糖-6-磷酸產生磷酸和海藻糖之反應的酶。海藻糖6-磷酸磷酸酶屬于磷酸單酯水解酶家族。海藻糖6-磷酸磷酸酶的同義詞例如α，α海藻糖-6-磷酸磷酸水解酶、海藻糖-6-磷酸磷酸水解酶和海藻糖6-磷酸酶。例如，大腸桿菌的海藻糖6-磷酸磷酸酶(即otsB)的核酸和蛋白質序列分別如SEQ ID NO:3和4所示(分別對應于Genbank登錄號X69160.1(核苷酸位置675-1475)和P31678.2)。在一個實施方案中，本文中使用的術語海藻糖6-磷酸磷酸酶涉及基因或蛋白質，其分別具有SEQ ID NO:3和4的核酸或氨基酸序列，或者具有編碼SEQ ID NO:4的核酸。在另一個實施方案中，本文中所使用的海藻糖6-磷酸磷酸酶涉及具有分別與SEQ ID NO:3和4有至少75%同一性(例如至少75%、80%、85%、90%、95%或更高％同一性)之核酸或氨基酸序列的基因或蛋白質。在另一個實施方案中，本文中所使用的海藻糖6-磷酸磷酸酶編碼與SEQ ID NO:4有至少75%同一性(例如至少75%、80%、85%、90%、95%或更高％同一性)的蛋白質。優選地，上述序列涉及或編碼功能性海藻糖6-磷酸磷酸酶蛋白。在另一個實施方案中，本文所使用的海藻糖6-磷酸磷酸酶是SEQ ID NO:3和4的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)直系同源物。
[0088]本文 中使用的術語“海藻糖6-磷酸合酶”涉及使海藻糖6-磷酸去磷酸化的酶，優選催化葡萄糖6-磷酸與UDP-葡萄糖反應產生海藻糖6-磷酸之反應的酶。海藻糖6-磷酸合酶屬于糖基轉移酶家族。海藻糖6-磷酸合酶的同義詞例如海藻糖磷酸-尿苷二磷酸糖基轉移酶、磷酸海藻糖-尿苷二磷酸轉葡糖基酶、尿苷二磷酸葡萄糖磷酸糖基轉移酶，和α，α-海藻糖-6-磷酸合酶。例如，大腸桿菌的海藻糖6-磷酸合酶(即otsA)的核酸和蛋白質序列分別如SEQ ID NO:5和6所示(分別對應于Genbank登錄號Χ69160.1 (核苷酸位置1450-2874)和Ρ31677.3)。在一個實施方案中，本文中使用的術語海藻糖6-磷酸合酶涉及基因或蛋白質，其分別具有SEQ ID NO:5和6的核酸或氨基酸序列，或者具有編碼SEQ IDΝ0:6的核酸。在另一個實施方案中，本文中所使用的海藻糖6-磷酸合酶涉及具有分別與SEQ ID NO:5和6有至少75%同一性(例如至少75%、80%、85%、90%、95%或更高％同一性)之核酸或氨基酸序列的基因或蛋白質。在另一個實施方案中，本文中所使用的海藻糖6-磷酸合酶編碼與SEQ ID NO:6有至少75%同一性(例如至少75%、80%、85%、90%、95%或更高％同一性)的蛋白質。優選地，上述序列涉及或編碼功能性海藻糖6-磷酸合酶蛋白。在另一個實施方案中，本文中所使用的海藻糖6-磷酸合酶是SEQ ID NO:5和6的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)直系同源物。
[0089]可使用本領域已知的任意方法獲得缺乏PtcC和/或TrePP活性并且任選含有根據本發明的異源性基因或基因產物(例如海藻糖6-磷酸合酶或磷酸酶或預防性和/或治療性異源性基因或基因產物)的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)，使用分子生物學方法實現，或通過天然變體或從隨機化學或放射誘變獲得的變體的高通量篩選獲得。(可通過使用在海藻糖上不生長的trePP缺陷菌株的方法或者通過trePP直系同源物的高通量測序和生物學分析或其他方法進行trePP KO的高通量篩選)。(對于涉及LAB之重組技術和遺傳操作的背景參見例如"Genetics and Biotechnology of Lactic AcidBacteria" , Gasson&de Vos 編輯，Blackie Academic&Professional, 1994 和"Geneticsof Lactic Acid Bacteria"，Wood&Warner 編輯，Springer, 2003”)在實施方案中，在根據本發明的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)中，編碼內源性PtcC和/或TrePP和/或啟動子(trePP和/或ptcC通過所述啟動子表達)的基因已經被部分地或完全地缺失、破壞或失活，例如變得不能產生功能性PtcC和/或trePP基因產物。用于基因破壞的技術是本領域中公知的。例如，可通過完全或部分移除編碼區(敲除)或作為替代地完全或部分移除或誘變啟動子區來失活內源性PtcC和/或trePP基因。或者，可以插入失活(敲入)ptcC和/或trePP基因，從而破壞內源性編碼序列。例如，可以引入早熟終止密碼子(premature stop codon)或框移突變。還可以通過引入一個或更多個錯義或無義突變來誘變PtcC和/或trePP基因，只要功能性PtcC和/或TrePP可不再或基本不再產生(即PtcC和/或trePP活性(基本上)不存在)即可。應當理解，還涵蓋自發的突變。
[0090]本發明人還發現，過表達一種或更多種海藻糖轉運蛋白還增強革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)中細胞內海藻糖積累和/或保持。因此，在一個實施方案中，本發明涉及過表達(優選組成型過表達)一種或更多種編碼海藻糖轉運蛋白之基因的革蘭氏陽性細菌，優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌(如本文中所述的)。在一個優選的實施方案中，海藻糖轉運蛋白是革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)的內源性海藻糖轉運蛋白。在另一個優選的實施方案中，海藻糖轉運蛋白是位于革蘭氏陽性細菌優(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)之海藻糖操縱子中的內源性海藻糖轉運蛋白。在另一實施方案中，海藻糖轉運蛋白是位于革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)之海藻糖操縱子內的磷酸轉移酶系統(PTS)的內源性海藻糖轉運蛋白。在一個優選的實施方案中，通過向一種或更多種轉運蛋白的5'插入啟動子使得啟動子與轉運蛋白序列可操作地連接來完成一種或更多種本文中所述的海藻糖轉運蛋白的過表達。可操作地連接是指毗鄰(juxtaposition),其中這樣描述的組件處于允許他們以其預期的方式發揮功能的關系中。啟動子序列與編碼序列“可操作地連接”至是以這樣的方式連接，使得在與啟動子序列相容的條件下實現編碼序列的表達。在一個實施方案中，所述啟動子是強啟動子。在另一個實施方案中，所述啟動子是組成型啟動子。還在另一個實施方案中，所述啟動子是內源性革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)啟動子。合適的啟動子可見于例如W02008/084115，其以其整體并入本文。特別地，2008/084115的表12中所列的啟動子特別適合過表達本文中所述的轉運蛋白。最優選地，啟動子是PhIIA(即HU-樣DNA結合蛋白的啟動子)。因此，在一個優選的實施方案中，PhIIA啟動子被插入到位于革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)之海藻糖操縱子中的內源性海藻糖轉運蛋白之編碼區的上游。在一個實施方案中，PhIIA啟動子具有SEQ ID NO: 13的序列，對應于乳酸乳球菌乳脂亞種MG1363的PhIIA啟動子。在另一個實施方案中，PhIIA啟動子具有與SEQ ID NO:13有至少75%同一性，例如與SEQ ID NO:13有至少75%、80%、85%、90%、95%或更高同一性的序列。在另一個實施方案中，PhIIA是SEQ ID NO:13的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)直系同源物。
[0091]例如，本文所指的海藻糖轉運蛋白分別由SEQ ID NO:9和10 (分別對應于Genbank登錄號 NC_009004.1 (區域 446937-447422)和 ΥΡ_001031803.1)，和 / 或 SEQ ID NO:11 和12 (分別對應于 Genbank 登錄號 NC_009004.1 (區域 447563-449128)和 ΥΡ_001031804.I)的乳酸乳球菌乳脂亞種MG1363核酸和氨基酸序列代表。在一個實施方案中，本文中所使用的過表達的轉運蛋白涉及基因或蛋白質，其分別具有SEQ ID NO:9和10和/或分別具有SEQ ID NO: 11和12的核酸或蛋白質序列，，或者具有編碼SEQ ID NO: 10和/或SEQ IDNO: 12的核酸序列。在 另一個實施方案中，本文中所使用的過表達的轉運蛋白涉及基因或蛋白質，其具有分別與SEQ ID Ν0:9和10，和/或分別與SEQ ID NO:11和12有至少75%同一性(例如75%、80%、85%、90%、95%或更高％同一性)的核酸或氨基酸序列。在另一個實施方案中，本文中所使用的過表達的轉運蛋白編碼蛋白質，其具有與SEQ ID Ν0:10和/或SEQ ID NO:12至少75%的同一性(例如75%、80%、85%、90%、95%或更高％的同一性)。優選地，上述序列涉及編碼(a)功能性過表達的(優選組成型過表達的)轉運蛋白蛋白質。在另一個實施方案中，本文所使用的(組成型)過表達的轉運蛋白是SEQ ID N0:9和10和/或SEQ ID NO:11和12的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)直系同源物。
