結(jié)合肽聚糖識(shí)別蛋白1的抗體的制作方法
【專利摘要】本文所公開(kāi)的是用于鑒定TREM-1的配體和抗體或其片段的方法，其能夠修飾TREM-1的配體的功能。使用此方法可以鑒定和選擇降低或阻斷TREM-1活化的抗體。結(jié)合TREM-1的配體并降低TREM-1活性的抗體可以適合用作藥物。
【專利說(shuō)明】結(jié)合肽聚糖識(shí)別蛋白1的抗體 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及用于鑒定能夠刺激髓樣細(xì)胞上表 達(dá)的觸發(fā)受體（TREM-1)的配體的方法，以及結(jié)合TREM-1的配體的抗體。這些抗體能夠調(diào) 節(jié)髓樣細(xì)胞活化和因此調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。
[0002] 背景 肽聚糖識(shí)別蛋白1 (另外稱為PGLYRP1、PGRP-S、TNFSF3L、PGRP、TAG7和PGRPS)在嗜 中性粒細(xì)胞中表達(dá)并在它們活化后釋放。PGLYRP1在患病組織中高度豐富，并且已顯示在 通過(guò)先天免疫系統(tǒng)的細(xì)菌感染的清除中起重要作用。PGLYRP蛋白家族（PGLYRPUPGLYRP2、 PGLYRP3、PGLYRP4)均與細(xì)菌肽聚糖（PGN)相互作用，但在蛋白的PGN結(jié)合位點(diǎn)中有重要區(qū) 另ij。PGLYRP1具有附加的溝，假定其構(gòu)成未知效應(yīng)物或信號(hào)傳導(dǎo)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)（J. Mol. Biol. 347:683-691 (2005))。PGLYRP1是高度保守的、196個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的蛋白，由信號(hào)肽 和肽聚糖結(jié)合域組成。
[0003] 為了理解并由此操縱此蛋白在各種感染性和炎性疾病中的功能，鑒定由PGLYRP1 介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制是重要的。
[0004] TREM-1在免疫調(diào)節(jié)中同樣地具有充分描述的效果，但是迄今為止，尚未了解導(dǎo)致 TREM-1介導(dǎo)的免疫功能的機(jī)制。TREM-1是在髓樣細(xì)胞，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜中性粒 細(xì)胞上表達(dá)的受體。其是由234個(gè)氨基酸組成的跨膜蛋白，包括單個(gè)細(xì)胞外免疫球蛋白結(jié) 構(gòu)域和短的胞質(zhì)尾。TREM-1不具有明顯的信號(hào)傳導(dǎo)基序，但是，當(dāng)被活化時(shí)，形成二聚體/ 多聚體，并通過(guò)與含ITAM的信號(hào)接頭蛋白DAP12相關(guān)聯(lián)介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)。下游信號(hào)傳導(dǎo)可包 括Syk和Zap70的磷酸化。下游信號(hào)傳導(dǎo)可包括NFAT、ELK、NK-kB轉(zhuǎn)錄因子的活化。當(dāng) TREM-1被活化時(shí)，其觸發(fā)促炎性細(xì)胞因子，如TNF -a (TNF-a)、IL_8和單核細(xì)胞趨化蛋 白-1從髓樣細(xì)胞中的釋放。
[0005] TREM-1在患有敗血癥、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA)和炎性腸病（IBD)的患者中上調(diào)，并且 越來(lái)越多的證據(jù)支持該理論認(rèn)為T(mén)REM-1有助于炎性疾病的發(fā)生和進(jìn)展。TREM-1信號(hào)傳導(dǎo) 的阻斷已進(jìn)一步在RA和IBD的體內(nèi)小鼠模型中顯示具有治療活性。