[0092]本文中所述的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)示出針對多種與環境和貯藏相關的損害和脅迫的提高的耐受，例如提高的干燥、噴霧干燥、冷凍、或冷凍干燥抗性，并且針對在胃腸道中的苛刻條件(例如酸和膽汁鹽)的提高的抗性。因此，根據本發明的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)特別適合于被施用至對象同時在腸道中示出提高的存活率。因此，這些革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)還可應用于將蛋白質遞送至對象。因此，在一個實施方案中，本發明涉及本文中所述的含有一種或更多種異源性基因產物(優選一種或更多種預防性和/或治療性基因產物和/或抗原)的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)。生物活性多肽的遞送已經例如描述于 TO97/14806、TO00/23471、TO0I/02570、TO02/090551、TO2005/111194、TO2007/025977、W02007/063075, W02007/128757, W02008/07175U W02008/090223, W02004/046346 和W02010/034844。優選地，本文中所述的異源性基因并入到細菌基因組。特別優選的并入策略公開于專利號為11168495.7和11173588.2的歐洲專利申請，其通過引用以其整體并入本文。特別地，異源性基因可以多順反子地(例如雙_、三-或多-順販子地)作為在天然(內源性)基因座(優選操縱子)中的第二(或另外的)基因來插入。以這種方式，異源性基因在天然(內源性)啟動子的控制下表達。
[0093]本文中使用的術語“抗原” 一般是指引起免疫應答(包括體液免疫和/或細胞免疫應答)的物質，并且其能夠與免疫應答的產物(例如抗體或T細胞)結合。本文中所預期內的抗原可以作為替代地例如是為了誘導免疫耐受，例如可以是自身抗原(包括自身抗原和同種異體抗原)或可以是變應原。因此，在一個優選的實例中，抗原需要其所施用對象的功能性免疫系統以從這樣的對象中引起生理應答。本文中所預期的“抗原”還涵蓋“自身抗原”，其不會在一個健康的個體中引起免疫應答，但會在患有自身免疫疾病的人中引起免疫應答，即器官無法識別其自己的組成部分(下至亞分子水平)為“自身”，其導致針對其自身細胞和組織的免疫應答。由這樣的異常免疫應答導致的任何疾病被稱為自身免疫疾病。因此，本文中所預期的“抗原”還涵蓋(生理活性)蛋白質，其不會在健康個體中引起免疫應答但會在所述蛋白質遺傳缺陷的個體中引起免疫應答。此外，本文中所預期的“抗原”還涵蓋變應原，其在健康個體中不引起免疫應答但將在患有過敏性疾病的患者中引起免疫應答。
[0094]本文中所預期的抗原可以源自任意多肽，在人或動物對象中的免疫應答對其將會是治療上有用的，例如來自病原體，例如來自病毒、原核(如細菌)或真核病原體，來自非生理蛋白質(例如癌組織來源的蛋白質)，來自變應原(例如，用于引發免疫耐受)等。抗原還可以是蛋白質的代謝物。例如，抗原可以是多糖、脂質等。本文中所述的強啟動子可以驅動表達必須的酶來合成或組裝所述多糖、脂質等。
[0095] 術語“預防性和/或治療性基因產物”，多肽或蛋白一般是指肽、多肽或蛋白質，其所施用的人或動物對象中不引發針對其自身的免疫應答(即非疫苗發生性(non-vaccinogenic))并且能實現治療和/或治療效果。因此，將期望這樣的肽、多肽或蛋白質的預防性和/或治療性效果直接與其天然的生物學功能相關，從而它可在對象的身體中實現特定的效果，而不是通過在對象中充當免疫原性和/或免疫保護性抗原來產生預防性和/或治療性效果。因此，非疫苗發生性的預防性或治療性活性肽、多肽或蛋白質在其表達形式中將會是生物活性的或至少一旦從表達宿主細胞釋放必須轉變成生物活性形式。優選地，所述肽、多肽或蛋白質的這種生物學活性形式可以顯示二級并且還優選三級構象，這與其天然構造相同或密切相似。
[0096]優選地，預防性和/或治療性基因產物、多肽或蛋白質還是無毒的并且非致病性的。在一個優選的實施方案中，預防性和/或治療性基因產物、多肽或蛋白質可以源自人或動物，并且可以優選對應于與所施用的人或動物對象相同的分類單位(taxon)。
[0097]合適的預防性和/或治療性基因產物、多肽或蛋白質包括能夠局部地或全身性地發揮功能的那些，例如能夠發揮影響局部或整個身體代謝的內分泌活性，和/或能夠調節屬于免疫造血系統之細胞的活性，和/或能夠影響身體中多種正常或腫瘤細胞的活力、生長和分化或影響免疫調節或對損傷或感染之急性期炎性應答的誘導，和/或能夠增強或誘導對由趨化因子作用于其靶細胞受體所介導之細胞和組織感染的抗性或表皮細胞的增殖或對傷口愈合的促進，和/或能夠調節體內細胞表達或產生物質。這樣的肽、多肽或蛋白質的特定實例包括但不限于胰島素、生長激素、催乳激素、降鈣素、黃體生成素、甲狀旁腺激素、生長抑素、促甲狀腺激素、血管活性腸多肽、細胞因子(例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-1U IL-12、IL-13、IL-14 至 IL-32 的任一種，特別是 IL-27、GM-CSF、M-CSF、SCF、IFN、EPO、G-CSF、LIF、OSM、CNTF、GH、PRL、細胞因子的 TNF 家族(例如，TNFa ,TNFa、⑶40、⑶27或FAS配體)、細胞因子的IL-1家族、成纖維細胞生長因子家族、血小板衍生生長因子、轉化生長因子和神經生長因子、細胞因子的表皮生長因子家族、胰島素相關的細胞因子等。或者，預防性和/或治療性活性多肽可以是用于以上限定的預防性和/或治療性活性多肽的受體或拮抗劑。或者，預防性和/或治療性活性多肽可以是抗體，例如中和抗體，或其類似物。這樣的合適的多肽的另外的特定實例列在例如W096/11277第14頁第1-30行，其通過參考并入本文；W097/14806第12頁第I行直到第13頁第27行，其通過參考并入本文；或US5，559，007，第8欄第31行直至第9欄第9行，其通過參考并入本文。在一個實例中，所述非疫苗發生性預防性和/或治療性活性肽、多肽或蛋白質可以是 IL-10,更優選 hIL-ΙΟ、胰高血糖素樣肽 I (glucagon-like peptide-1, GLP-1)、更優選hGLP-Ι、胰高血糖素樣肽 2 (glucagon-like peptide-2，GLP-2)、更優選 hGLP-2、三葉因子(trefoil factor, TFF，例如 TFFl、2 和 / 或 3)或 PYY，更優選 hPYY。
[0098]如提到的，在一些實施方案中，預防性和/或治療性活性多肽可以是抗體，例如中和抗體或其類似物。本文中所述的抗體可以是完整大小抗體或其功能性片段，例如Fab、融合蛋白或多聚體蛋白。在一個優選的實施方案中，一種或更多種異源性基因編碼抗體或功能性抗體片段。本文所使用的術語“功能性”是指抗體片段，其仍可以發揮其預期的功能，即抗原結合。本文中所使用的術語抗體可以包括但不限于常規抗體、嵌合抗體、dAb、雙特異性抗體、三特異性抗體、多特異性抗體、二價抗體、三價抗體、多價抗體、VHH、納米抗體、Fab、Fab'、F(ab' )2、scFv、FV、dAb、Fd、雙抗體(diabody),三抗體(triabody)、單鏈抗體、單結構域抗體(single domain antibody)、單個抗體可變結構域。[0099]在本發明的上下文中，術語“抗體”用于描述免疫球蛋白(無論是天然的或者部分地或整體地經改造的)。可用多種方式修飾抗體，術語抗體應當解釋為涵蓋任意特異性結合分子或物質，其具有用于針對分子對之另一成員(即如上所限定的靶分子)的特異性結合所需的結合結構域。因此，該術語涵蓋抗體片段、衍生物、功能等價物和抗體的同源物，以及單鏈抗體、雙功能抗體、二價抗體、VHH、納米抗體、Fab、Fab'、F(ab' )2、scFv、FV、dAb、Fd、雙抗體，三抗體和駱駝科(camelid)抗體，包括包含免疫球蛋白結合結構域的任意多肽(無論是天然的或者整體地或部分地經改造的)。因此，包括了包含融合至另一多肽的免疫球蛋白結合結構域或等價物的嵌合分子。該術語還涵蓋了具有是抗體結合結構域或與其同源之結合結構域的任意多肽或蛋白質，例如抗體模擬物。抗體的實例是免疫球蛋白同種型以及其同種型亞家族，包括 IgG(IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4)、IgA、IgD、IgM 和 IgE0 因此，本領域技術人員將理解本發明還涉及包含抗原結合結構域的抗體片段，例如VHH、納米抗體、Fab、scFv、Fv、dAb、Fd、雙抗體和三抗體。在一個實施方案中，本發明涉及本文中所述的革蘭氏陽性細菌或重組核酸，其中一個外源基因編碼抗體之輕鏈(\)或其功能性片段，并且另一個外源基因編碼抗體之重鏈(Vh)或其功能性片段，更優選其中所述功能性片段是Fab。在一個實施方案中，編碼\或其功能性片段的外源基因與編碼Vh或其功能性片段之外源基因的3'端在轉錄上相偶聯(transcriptionally coupled)。
[0100] 在一個實施方案中，本文中所述的(中和)抗體至少部分地或完全地阻斷、抑制或中和目的分子(例如細胞因子或趨化因子或毒素)的生物學活性。本文中使用的表述“中和”意味著在體內或體外通過本領域已知的(例如實施例中詳述的)方法測量的細胞因子或毒素之生物學活性的抑制或降低。特別地，可以通過在組織或血液樣品中確定結腸炎評分(colitic score)或通過確定靶分子來測量所述抑制或降低。本文中使用的表述“中和”意指在體內或體外測量的細胞因子或毒素的生物學活性被抑制或降低至少10%或更多，優選至少 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 以及甚至更優選 100%。
[0101]優選地，所述抗體或其功能性片段抑制選自以下名單的細胞因子的生物學作用:IL-1 β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12 (或其亞基 IL_12p35 和 IL12p40)、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL_23(或其亞基 IL_23pl9)、IL-27、IL_32(及其剪切變體)、IFN(a、β、Υ)和TNFa。或者，這些細胞因子可以被不是抗體的結合分子抑制。優選地，所述結合分子是可溶性細胞因子受體(例如gpl30)或與所述細胞因子的受體結合而不觸發炎性信號，所述受體例如IL-2R(CD25、CD122、CD132)、IL_12R(3 1、β2)、IL15R、IL-17R、IL-23R或IL-6R。優選地，所述結合分子中和選自以下名單的趨化因子:MIF、MIP-1 a、MCP-K RANTES和嗜酸性粒細胞活化趨化因子(Eotaxin)。優選地，所述結合分子經結合選自以下名單的共刺激分子解決對免疫激活的阻斷:CD3/CD28、HVEM、B7.1/B7.2、CD40/CD40L (CD154)、IC0S/IC0SL、0X40/X40L、CD27/CD27L (CD70)、CD30/⑶30L(⑶153)和41BB/41BBL。優選地所述結合分子經結合選自以下名單的黏附分子解決對炎癥的阻斷:I_CAM1、α 4整合素和α 4β 7整合素。優選地，所述結合分子對⑶3、CTLA4和/或PDl具有共刺激或激動作用。優選地所述結合分子通過靶向⑶25、⑶20、⑶52、⑶95、BAFF, APRIL和/或IgE來中和T細胞或B細胞活性。優選地，所述結合分子經與來自MMP家族的酶結合來解決對炎癥的阻斷。優選地，所述結合分子發揮抗血管發生作用，例如中和0^^3/^50 1和幾-8活性。在另一個優選的實施方案中，所述結合分子或抗體(或功能性片段)能夠中和TNF α、IL-12、IFN y、IL-23或IL-17的生物學作用。
[0102]在本文中所述的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)中可用作異源性基因的抗體或結合分子的非限制性實例包括:
[0103]-抗TNFa抗體、抗TNFα抗體片段、抗TNF a單個抗體可變結構域、可溶性TNF受體或TNF a的顯性失活變體；
[0104]-抗IL-12抗體、抗IL-12抗體片段、抗IL-12單個抗體可變結構域、可溶性IL-12受體、IL-12或IL-12dAb的顯性失活變體；
[0105]-抗IL-12p35抗體、抗IL_12p35抗體片段、抗IL_12p35單個抗體可變結構域、可溶性IL-12p35受體、IL-12p35或IL_12p35dAb的顯性失活變體；
[0106]-抗IL-12p40抗體、抗IL_12p40抗體片段、抗IL_12p40單個抗體可變結構域、可溶性IL-12p40受體、IL-12p40或IL_12p40dAb的顯性失活變體；
[0107]-抗IL-23抗體、抗IL-23抗體片段、抗IL-23單個抗體可變結構域、可溶性IL-23受體、IL-23或IL-23dAb的顯性失活變體；
[0108]-抗IL-23pl9抗體、抗IL_23pl9抗體片段、抗IL_23pl9單個抗體可變結構域、可溶性IL-23pl9受體、IL-23pl9或IL_23pl9dAb的顯性失活變體；
[0109]-抗IFNY抗體、抗IFN Y抗體片段、抗IFN Y單個抗體可變結構域、可溶性IFN Y受體或IFN Y的顯性失活變體；
[0110]-抗IL-17抗體、抗IL-17抗體片段、抗IL-17單個抗體可變結構域、可溶性IL-17受體、IL-17或IL-17dAb的顯性失活變體；以及
[0111]-抗MCP-1抗體、抗MCP-1抗體片段、抗MCP-1單個抗體可變結構域、可溶性IL-17受體、MCP-1或MCP-1dAb的顯性失活變體。
[0112]在一個優選的實施方案中，所述抗體是Fab片段(結合抗原的片段)Fab是本領域中公知的。通過進一步的指導，Fab片段是與抗原結合之抗體上的區域。它由每個重鏈和輕鏈的一個恒定結構域和一個可變結構域組成。
[0113]在一個實施方案中，該Fab是cA2抗TNF Fab (其重鏈和輕鏈的可變結構域的多核苷酸和多肽序列在US6, 790，444中分別作為SEQ ID NO:4和5 (重鏈)和SEQ ID NO:2和3(輕鏈)公開)或CDP870抗TNF Fab (其重鏈和輕鏈的多核苷酸和多肽序列在W001/94585中分別作為SEQ ID NO:114和115(重鏈)和SEQ ID NO:112和113(輕鏈))公開。
[0114]技術人員將會理解，作為功能性抗體片段以及特別是Fab片段的抗體是由通過二硫鍵共價連接的不同個體多肽構成。特別地，通過獨立的個體編碼序列來編碼重鏈和輕鏈。
[0115]因此，在一個實施方案中，本文中公開的異源性基因編碼抗原和/或(中和)抗體或功能性片段或其變體和/或預防性和/或治療性活性肽、多肽或蛋白質，其中所述抗原能夠在人或動物對象中引發免疫應答，優選保護性免疫應答或免疫耐受應答，和/或所述預防性和/或治療性基因產物、多肽或蛋白質能夠在人或動物對象中產生預防性和/或治療性效果。
[0116]在一個實施方案中，本發明涉及本文中所述的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)或用于本文中所述用途的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)，其被配制用于貯 存。特別地，在一個實施方案中，本發明涉及本文中所述的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)，其是冷凍的、干燥的、冷凍干燥的、噴霧干燥的或貯存在介質中。
[0117]如先前解釋的，本發明還涉及包含本文中所述的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)或者包含用于本文中所述用途之革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)的組合物。這樣的組合物可以是藥物組合物。在另一個實施方案中，本發明涉及組合物或藥物組合物，其用于治療或用作藥物、營養品、醫療食品、功能性食品、益生菌組合物、食品添加劑或起子培養物。在另一個實施方案中，本發明涉及這樣的組合物或藥物組合物作為藥物、營養品、醫療食品、功能性食品、益生菌、食品添加劑、起子培養物的用途，或者用于制備藥物、營養品、醫療食品、功能性食品、益生菌組合物、食品添加劑、起子培養物的用途。
[0118]如本文中所使用的，本文中所述的藥物組合物(例如藥物制劑、營養品、醫療或功能性食品或益生菌)優選地包含治療有效量的本發明之革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)以及可藥用載體(即一種或更多種可藥用載劑物質和/或添加劑)，例如緩沖劑、載劑、賦形劑、穩定劑等。本文所使用的術語“可藥用”與本領域一致并且意指與藥物組合物中的其他成分相容，并且對其接受者無害。