[0006] TREM-1活化的作用方式仍然很難以捉摸，因?yàn)榛罨疶REM-1的配體不是本領(lǐng)域中 已知的。因此，在本領(lǐng)域中，存在對(duì)鑒定TREM-1的配體的手段的需求。在本領(lǐng)域中對(duì)于鑒 定能夠降低、阻斷、或者干擾TREM-1與其配體的相互作用分子(如抗體）的方法存在需求。 在本領(lǐng)域中對(duì)于能夠結(jié)合TREM-1的配體，并從而降低、阻斷，或干擾TREM-1被其配體的刺 激的分子，如抗體存在需求。在本領(lǐng)域中對(duì)于能夠結(jié)合TREM-1的配體的分子，如抗體存在 需求。在本領(lǐng)域中對(duì)于能夠結(jié)合TREM-1的配體并從而阻斷TREM-1的活化和信號(hào)傳導(dǎo)的分 子，如抗體存在需求。在本領(lǐng)域中對(duì)于能夠結(jié)合TREM-1的配體，并從而降低或阻斷從表達(dá) TREM-1的髓樣細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放的分子，如抗體存在需求。
[0007] 本文所公開(kāi)的是用于鑒定TREM-1的配體以及能夠結(jié)合TREM-1的配體的分子如抗 體的方法和測(cè)定法。本文描述的是，能夠影響TREM-1活化的抗體。因此，本文所公開(kāi)的抗 體適于用作藥物。結(jié)合TREM-1的配體，并且降低或阻斷TREM-1與其配體相互作用的抗體 對(duì)于患有慢性炎性疾病如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎和炎癥性腸疾病的個(gè)體的生活質(zhì) 量可以具有實(shí)質(zhì)性的影響。
[0008] 概述 本發(fā)明涉及用于鑒定TREM-1的配體和結(jié)合TREM-1的配體的分子如抗體(本文中鑒定 為PGLYRP1)的方法。本發(fā)明還涉及可通過(guò)本發(fā)明的方法鑒定PGLYRP1抗體。因此，本發(fā)明 涉及PGLYRP1抗體，其能夠通過(guò)PGLYRP1修飾TREM-1的活化，諸如能夠通過(guò)PGLYRP1降低 TREM-1活性(信號(hào)傳導(dǎo)和/或活化)的PGLYRP1抗體。降低TREM-1的活性的抗體可用于炎 癥治療。
[0009] 用于鑒定TREM-1的配體的方法，其包括：（a)培養(yǎng)表達(dá)TREM-1、TREM-1的信號(hào) 傳導(dǎo)蛋白和報(bào)道基因構(gòu)建體的細(xì)胞，所述報(bào)道基因構(gòu)建體被所述信號(hào)蛋白活化；（b)當(dāng)它 與細(xì)胞、化合物或流體，例如生物流體或組織接觸時(shí)(其觸發(fā)TREM-1的活化)，對(duì)所述表達(dá) TREM-1的細(xì)胞的活性進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)選定量；（c)使（b)的培養(yǎng)物與TREM-1活化組分接觸； (d)分離結(jié)合TREM-1的組分以及（e)表征所分離的組分。TREM-1的配體，通過(guò)本發(fā)明鑒定 為PGLYRP1，可用于修飾TREM-1的活性。
[0010] 用于鑒定特異性結(jié)合PGLYRP1并且修飾TREM-1介導(dǎo)的細(xì)胞活性的分子的方法，其 包括：（a)根據(jù)實(shí)施方案1-18中任一項(xiàng)培養(yǎng)細(xì)胞；（b)當(dāng)它與PGLYRP1和任選地，多聚化試 劑如PGN接觸時(shí)，對(duì)表達(dá)TREM-1的所述細(xì)胞的活性進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)選定量；（c)將（b)的培養(yǎng) 物與特異性結(jié)合PGLYRP1的分子接觸；并且（d)檢測(cè)，優(yōu)選定量表達(dá)TREM-1的所述細(xì)胞的 活性小于或大于如（b)中測(cè)量的它的活性。
[0011] 用于鑒定修飾TREM-1介導(dǎo)的細(xì)胞活性的PGLYRP1抗體的方法，其包括：（a)培養(yǎng) 表達(dá)TREM-1、TREM-1的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和由所述信號(hào)傳導(dǎo)蛋白活化的報(bào)道基因構(gòu)建體的細(xì) 胞；（b)當(dāng)它與PGLYRP1和任選地，組合多聚化試劑如PGN接觸時(shí)，對(duì)表達(dá)TREM-1的所述細(xì) 胞的活性進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)選定量；（c)將（b)的培養(yǎng)物與結(jié)合PGLYRP1的抗體接觸；并且（d)檢 測(cè)，優(yōu)選定量表達(dá)TREM-1的所述細(xì)胞的活性小于或大于如（b)中測(cè)量的它的活性。
[0012] 鑒定降低TREM-1介導(dǎo)的細(xì)胞活性的PGLYRP1抗體的一種方法，其包括：（a)培養(yǎng) 細(xì)胞，例如表達(dá)TREM-1、信號(hào)傳導(dǎo)蛋白例如DAP12和報(bào)道基因例如熒光素酶或β -半乳糖 苷酶的Τ細(xì)胞；（b)將所述細(xì)胞與活化的嗜中性粒細(xì)胞和任選地，組合多聚化試劑例如PGN 一起孵育；（c)檢測(cè)，優(yōu)選定量所述細(xì)胞的發(fā)光；（d)將所述細(xì)胞和活化的嗜中性粒細(xì)胞的 培養(yǎng)物與PGLYRP1抗體接觸；以及（e)檢測(cè)，優(yōu)選定量所述細(xì)胞的發(fā)光少于（c)中測(cè)量的活 性。
[0013] 附圖簡(jiǎn)述 圖1顯示嗜中性粒細(xì)胞活化BWZ-TREM-1報(bào)道基因細(xì)胞系。BWZ報(bào)道基因細(xì)胞系表達(dá) 人TREM-1并介導(dǎo)NFAT-連接的β -半乳糖苷酶報(bào)道基因的活化，其可以使用來(lái)自Promega， Denmark的Beta-Glo測(cè)定系統(tǒng)試劑盒通過(guò)發(fā)光定量。該圖顯示當(dāng)在含有TNF-α、IL-6、 IFN- γ 和 GM-CSF 或 Toll 樣受體（TLR)活化"混合物（cocktails) "（TLRL 和 TLR2 混合物， tlrl-kit2hm, Invivogen, Sigma-Aldrich, Denmark)的細(xì)胞因子混合物的存在下，以及 這些活化混合物的分開(kāi)的組分的存在下與嗜中性粒細(xì)胞一起培養(yǎng)時(shí)，報(bào)道基因細(xì)胞系的活 化。
[0014] 圖2顯示用TREM-1四聚體重組蛋白的PGN刺激的嗜中性粒細(xì)胞的流式細(xì)胞染色。 對(duì)照蛋白不結(jié)合（圖2A)，而TREM-1四聚體（SEQ ID NO: 2)結(jié)合PGN-活化的嗜中性粒細(xì) 胞的亞群（圖2B)，并且這可以被另一種TREM-1蛋白競(jìng)爭(zhēng)（圖2D)，但不被對(duì)照蛋白競(jìng)爭(zhēng)（圖 2C)，證實(shí)了相互作用的特異性。
[0015] 圖3 :用TREM-1通過(guò)免疫沉淀（IP)/質(zhì)譜（MS)鑒定PGLYRP1。可溶性TREM-Fc與 PGN-活化的嗜中性粒細(xì)胞一起孵育，交聯(lián)，免疫沉淀，隨后進(jìn)行清洗，胰蛋白酶消化和質(zhì)譜。 TREM-1結(jié)合蛋白的免疫沉淀得到3個(gè)特異性蛋白，73個(gè)蛋白與對(duì)照蛋白重疊，并且72個(gè)被 對(duì)照蛋白單獨(dú)沉淀(背景)。表顯示了 TREM-1特異性免疫沉淀和后續(xù)質(zhì)譜的結(jié)果。
[0016] 圖4顯示可溶性TREM-1結(jié)合PGLYRP1。通過(guò)用TREM-1在表達(dá)重組PGLYRP1的 HEK293轉(zhuǎn)染子上流式細(xì)胞染色（圖4A)和通過(guò)PGLYRP1和TREM-1四聚體（SEQ ID N0: 2) 之間的相互作用的Biacore和ForteBio分析顯示。在存在或不存在10 Pg/ml的可溶性大 腸桿菌肽聚糖（PGN)的情況下可溶性人PGLYRP1結(jié)合固定化人TREM-1 (圖4B)。PGN本身 也結(jié)合固定化的人PGLYRP1(圖4C)，并且在PGLYRP1表面暴露于和被PGN結(jié)合之前和之后， 可溶性人TREN-1結(jié)合固定化的PGLYRP1 (圖4D)。