[0119]在一個實施方案中，藥物組合物包含治療有效量的本文中所述的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)。術語“治療有效量”是指在對象(例如人或動物)中有效地治療疾病或病癥的治療物質或組合物的量，即獲得期望的局部或全身作用和性能。例如，細菌的治療有效量可以例如在單一或重復劑量中包含至少I個細菌、或至少10個細菌、或至少IO2個細菌、或至少IO3個細菌、或至少IO4個細菌、或至少IO5個細菌、或至少IO6個細菌、或至少IO7個細菌、或至少IO8個細菌、或至少109、或至少10'或至少1011、或至少1012、或至少1013、或至少1014、或至少IO15或更多宿主細胞，例如細菌。本發明的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)可以單獨施用或與一種或更多種活性化合物組合施用。后者可以在施用根據本發明的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)之前、之后或與其同時施用。
[0120]優選地，本文中所述的蘭氏陽性菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)或包含這些蘭氏陽性菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)的組合物以單位劑量形式提供，例如片劑、膠囊、灌腸劑或定量氣霧劑(metered aerosol dose),使得向對象(例如人或動物患者)施用
單一劑量。
[0121]活性成分可以一天施用I至6次，充分地展示出期望的活性。這些每日劑量可以作為單一劑量每日一次給予，或在一天中的相同或不同的時間給予兩個或更多個更小的劑量，其總計給予指定的日劑量。優選地，所述活性成分一天施用一次或兩次。例如，可以在早晨接受一個劑量并且當天晚些時候接受一個劑量。
[0122]在本發明的所有方面中，可以給予患者每日維持劑量持續臨床上需要的周期，例如I天至幾年(例如哺乳動物整個剩余的生命)，例如從約(2或3或5天、I或2周或I個月)以上和/或例如長達約(5年、I年、6個月、I個月、I周或3或5天)。每日維持劑量的施用持續約3至約5天或持續約I周至約I年是典型的。流體制劑的其他組分可以包括防腐劑、無機鹽、酸、堿、緩沖劑、營養物質、維生素或其他藥物。
[0123]本文中所教導的人和動物對象可以指需要治療或處理的人或動物，所述治療或處理包括向所述人或動物施用治療有效量的本文中所教導的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)。動物可以優選為溫血動物，更優選脊椎動物，甚至更優選哺乳動物，例如家畜、農場動物、動物園動物、運動動物、寵物和實驗動物，例如狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛；靈長類動物，例如猿、猴、猩猩、黑猩猩；犬科動物，例如狗和狼；貓科動物，例如貓、獅和虎；馬科動物，例如馬、驢和斑馬；肉用動物如牛、豬、綿羊；有蹄類動物，例如鹿和長頸鹿；嚙齒動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠等。一般而言，術語“對象”或“患者”可以互換使用并且特別地指動物，優選溫血動物，更優選脊椎動物，甚至更優選哺乳動物，仍然更優選靈長類動物，并且特別地包括人患者和非人動物、哺乳動物和靈長類動物。優選的患者可以是人對象。
[0124]在人或動物中通過遞送本文中所述的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)(任選的表達預防性和/或治療性肽、多肽、或蛋白質)的可治療疾病之類型的非限制性實例還包括但不限于:例如炎性腸病，包括克羅恩氏病(Crohn’ s disease)和潰瘍性結腸炎(可用例如IL-1ra或IL-10或IL-27或三葉肽治療);自身免疫性疾病，包括但不限于I型糖尿病、銀屑病、類風濕性關節炎，系統性紅斑狼瘡(可用例如IL-1ra或IL-10或IL-27或相關的自身抗原治療)；變應性性疾病包括但不限于哮喘、食物變態反應(可用相關的變應原治療)，乳糜瀉(celiac disease，可用谷蛋白變應原和/或IL-27治療)；神經疾病，包括但不限于阿爾茨海默病、帕金森病和肌萎縮性側索硬化癥(可用例如腦源性神經營養因子(brain devated neurotropic factor)和睫狀神經營養因子(ciliaryneurotropic factor)治療)；癌癥(可用IL-1、集落刺激因子或干擾素-W治療)；骨質疏松癥(可用例如轉化生長因子F3治療)；糖尿病(可用例如胰島素治療)；心血管疾病(可用組織血纖維蛋白溶酶原活化因子治療)；動脈粥樣硬化(可用例如細胞因子和細胞因子拮抗劑治療)；血友病(可用例如凝血因子治療)；退行性肝疾病(可用例如肝細胞生長因子或干擾素a治療)；肺疾病，例如囊腫性纖維化(可用例如α-抗胰蛋白酶治療)；肥胖；病原體感染，例如病毒或細菌感染(可用任意數目的以上提到的組合物或抗原治療)；等。[0125]根據本發明的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)還可用于治療傳染病。在一個實施方案中，用經根據本發明革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)局部地產生或分泌的毒素中和抗體可獲得針對梭狀芽孢桿菌(Clostridium)相關的疾病(優選艱難梭狀芽孢桿菌相關的疾病(Clostridium dificileassociated disease,CDAD))的被動免疫。CDAD是通過兩種外毒素介導的，毒素A (腸毒素，參見例如GenbankNC_009089.1，區域795843..803975的DNA序列或YP_001087137.1的蛋白質序列)和毒素B (細胞毒素，參見例如 NC_009089.1，區域:787393.794493 的 DNA 序列或 YP_001087135.1的蛋白質序列)。二者都是與腸上皮細胞結合的高分子質量蛋白質，當它們被內化并催化胞質rho蛋白的糖基化時導致細胞死亡、炎癥和腹瀉。它們還參與了促進艱難梭狀芽孢桿菌(C.difficile)毒力、定植、以及中性粒細胞趨化和活化。該細菌自身不是侵入性的并且不引起組織損害。通過用抗體中和艱難梭狀芽孢桿菌毒素，病原體的致病機制被阻斷，其在腸道中繁盛的能力可被削弱，而對微生物生態的影響可以降到最低，允許正常微生物群落恢復。該方法的醫療優勢可包括更迅速的恢復、更少的復發、并在正常腸道菌群中緩解抗生素抗性選擇壓力。因此，在一個優選的實施方案中，本文中所述的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)還含有、表達、產生和/或分泌的中和抗體，所述中和抗體針對梭狀芽孢桿菌(優選艱難梭狀芽孢桿菌)毒素A和/或毒素B，其中這些毒素各自優選具有以上指出的序列。技術人員讀者將會理解，除了全長抗體之外，可以使用如本文中其他地方描述的多種功能性片段或經修飾或變體抗體。
[0126]技術人員讀者將理解，本文中明確記載的疾病僅是示例性的并且其記載絕非旨在將本文中所教導的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)的用途限制到這些具體的疾病。相反，技術人員讀者理解，本文中公開的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)原則上可用于表達任何目的表達產物(優選多肽)，其不僅可以與所記載的那些相關而且可以與人和動物中多種另外的疾病或病癥相關。因此，一旦合適的表達產物(優選多肽，例如抗原和/或預防性和/或治療性基因產物(多肽或蛋白質))已經被選定或確定用于給定的疾病(ailment)，技術人員將能夠使用本發明的試劑來實現其表達、分離和/或遞送。
[0127]本發明的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)可以懸浮在藥物制劑中用于向患有待治療之疾病的人或動物施用。這樣的藥物制劑包括但不限于活宿主細胞和適合于施用的介質。重組宿主細胞可以在常規賦形劑(例如乳糖、其他糖、堿和/或堿土硬脂酸鹽、碳酸鹽和/或硫酸鹽(例如，硬脂酸鎂、碳酸鈉和硫酸鈉)、高嶺土、二氧化硅、香料(fIavorant)和香味劑(aroma))的存在下凍干。
[0128]如此凍干的根據本發明的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)可以以膠囊、片劑、顆粒劑和散劑的形式制備，其各自可通過經口途徑施用。
[0129]或者，一些革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)可以在合適的介質中配制成水懸浮液或者凍干的細菌可以臨用前混懸在合適的介質中，這樣的介質包括本文中提到的賦形劑或其他賦形劑(例如葡萄糖、甘氨酸和糖精鈉)。