[0017] 圖5顯示TREM-1報(bào)道基因細(xì)胞系被重組PGLYRP1活化。TREM-1報(bào)道基因細(xì)胞系 用重組 PGLYRP1 (目錄號(hào) 2590-PG-050 R&D Systems Minneapolois MN, USA)的刺激，以 及內(nèi)部（in-house)生成的PGLYRP1 (SEQ ID NO: 1)在PGN的存在下導(dǎo)致劑量依賴性的應(yīng) 答（圖5A)。此PGLYRP1誘導(dǎo)的應(yīng)答可以被TREM-1-Fc融合蛋白特異性阻斷（圖5B)驗(yàn)證了 TREM-1特異性信號(hào)。
[0018] 圖6顯示單克隆抗-PGLYRP1抗體可以阻斷在報(bào)道基因測(cè)定中用PGN-活化的嗜 中性粒細(xì)胞刺激的TREM-1應(yīng)答。抗體雜交瘤克隆上清液的實(shí)例在多個(gè)板中篩選它們阻 斷活化信號(hào)的能力。少數(shù)抗體(那些在虛線下的抗體，例如F10、F95)能夠阻斷此信號(hào)。黑 點(diǎn)表示每個(gè)板中的同種型對(duì)照（圖6A)。圖6B顯示來(lái)自另一個(gè)融合體的測(cè)試引起2個(gè)額 外的阻斷PGLYRP1抗體M-hPGRPS-2F5和-2F7。商購(gòu)可得的抗-PGLYRP1 mAb的測(cè)試顯示 它們不能阻斷此信號(hào)，即使在高劑量，而多克隆的商購(gòu)可得的PGLYRP1 pAb (AF2590，R&D Systems Minneapolois MN, USA)可以。圖6C顯不來(lái)自 Thermo Scientific 的商購(gòu)可得的抗 PGLYRP1 mAb 188C424(Thermo Scientific, Waltham MA, USA)與同種型對(duì)照（MAB002)和 多克隆抗PGLYRP1 pAb (AF2590)的比較。圖6D顯示商購(gòu)可得的抗PGLYRP1 mAb 4H230(US Biological, Salem MA, USA)與同種型對(duì)照（MAB002)和多克隆抗 PGLYRPlpAb (AF2590) 的比較。圖 6E 顯示商購(gòu)可得的抗 PGLYRP1 mAb 9A319(US Biological, Salem MA, USA) 與同種型對(duì)照（MAB002)和多克隆抗PGLYRP1 pAb (AF2590)的比較，圖6F顯示商購(gòu)可得的 抗PGLYRP1 mAb 6D653 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz CA, USA)與同種型對(duì)照 (MAB002)和多克隆抗PGLYRP1 pAb (AF2590)的比較。對(duì)于SC 6D653 mAb所見(jiàn)的活性輕微 下降似乎由于含疊氮化物的制劑，因?yàn)橛? ug/ml板結(jié)合的抗TREM-1 mAb觸發(fā)TREM-1的 PGLYRP1獨(dú)立的信號(hào)顯示相同的現(xiàn)象（圖6G)。
[0019] 圖7顯示在人RA滑液中存在的TREM-1配體能夠刺激TREM-1。
[0020] 圖 7 顯示板結(jié)合的對(duì)抗抗 TREM-1 mAb (R&D MAB1278, Minneapolis, MN, USA) 刺激TREM-1 (星號(hào))并且已向其中添加 PGN的RA滑液（SF)樣品顯示hTREM-1配體活性，其 可以被PGLYRP1多克隆抗體（AF2590)中和，表明TREM-1活性是PGLYRP1依賴性的。
[0021] 圖8顯示II型PGLYPR1構(gòu)建體的總體結(jié)構(gòu)。1C表示細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，TM是跨膜結(jié) 構(gòu)域-其兩者源自MDL-1蛋白序列，組合hPGLYRPl的EC (細(xì)胞外）結(jié)構(gòu)域。
[0022] 序列簡(jiǎn)述 SEQ ID NO: 1表示成熟、全長(zhǎng)hPGLYRPl肽序列的氨基酸序列。
[0023] SEQ ID N0: 2表示包含下列元件的重組蛋白序列：人TREM-1 E⑶、接頭肽、人 TREM-1 ECD、具有 7 個(gè)不同于野生型的突變（L15A、L16E、G18A、A111S、P112S、D137E、L139M) 的人同種異型IgGl Fc。
[0024] SEQ ID NO: 3 表示具有 5 個(gè)不同于野生型的突變：L15A、L16E、G18A、A111S、P112S 的人同種異型IgGl Fc。
[0025] SEQ ID NO: 4表示從N至C末端包含下列元件的重組蛋白序列：6xHIS標(biāo)簽、兩個(gè) 拷貝的鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域（SBP)、GS接頭、軟骨寡聚蛋白C末端（C0MP)、GS 接頭、hDCIR-ECD。
[0026] SEQ ID NO: 5表示包含下列元件的重組蛋白序列：hTREM-l-E⑶、GS接頭、軟骨寡 聚蛋白C末端（C0MP)、GS接頭、兩個(gè)拷貝的鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域（SBP)、6xHIS 標(biāo)簽。
[0027] SEQ ID N0: 6表示從N至C末端的順序包含下列元件的重組蛋白序列：人⑶83 E⑶、G4Sx3接頭肽、人⑶83 E⑶、人同種異型IgGl Fc突變體。
[0028] SEQ ID勵(lì):7表示具有(：末端6?1信號(hào)序列的全長(zhǎng)人？61^1^1編碼〇0嫩序列。 經(jīng)由EcoRl和Xhol限制性位點(diǎn)將此序列克隆入pcDNA3. lzeo(+) (Invitrogen: V860-20, Carlsbad, CA, USA)〇
[0029] SEQ ID NO: 8 表示成熟全長(zhǎng) hTREM-1 ECD (aa. 21-200)。
[0030] SEQ ID N0:9表示被G4Sx3接頭分開(kāi)的CD33前導(dǎo)肽串聯(lián)hTREM-1細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域 的cDNA。合成cDNA具有5' EcoRl限制性位點(diǎn)、GCCACC Kozak序列CD33前導(dǎo)序列隨后是 人TREM-1的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（aal7-200)，具有相互間隔的ΚρηΙ限制性位點(diǎn)和重復(fù)3次的甘 氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸間隔序列（G4Sx3)隨后是人TREM-1的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的額 外拷貝（aal7_200)和Apal位點(diǎn)以允許克隆。
[0031] SEQIDN0:10表示五聚體hTREM-C0MP-SBP38x2-6HIS。EcoRl位點(diǎn)和Kozak是0RF 的5'并且BamHl位點(diǎn)是0RF的3'。
[0032] SEQ ID N0:11 表示用 EcoRl 和 Apal 克隆入 pJSV002-hFc6mut 載體的 hCD83 四聚 體。EcoRl位點(diǎn)和Kozak是0RF的5'并且Apal位點(diǎn)是0RF的3'。
[0033] SEQIDN0:12表示五聚體6HIS-SBP38x2-C0MP-hDCIR。EcoRl位點(diǎn)和Kozak是0RF 的5'并且BamHl是0RF的3'。
[0034] SEQIDN0:13表示單克隆PGLYRPl抗體（lF36，mAb0182)的可變重鏈的核酸序 列。