[0130]對于經口施用，可配制胃抗性經口劑型，該劑型(gastroresistant oral dosageform)可以包括提供革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)的控制釋放的化合物，并且由此提供其中所編碼的所期望蛋白質的控制釋放。例如，該經口劑型(包括片劑、微丸(pellet)、顆粒劑和散劑)可以用賦形劑(通常為聚合物、纖維素衍生物和/或親脂性物質)的薄層進行包衣，所述賦形劑抵抗胃中(但不抵抗腸中)的溶解和破壞，從而允許通過胃，有利于在腸中的崩解、溶出和吸收。
[0131]經口劑型可以設計為允許革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)(以及任選的其治療性和預防性基因產物)的緩慢釋放，例如控制釋放、持續釋放、延長釋放、持續作用的片劑或膠囊。這些劑型通常含有常規的或公知的賦形劑，例如親脂性、聚合物、纖維素、不溶性、可溶脹的賦形劑。控制釋放制劑可用于包括腸、結腸、生物黏附的任意其他遞送位點或舌下遞送(即，牙黏膜遞送)和支氣管遞送。當本發明的組合物被直腸或陰道施用時，藥物制劑可以包括栓劑和乳膏劑。在這種情況下，宿主細胞混懸在還包括脂質的常用賦形劑的混合物中。每種前述的制劑在本領域中是公知的，并且描述于例如以下的參考文獻:Hansel 等(1990,Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems,第 5版，William 和 Wilkins), Chienl992, Novel drug delivery system,第二版，M.Dekker)，Prescott 等(1989, Novel drug delivery, J.ffiley&Sons), Cazzaniga 等，(1994, Oraldelayed release system for colonic specific delivery, Int.J.Pharm.108 -J')。
[0132]優選地，灌腸劑制劑可以用于直腸施用。術語“灌腸劑”用于涵蓋旨在用于直腸使用的流體制劑。灌腸劑一般可以單一劑量容器供給并含有溶解在水、甘油、聚乙二醇或其他合適溶劑中的一種或更多種活性物質。
[0133]本 發明的優選實施方案提供了腸溶包衣膠囊，其包含穩定的冷凍干燥的、干燥的或噴霧干燥的有活力的本文中所述的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)，其特征在于使用非吸濕劑(non-hygroscopic agent)穩定所述有活力的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)。如本文中所使用的非吸濕劑旨在包括通常用于藥物組合物之制劑的任何賦形劑，并且其中所述非吸濕劑在環境40% RH表現出不超過約8wt%、優選不超過約wt7%以及更優選不超過約6wt% (例如約Iwt%至約5wt%,更特別的少于或等于2wt%)的平衡水分吸收(equilibrium moisture uptake)。所述非吸濕劑可是多元醇例如甘露醇、麥芽糖醇、異麥芽糖(多元醇糖)或磷酸鹽(例如無水磷酸二鈣磷酸氫鈣、磷酸氫鈣)或例如糖(如蔗糖)。
[0134]前述制劑中使用的膠囊通常選自:明膠膠囊、淀粉膠囊、羥丙基甲基纖維素(HPMC)膠囊等；特別是HPMC膠囊。為了有活力細菌的腸遞送，本發明的腸溶包衣膠囊應該在低pH(高至pH5.5)穩定并且在較高pH(pH5.5以上)有加速溶出譜。當膠囊在約pH6.8崩解I小時以內時實現最佳的釋放。因此，在本發明的另一個實施方案中，用腸溶聚合物對膠囊進行包衣以提供在高至PH5.5穩定的腸溶包衣膠囊并且其在pH5.5以上是可溶的，特別是在PH6.0以上，更特別的在約pH6.8具有快速溶出譜。
[0135]用于腸溶包衣的腸溶聚合物通常由可形成薄膜的聚合物質組成，其在pH5.5以上是可溶的，特別在PH6.0以上。可用于本發明的一些不同實施方的可形成薄膜的聚合物一般選自:纖維素衍生物、丙烯酸共聚物、馬來酸共聚物、聚乙烯衍生物、蟲膠(shellac)等；特別是選自以下的丙烯酸共聚物:苯乙烯-丙烯酸共聚物、丙烯酸甲酯-丙烯酸共聚物，丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、丙烯酸丁酯-苯乙烯-丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物(例如Eudragit L100、Eudragit S或Eudragit SlOO (各自為商品名,
從Rttlllll Pharma, Germany市售可得))、甲基丙烯酸_丙烯酸乙酯共聚物(例如EudragitL100-55(商品名，從Riihin Pharma, Germany市售可得))、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸-丙烯酸辛酯共聚物等，更特別的是可形成薄膜的聚合物由甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物組成。
[0136]此外，在干燥、噴霧干燥或冷凍干燥之前向細菌生物質添加不同穩定化合物(冷凍保護劑)的組合。該穩定化合物的組合包括淀粉水解產物和谷氨酸鹽和/或多元醇，導致干燥的、噴霧干燥的或冷凍干燥的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)的改善的存活或穩定性。
[0137]本文中所述的制劑和膠囊可用作藥物、營養品、食品添加劑、功能性食品、醫療食品、起子培養物和/或益生菌組合物。
[0138]因此，根據本發明，在一個優選的實施方案中，本文中所述的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)或包含這些革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)的(藥物)組合物可以經黏膜(例如經口、經鼻、直腸、陰道或支氣管途徑)向動物或人施用(通過任一種可應用于特定途徑的現有技術制劑)。用于施用的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)的劑量將取決于許多因素，其包括細菌的類型和由此編碼的基因、待治療之疾病的的類型和嚴重程度以及待使用的施用途徑。因此，無法限定用于本發明之各個或每個實施方案的精確劑量，但一旦配備了本發明，對本領域技術人員來說將是容易地顯而易見的。不管怎樣劑量可以逐個案例的方式確定，通過在施用預定數量的細胞后使用公知的方法(例如那些稱作ELISA或Biacore (參見實施例))測量治療性和/或預防性蛋白質的血清水平濃度。對所遞送的重組蛋白質的動力學曲線和半衰期的分析提供了充分的信息以允許確定革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)的有效劑量范圍。
[0139]在一個實施方案中，當革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)表達抗原時，本發明可因此還提供了疫苗。優選地，所述抗原可以在人和動物中引起免疫應答并且用作疫苗。術語“疫苗”等于這樣的可藥用組合物，當其以有效量施用于動物或人對象時能夠誘導對包含在疫苗中所包含之抗原的抗體和/或在對象中引起保護性免疫。本發明的疫苗將包含本文中所教導的任選的用編碼該抗原之核酸或載體轉化的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)，以及還任選地賦形劑。這樣的疫苗還可以包含佐劑，即增強對抗原之免疫應答的化合物或組合物。佐劑包括但不限于:弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、皂苷、礦物凝膠例如氫氧化 鋁、表面活性物質如溶血卵磷脂、聚醚多元醇(pluronicpolyol)、聚陰離子、肽、油或烴乳劑，以及潛在有用的可藥用人佐劑如BCG(卡-介桿菌(bacille Calmetle-Guerin))和短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。
[0140]在一個方面中，本發明涉及用于處理或治療的方法，其包括將革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)或組合物(優選治療和性/或預防性藥物組合物)施用于有此需要的個體。