[0035] SEQIDN0:14表示單克隆PGLYRPl抗體（lF36，mAb0182)的可變輕鏈的核酸序 列。
[0036] SEQIDN0:15表示單克隆PGLYRPl抗體（lF36，mAb0182)的可變重鏈的氨基酸 序列。
[0037] SEQIDN0:16表示單克隆PGLYRPl抗體（lF36，mAb0182)的可變輕鏈的氨基酸 序列。
[0038] SEQ ID NO: 17表示單克隆PGLYRP1抗體（1F10)的可變重鏈的核酸序列。
[0039] SEQ ID NO: 18表示單克隆PGLYRP1抗體（1F10)的可變輕鏈的核酸序列。
[0040] SEQ ID N0:19表示單克隆PGLYRP1抗體（1F10)的可變重鏈的氨基酸序列。
[0041] SEQ ID N0:20表示單克隆PGLYRP1抗體（1F10)的可變輕鏈的氨基酸序列。
[0042] SEQ ID N0:21表示單克隆PGLYRP1抗體（1F105, mAb 0184)的可變重鏈的核酸 序列。
[0043] SEQIDN0:22表示單克隆PGLYRPl抗體（lF105，mAb0184)的可變輕鏈的核酸 序列。
[0044] SEQIDN0:23表示單克隆PGLYRPl抗體（lF105，mAb0184)的可變重鏈的氨基 酸序列。
[0045] SEQIDN0:24表示單克隆PGLYRPl抗體（lF105，mAb0184)的可變輕鏈的氨基 酸序列。
[0046] SEQ ID N0:25表示單克隆PGLYRP1抗體（1F95)的可變重鏈的核酸序列。
[0047] SEQ ID N0:26表示單克隆PGLYRP1抗體（1F95)的可變輕鏈的核酸序列。
[0048] SEQ ID N0:27表示單克隆PGLYRP1抗體（1F95)的可變重鏈的氨基酸序列。
[0049] SEQ ID N0:28表示單克隆PGLYRP1抗體（1F95)的可變輕鏈的氨基酸序列。
[0050] SEQ ID N0:29表示單克隆PGLYRP1抗體（2F5)的可變重鏈的核酸序列。
[0051] SEQ ID N0:30表示單克隆PGLYRP1抗體（2F5)的可變輕鏈的核酸序列。
[0052] SEQ ID N0:31表示單克隆PGLYRP1抗體（2F5)的可變重鏈的氨基酸序列。
[0053] SEQ ID N0:32表示單克隆PGLYRP1抗體（2F5)的可變輕鏈的氨基酸序列。
[0054] SEQ ID N0:33表示單克隆PGLYRP1抗體（2F7)的可變重鏈的核酸序列。
[0055] SEQ ID N0:34表示單克隆PGLYRP1抗體（2F7)的可變輕鏈的核酸序列。
[0056] SEQ ID N0:35表示單克隆PGLYRP1抗體（2F7)的可變重鏈的氨基酸序列。
[0057] SEQ ID N0:36表示單克隆PGLYRP1抗體（2F7)的可變輕鏈的氨基酸序列。
[0058] SEQ ID N0:37 表示 II 型 1. 0 PGLYRP1 的氨基酸序列。
[0059] SEQ ID N0:38 表示 II 型 2. 0 PGLYRP1 的氨基酸序列。
[0060] SEQ ID N0:39表不表位標(biāo)簽的氨基酸序列。
[0061] SEQ ID N0:40表示全長(zhǎng)人PGLYRP2的氨基酸序列。
[0062] SEQ ID N0:41表示全長(zhǎng)人PGLYRP3的氨基酸序列。
[0063] SEQ ID N0:42表示全長(zhǎng)人PGLYRP4的氨基酸序列。
[0064] SEQ ID N0:43 表示 hCD33-hTREM-l ECD(aal7-200)-Fc6mut 的核酸序列。
[0065] SEQ ID N0:44 表示 hCD33-hTREM-l ECD(aal7-200)-Fc6mut 的氨基酸序列。
[0066] SEQ ID N0:45 表示 hCD33-hTremLl ECD(aal6-162)-Fc6mut 的核酸序列。
[0067] SEQ ID N0:46 表示 hCD33-hTremLl ECD(aal6-162)-Fc6mut 的氨基酸序列。
[0068] SEQ ID N0:47 表示 hCD33-hTremL2 ECD(aal9-268)-Fc6mut 的核酸序列。
[0069] SEQ ID N0:48 表示 hCD33-hTremL2 ECD(aal9-268)-Fc6mut 的氨基酸序列。
[0070] SEQ ID N0:49 表示 hCD33-hTREM2-Fc6mut 二聚體的核酸序列。
[0071] SEQ ID N0:50 表示 hCD33-hTREM2-Fc6mut 二聚體的氨基酸序列。
[0072] SEQ ID N0:51表示引物的核酸序列。
[0073] SEQ ID N0:52表示引物的核酸序列。
[0074] SEQ ID NO :53表示hCD33的氨基酸序列。
[0075] 描述 本發(fā)明涉及用于鑒定分子例如抗體的方法，所述分子能夠特異性結(jié)合TREM-1的信號(hào) 傳導(dǎo)配偶體(本文鑒定為PGLYRP1)，并影響PGLYRP1與其信號(hào)傳導(dǎo)配偶體TREM-1的結(jié)合。 PGLYRP1可以用于修飾TREM-1的活性。因此，本發(fā)明涉及影響由PGLYRP1介導(dǎo)的炎癥應(yīng)答 的分子，例如抗體。已經(jīng)產(chǎn)生并鑒定了能夠結(jié)合PGLYRP1并影響TREM-1活化和信號(hào)傳導(dǎo)的 抗體。
[0076] 用于鑒定TREM-1的配體和用于鑒定能夠特異性結(jié)合PGLYRP1并降低或阻斷 TREM-1的PGLYRP1活化的分子例如抗體的方法或測(cè)定法可以如下產(chǎn)生： 第一細(xì)胞或第一細(xì)胞的群體用編碼TREM-1或其片段、信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和報(bào)道基因構(gòu)建 體的基因轉(zhuǎn)染。該細(xì)胞可以是造血來(lái)源的，諸如髓樣細(xì)胞，其可以是T細(xì)胞，或者其可以 是能夠被轉(zhuǎn)染和表達(dá)這些分子任何其它的細(xì)胞類(lèi)型。信號(hào)傳導(dǎo)蛋白可以是無(wú)論直接或間 接地能夠從TREM-1向報(bào)道基因構(gòu)建體發(fā)送或傳送信號(hào)的任何蛋白，并且可以包括DAP10、 DAP12、TCR4、FC yRIII、Fc受體，或能夠從TREM-1向報(bào)道基因構(gòu)建體發(fā)送或傳送信號(hào)的 任何其它蛋白。可選地，所述信號(hào)傳導(dǎo)蛋白可以是TREM-1/信號(hào)傳導(dǎo)嵌合分子。所述報(bào)道基 因構(gòu)建體包含轉(zhuǎn)錄因子和報(bào)道基因，其依次編碼產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)例如可定量的信號(hào)的報(bào) 道蛋白。所述轉(zhuǎn)錄因子可以是NFAT或NFkB或本領(lǐng)域已知的任何其它合適的轉(zhuǎn)錄因子。報(bào)道 基因可以編碼β -半乳糖苷酶、熒光素酶、綠色熒光蛋白（GFP)、氯霉素轉(zhuǎn)移酶或能夠產(chǎn)生 可檢測(cè)的信號(hào)的任何其它報(bào)道蛋白。可以用于此生物測(cè)定的一個(gè)合適的細(xì)胞系是BWZ. 36/ hTREM-l:DAP12:NFAT-LacZ Τ-細(xì)胞(本文也鑒定為"BWZ/hTREM-Ι報(bào)道基因細(xì)胞")，在實(shí)施 例中詳細(xì)描述其產(chǎn)生。當(dāng)被活化時(shí)，BWZ/hTREM-Ι報(bào)道基因細(xì)胞產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，其產(chǎn) 生可以使用本領(lǐng)域已知的設(shè)備或試劑盒，例如Beta Glow? (Promega Ε4720, Madison, WI, USA)進(jìn)行測(cè)量。