[0141]如上所述的，包含根據本發明的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)的組合物可以是起子培養物、益生菌組合物或食品添加劑。因此，本發明在一個方面涉及包含本文中所述之革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)的起子培養物、益生菌組合物或食品添加劑。
[0142]起子培養物可以是例如液體培養物、液體加壓培養物、冷凍或干燥的形式，包括例如干燥的、冷凍干燥的形式和噴涂/流化床干燥的形式、或冷凍或冷凍干燥濃縮的。因此，在一個實施方案中，本發明涉及本文中所述的起子培養物，其是干燥的、噴霧干燥的、冷凍的或冷凍干燥的。所述培養物可以在真空中或在例如N2、CO2等的氣氛下包裝。例如，起子培養物可以產生于或分布于密閉的封閉殼(enclosure)(優選無熱原)中，所述可封閉殼由剛性、非柔性或柔性的合適的塑料或其他材料制造，可以向發酵處添加待發酵的有機物質或任選地在單獨的起子培養基中第一次培養以獲得高密度培養物。
[0143]除了根據本發明的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)，起子培養物還可以含有緩沖劑、生長刺激營養物(例如，可吸收的碳水化合物或氮源)或防腐劑(例如，冷凍保護的化合物)或其他載體(如果期望的話)例如奶粉或糖。
[0144]起子培養物可以是純 的培養物，即可以含有根據本發明的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)的一個單一隔離種群的生物質，即原則上從一個細胞起源的克隆。在另一個實施方案中，起子培養物可以是共培養物，即可以包含多于一種的本發明之革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)，還任選包含另外的微生物(例如細菌或酵母)。
[0145]可以優選的是，起子培養物或高密度培養物含有一種或更多種本發明之革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)的至少IO2個菌落形成單位(colony formingunit, CFU)，例如至少 103CFU/g、至少 104CFU/g，例如至少 105CFU/g、至少 106CFU/g，例如至少 107CFU/g、至少 108CFU/g、例如至少 109CFU/g、至少 10lclCFU/g，例如至少 10nCFU/g、至少1012CFU/g、或至少 1013CFU/g。
[0146]通常，起子培養物或高密度培養物可以添加到起子培養基或有機物質或底物以在一種或更多種細菌菌株(以及任選地一種或更多種酵母株菌株)的有活力細胞的濃度中發酵，所述細菌菌株是至少IO2(CFU)的一種或更多種細菌菌株(以及任選地一種或更多種酵母株菌株)，例如至少103CFU/g、至少104CFU/g，例如至少105CFU/g、至少106CFU/g，例如至少 107CFU/g、至少 108CFU/g、例如至少 109CFU/g、至少 10lclCFU/g、例如至少 10nCFU/g、至少1012CFU/g、至少1013CFU/g的有機物質、培養基或底物。
[0147]在一個實施方案中，本發明涉及本文中所限定的起子培養物用于制備食品產品或涉及包含缺乏纖維二糖特異性PTS系統IIC組分(PtcC)活性之革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)的食品添加劑或益生菌組合物或藥物。在一個優選的實施方案中，編碼內源性PtcC的基因已經被部分或完全地缺失、破壞或失活，例如不能產生本文中其他地方所述的功能性PtcC基因產物。在另一個優選的實施方案中，起子培養物或食品添加劑或益生菌組合物或藥物中的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)含有如本文中其他地方所述的功能性異源性海藻糖6-磷酸磷酸酶(例如otsB)和/或功能性異源性海藻糖6-磷酸合酶(例如otsA)。
[0148]在另一個實施方案中，本發明涉及本文中所限定的起子培養物或食品添加劑或益生菌組合物或藥物，其中革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)缺乏海藻糖6-磷酸磷酸化酶(TrePP)活性。在一個優選的實施方案中，編碼內源性TrePP的基因已經被部分或完全地缺失、破壞或失活，例如不能產生如本文中其他地方所述的功能性TrePP
基因產物。
[0149]在另一個優選的實施方案中，本發明涉及本文中所述的起子培養物或食品添加劑、益生菌組合物或藥物，其中革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)過表達(優選組成型過表達)一種或更多種如本文中其他地方所述的編碼海藻糖轉運蛋白(優選內源性海藻糖轉運蛋白)的基因。
[0150]還在另一個實施方案中，本發明涉及本文中所述的起子培養物、益生菌組合物或食品添加劑或藥物，其中革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)過表達本文中所述的一種或更多種異源性基因產物(優選一種或更多種預防性和/或治療性基因產物)。
[0151]在一個實施方案中，本文中所述的起子培養物、益生菌組合物或食品添加劑是干燥的、冷凍的、噴霧干燥的、干燥的或冷凍干燥的。
[0152]如以上指出的，本發明涉及本文中所述的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)用于制備益生菌組合物、起子培養物(優選用于用作食品添加劑或用于制備食品產品或用于制備藥物)的用途。在另一個優選的方面，本發明涉及起子培養物或益生菌組合物作為食品添加劑或用于制備食品產品的用途。
[0153] 本文所使用的術語“食品添加劑”是指(優選地配制在組合物中的)革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)，其可添加到人或動物食品或飼料，適合用于不經進一步修飾或作為替代地進一步修飾(例如食物或飼料的完全或部分的發酵或者食物或飼料之一種或更多種組分的完全或部分的發酵)之后消費。例如(但不限于此)，根據本發明的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)或根據本發明的組合物(例如本發明所述的起子培養物)可用于乳制品工業，特別是用于制備經發酵的乳產品，也稱作培養的乳制品食品、培養的乳制品產品或培養的奶產品。發酵過程提高產品的貨架期，并且增加口感并提高乳的可消化性。本文所指的食物產品的實例包括但不限于:奶酪、酸奶(yoghurt)、酸奶油(sour cream)、酪乳(buttermilk)、嗜酸菌酸奶(acidophilus milk)......[0154]在一方面中，本發明還涉及用于制備本文中所限定之藥物、食品添加劑、益生菌組合物或起子培養物的方法，其中所述起子培養物優選地是用于制備食品產品的起子培養物，所述方法包括以下步驟:
[0155]i)在培養基中繁殖革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)，
[0156]所述培養基包含能夠被所述革蘭氏陽性(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)發酵的底物物質；以及
[0157]ii)將如此繁殖的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)分別配制為藥物、食品添加劑、益生菌組合物或起子培養物。
[0158]用于繁殖革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)的方法，以及能夠被革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)發酵的培養基或底物是本領域中公知的。在一個實施方案中，制劑作為藥物、食品添加劑、益生菌組合物或起子培養物包含配制為液體培養物、液體加壓培養物、冷凍或干燥的形式(包括例如干燥的、冷凍干燥的形式和噴涂/流化床干燥的形式、或冷凍或冷凍干燥濃縮的)。優選地，所述制劑包括干燥、噴霧干燥、冷凍或冷凍干燥。
[0159]在另一方面中，本發明還涉及用于制備食品產品的方法，其包括將本文中所限定的革蘭氏陽性細菌 (優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)，本文中所限定的食品添加劑、本文中所限定的益生菌組合物或本文中所限定的起子培養物與能夠被所述革蘭氏陽性(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)發酵之底物物質混合。底物物質通常是碳源、優選碳水化合物或糖。能夠被革蘭氏陽性(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)發酵的碳水化合物包括但不限于
單糖或二糖，例如葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、纖維二糖......在一
個實施方案中，用于制備食品產品的方法包括以下步驟:
[0160]i)提供本文中所述的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)、食品添加劑、益生菌組合物或起子培養物；
[0161]ii)提供底物物質或包含能夠被所述革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)發酵之底物物質的組合物(優選無毒或可食用組合物)；
[0162]iii)將本文中所限定的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)，本文中所限定的食品添加劑、本文中所限定的益生菌組合物或本文中所限定的起子培養物與所述底物物質或組合物混合
[0163]iv)任選地繁殖所述革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)，和/或用所述革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)發酵所述底物物質或組合物。
[0164]在一方面中，本發明還涉及通過或可通過本文中所述的方法直接或間接獲得的食
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[0165]如前所述，根據本發明的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)有利地在細胞內積累海藻糖。因此，在一方面中，本發明還涉及用于在革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)中內部積累海藻糖的方法，例如海藻糖存在于生長培養基，或者外部的或外源性添加的海藻糖，所述方法包括在包含能夠被所述革蘭氏陽性(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)發酵之底物物質的培養基中繁殖根據本發明的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)。在一個實施方案中，用于在革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)中內部積累海藻糖的方法包括以下步驟:
[0166]i)提供本文中所述的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)、或起子培養物；
[0167]ii)提供底物物質或包含能夠被所述革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)發酵之底物物質的組合物(優選無毒或可食用組合物)；
[0168]iii)將本文中所限定的LAB或本文中所限定的起子培養物與所述底物物質或組合物混合；
[0169]iv)任選地繁殖所述革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)，和/或用所述革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)發酵所述底物物質或組合物。
[0170]根據本發明的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)有利地示出改善的對脅迫的抗性以及改善的制造、加工和/或貯藏特性。因此，在一方面中，本發明涉及用于改善革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)之脅迫抗性或制造、加工和/或貯藏特性的方法，其包括修飾革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)，例如使其缺乏PtcC活性。在一個實施方案中，編碼內源性PtcC的基因已經部分地或完全地缺失、破壞或失活，例如不能產生功能性PtcC基因產物。優選地，脅迫抗性或制造、加工和/或貯藏特性是選自以下的一種或更多種脅迫抗性或制造、加工和/或貯藏特性:對酸條件的抗性，對膽汁鹽的抗性，對熱的抗性、對鹽的抗性、對干燥、噴霧干燥、冷凍或冷凍干燥的抗性，以及滲透抗性。
[0171]在一個實施方案中，本發明涉及任何本文中所述的方法，其中革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)的確含有如本文中其他地方所述的功能性異源性海藻糖6-磷酸磷酸酶(例如otsB)和/或功能性異源性海藻糖6-磷酸合酶(例如otsA)。
[0172]在另一個實施方案中，本發明涉及任何本文中所述的方法，其中革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)缺乏海藻糖6-磷酸磷酸化酶(TrePP)活性。在一個優選的實施方案中，編碼內源性TrePP的基因已被部分地或完全地缺失、破壞或失活，例如不能產生如本文中其他地方所述的功能性TrePP基因產物。
[0173]在另一個實施方案中，本發明涉及任何本文中所述的方法，其中革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)過表達(優選組成型過表達)如本文中其他地方所述的一種或更多種編碼海藻糖轉運蛋白(優選內源性海藻糖轉運蛋白)的基因。
[0174]還在另一個實施方案中，本發明涉及任何本文中所述的方法，其中革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)過表達如本文中其他地方所述的一種或更多種異源性基因產物(優選一種或更多種預防性和/或治療性基因產物)。
[0175]在一個實施方案中，本發明涉及任何本文中所述的方法，所述方法還包括干燥、冷凍、噴霧干燥或冷凍干燥革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)、藥物、食品添加劑、益生菌組合物或起子培養物的步驟。
[0176]本發明人還出人意料地發現根據本發明的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)能夠細胞內積累海藻糖，而不添加外部添加的海藻糖。有利的是，根據本發明的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)可以在任選地甚至沒有外部添加之海藻糖的培養基中繁殖，但仍然內部地積累海藻糖。因此，在一個實施方案中，本發明涉及本文中所述的方法，所述方法包括將本文中所述的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)在缺乏或基本上缺乏海藻糖的培養基、或缺乏或基本上缺乏外部或外源性添加之海藻糖的培養基中維持或繁殖。有利的是，這樣的培養基可以包含另一個可發酵的碳源，例如但不限于麥芽糖和/或葡萄糖。
[0177]因此，在一個實施方案中，本發明涉及任何本文中所述的方法，其中根據本發明的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)在包含能夠被所述革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)發酵之底物物質的培養基中維持或繁殖，其中所述底物物質包含較少(例如次優的)、不包含或基本不包含海藻糖。或者，本發明涉及任何本文中所述的方法，其中根據本發明的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)在包含能夠被所述革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)發酵之底物物質的培養基中維持或繁殖，其中所述底物物質包含麥芽糖。在一個優選的實施方案中，本發明涉及任何本文中所述的方法，其中根據本發明的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)在包含能夠被所述革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)發酵之底物物質的培養基中維持或繁殖，其中所述底物物質包含麥芽糖并且其中所述所述底物物質包含較少(例如次優的)、不包含或基本不包含海藻糖。[0178]如本文中使用，包含沒有或基本上沒有海藻糖或者沒有外部添加的或外源性海藻糖的培養基是指不含有海藻糖或僅含有少量的海藻糖的培養基。優選地，在這樣的培養基中海藻糖的量或濃度太低而不允許細菌能夠將其用作唯一碳源。在一個實施方案中，培養基含有少于lOOmM、優選少于50mM、更優選少于25mM，例如少于15mM、少于10mM、少于5mM、少于2mM或少于ImM。在另一個實施方案中，在另一個實施方案中，培養基含有少于2w/w%或少于2V/W%的海藻糖，優選少于1W/W%或少于lv/wW的海藻糖，更優選少于0.5W/W%或少于0.5￥/^%的海藻糖，例如少于0.3、少于0.2、少于0.1,0.05或少于0.01w/w%*v/w%的海藻糖。在另一個實施方案中，培養基含有少于碳源或可發酵之碳水化合物總量的20%、優選少于10 %、更優選少于5% (例如少于3 %、少于2%或少于I % )的海藻糖。
[0179]在另一個方面，本發明涉及本文中所述的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)在所述革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)中積累細胞內海藻糖的用途。在一個優選的實施方案中，本發明涉及本文中所述的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)在不存在或基本上不存在海藻糖的情況下在所述革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)中積累細胞內海藻糖的用途。在另一個實施方案中，本發明涉及本文中所述的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)在麥芽糖(優選作為唯一或基本上唯一碳源)上維持或繁殖時在所述革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)中積累細胞內海藻糖的用途。
[0180]如上所述，根據本發明的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)示出改善的對多種環境脅迫的抗性以及改善的制造、加工和/或貯藏特征。因此，在一方面中，本發明涉及本文中所述的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)在所述革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)中改善脅迫抗性或改善制造、加工和/或貯藏特征的用途。在另一方面中，本發明涉及用于在革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)中改善脅迫抗性或改善制造、加工和/或貯藏特征的方法，其包含產生如本文中所述的革蘭氏陽性細菌(優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌)。
[0181]在一個實施方案中，脅迫抗性選自:對酸條件的抗性，對膽汁鹽的抗性、抗熱性、對鹽的抗性、寒冷抗性以及滲透抗性，優選地選自對酸條件或膽汁鹽的抗性，更優選對膽汁鹽的抗性。在另一個實施方案中，制造、加工和/或貯藏特征選自:干燥、冷凍、冷凍干燥、噴霧干燥或在培養基中貯藏，優選冷凍、冷凍干燥，更優選冷凍干燥。
[0182]本發明的方面和實施方案還被以下非限制性實施例所支持。
實施例
[0183]表1提供了在本文中描述的菌株中遺傳修飾的概要，除了圖4中使用的菌株在表2中給出。
[0184]表1
[0185]
【權利要求】
1.非致病性革蘭氏陽性細菌，其缺乏纖維二糖特異性PTS系統IIC組分(PtcC)活性，優選其中編碼內源性PtcC的基因已被部分地或完全地缺失、破壞或失活，例如不能產生功能性PtcC基因產物。
2.根據權利要求1所述的非致病性革蘭氏陽性細菌，其中所述PtcC基因或蛋白分別具有與SEQ ID NO:7或8有至少75%同一性的核酸或氨基酸序列。
3.根據權利要求1或2所述的非致病性革蘭氏陽性細菌，其缺乏海藻糖6-磷酸磷酸化酶(TrePP)活性，優選其中編碼內源性TrePP的基因已被部分地或完全地缺失、破壞或失活，例如不能產生功能性TrePP基因產物。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的非致病性革蘭氏陽性細菌，其過表達一種或更多種編碼海藻糖轉運蛋白優選內源性海藻糖轉運蛋白的基因。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的非致病性革蘭氏陽性細菌，其含有功能性異源性海藻糖6-磷酸磷酸酶。
6.根據權利要求5所述的非致病性革蘭氏陽性細菌，其中所述海藻糖6-磷酸磷酸酶是otsB,優選來自大腸桿菌(E.coli)的otsB。
7.根據權利要求1至6中任一項所述的非致病性革蘭氏陽性細菌，其含有一種或更多種異源性基因產物，優選一種或更多種預防性和/或治療性基因產物。
8.根據權利要求1至 7中任一項所述的非致病性革蘭氏陽性細菌，其中所述革蘭氏陽性細菌是干燥的、噴霧干燥的、冷凍的或冷凍干燥的。
9.根據權利要求1至8中任一項所述的非致病性革蘭氏陽性細菌，其中所述細菌是乳酸菌(LAB),優選乳球菌屬(Lactococcus sp.)或乳桿菌屬(Lactobacillus sp.)。
10.根據權利要求1至8中任一項所述的非致病性革蘭氏陽性細菌，其中所述細菌是雙歧桿菌屬(Bifidobacterium sp.)。
11.根據權利要求1至10中任一項所述的非致病性革蘭氏陽性細菌，其用作藥物。
12.藥物、食品添加劑、益生菌組合物或起子培養物，其包含根據權利要求1至10中任一項所述的非致病性革蘭氏陽性細菌。
13.根據權利要求12所述的起子培養物，優選其中所述起子培養物是用于制備食品產品的起子培養物。
14.用于制備藥物或用于制備食品添加劑或用于制備起子培養物或用于制備益生菌組合物的方法，其包括以下步驟: i)在培養基中繁殖根據權利要求1至10中任一項所述的非致病性革蘭氏陽性細菌，所述培養基包含能夠被所述革蘭氏陽性細菌發酵的底物物質，以及 ?)將如此繁殖的非致病性革蘭氏陽性細菌分別地配制成藥物或食品添加劑或起子培養物或益生菌組合物。
15.用于在缺乏纖維二糖特異性PTS系統IIC組分(PtcC)活性的革蘭氏陽性細菌中內部積累海藻糖的方法，優選其中編碼內源性PtcC的基因已被部分地或完全地缺失、破壞或失活，例如不能產生功能性PtcC基因產物，所述方法包括在包含能夠被所述革蘭氏陽性細菌發酵之底物物質的培養基中繁殖所述革蘭氏陽性細菌。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述細菌是非致病性革蘭氏陽性細菌，優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌。
17.根據權利要求14至16所述的方法，其中所述培養基包含麥芽糖或葡萄糖或麥芽糖與葡萄糖的組合作為碳源，優選作為主要或唯一碳源。
18.根據權利要求14至17中任一項所述的方法，其中所述培養基基本上不含有外部添加的海藻糖。
19.用于改善革蘭氏陽性細菌優選乳酸菌(LAB)或雙歧桿菌之脅迫抗性或貯藏特征的方法，所述脅迫抗性或貯藏特征優選一種或更多種選自以下的脅迫抗性或貯藏特征:對酸條件的抗性，對膽汁鹽的抗性，對干燥、冷凍或冷凍干燥的抗性，以及滲透抗性，所述方法包括對所述革蘭氏陽性細菌進行修飾例如使其缺乏PtcC活性，優選其中編碼內源性PtcC的基因已被部分地或完全地缺失、破壞或失活，例如不能產生功能性PtcC基因產物。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述細菌是非致病性革蘭氏陽性細菌。
21.根據權利要求19或20所述的方法，其中所述革蘭氏陽性細菌缺乏TrePP活性，優選其中編碼內源性TrePP的基因已被部分地或完全地缺失、破壞或失活，例如不能產生功能性TrePP基因產物。
22.根據權利要求19至21所述的方法，其中所述革蘭氏陽性細菌過表達一種或更多種編碼海藻糖轉運蛋白優選內源性海藻糖轉運蛋白的基因。
23.根據權利要求19至22中任一項所述的方法，其中所述革蘭氏陽性細菌含有功能性異源性海藻糖6-磷酸磷酸酶。
24.根據權利要求23所述的方法，其中所述海藻糖6-磷酸磷酸酶是otsB，優選來自大腸桿菌的otsB。
25.根據權利要求19至24中任一項所述的方法，其中所述革蘭氏陽性細菌表達一種或更多種異源性基因產物，優選一種或更多種預防性和/或治療性基因產物或抗原。
26.根據權利要求14至25中任一項所述的方法，其還包括對所述革蘭氏陽性細菌、藥物、食品添加劑或起子培養物進行冷凍或冷凍干燥。
27.用于制備食品產品的方法，其包括將根據權利要求12或13所述的食品添加劑或起子培養物與能夠被所述非致病性革蘭氏陽性細菌發酵的底物物質混合，任選地還包括對所述底物物質進行發酵的步驟。
28.食品產品，其可通過根據權利要求27所述的方法獲得。
【文檔編號】A61K39/09GK103917639SQ201280053876
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2012年9月21日 優先權日:2011年9月23日
【發明者】洛塔爾·施泰德勒, 卡羅利安·萬于伊內蓋姆, 克拉斯·萬登布魯克 申請人:阿克托杰尼斯有限公司