[0077] 可以通過(guò)與PGLYRP1和任選地，多聚化試劑一起孵育活化第一細(xì)胞或第一細(xì)胞的 群體。任選的多聚化試劑作為PGLYRP1的支架，并且可以是肽聚糖（PGN)、嗜中性粒細(xì)胞的 細(xì)胞外陷講（neutrophil extracellular traps, NETs)、透明質(zhì)酸（hyaloronic acid)、蛋 白聚糖結(jié)構(gòu)（如多功能蛋白聚糖（versican)、聚集蛋白聚糖、核心蛋白聚糖或纖維蛋白），或 能夠多聚化或呈遞PGLYRP1的任何其它天然存在的基質(zhì)結(jié)構(gòu)或分子。所述第一細(xì)胞可以 通過(guò)與一種或多種在其表面或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)PGLYRP1的第二細(xì)胞一起孵育被活化。細(xì)胞內(nèi) 表達(dá)的實(shí)例可以是PGLYRP1在分泌顆粒中的儲(chǔ)存。所述第二細(xì)胞可以因此是表達(dá)或轉(zhuǎn)染有 編碼PGLYRP1的基因和在其表面表達(dá)PGLYRP1的任何細(xì)胞(或細(xì)胞群體)。該第二細(xì)胞可以 是原核或真核細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如CH0細(xì)胞、BHK細(xì)胞或HEK細(xì)胞。所述第二細(xì) 胞還可以是活化的嗜中性粒細(xì)胞。嗜中性粒細(xì)胞可以從個(gè)體的全血或組織中獲得,并大量 (in bulk)或作為純化的嗜中性粒細(xì)胞使用。模擬嗜中性粒細(xì)胞的細(xì)菌活化的任何試劑， 例如來(lái)自細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖（PGN)，例如PGN-SA、PGN-EB、PGN-EC、PGN-BS (InVivogen， tlrl-pgnsa, SanDiego, CA)可以用于活化嗜中性粒細(xì)胞。
[0078] 然后檢測(cè)并優(yōu)選測(cè)量第一細(xì)胞或第一細(xì)胞的群體的活性。
[0079] 第一細(xì)胞和一種或多種表達(dá)PGLYRP1的第二細(xì)胞的培養(yǎng)物和/或第一細(xì)胞與 PGLYRP1孵育的培養(yǎng)物，以及任選地，多聚化試劑例如PGN，與已產(chǎn)生的針對(duì)PGLYRP1的抗體 接觸。檢測(cè)并優(yōu)選測(cè)量第一細(xì)胞或第一細(xì)胞的群體的活性。
[0080] 以此方式，可以鑒定能夠結(jié)合TREM-1的配體PGLYRP1和影響PGLYRP1與TREM-1 相互作用的抗體。導(dǎo)致第一細(xì)胞的活性增加的PGLYRP1抗體增強(qiáng)PGLYRP1與TREM-1的相 互作用并且在本文鑒定為"刺激性PGLYRP1抗體"。導(dǎo)致第一細(xì)胞的活性降低的PGLYRP1抗 體降低、干擾或阻斷PGLYRP1與TREM-1的相互作用并且在本文鑒定為"抑制性PGLYRP1抗 體"。抑制性PGLYRP1抗體降低或阻斷TREM-1活化和信號(hào)傳導(dǎo)。
[0081] 因此，本發(fā)明涉及表征PGLYRP1抗體功能的方法。能夠特異性結(jié)合PGLYRP1并具 有對(duì)TREM-1活化和下游信號(hào)傳導(dǎo)的任何影響的抗體在本文中稱為"功能性PGLYRP1抗體"。 因此，術(shù)語(yǔ)"功能性PGLYRP1抗體"意在涵蓋刺激性PGLYRP1抗體和抑制性PGLYRP1抗體。
[0082] 此外，本發(fā)明涉及能夠特異性結(jié)合PGLYRP1和降低、干擾或阻斷其與TREM-1的相 互作用，從而降低TREM-1活化和下游信號(hào)傳導(dǎo)的抗體。本發(fā)明的抗體可以具有免疫調(diào)節(jié) 功能，降低表達(dá)TREM-1的髓樣細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生。例如，本發(fā)明的抗體可以降低或阻止 TNF- a、IL-1 β、IL-6、IFN- γ、ΜΙΡ-1 β、MCP-1、IL-8 和 / 或 GM-CSF 從髓樣細(xì)胞例如巨噬 細(xì)胞和/或嗜中性粒細(xì)胞和/或患病組織例如滑膜組織中髓樣細(xì)胞的釋放。本發(fā)明的抗體 可以能夠下調(diào)嗜中性粒細(xì)胞應(yīng)答。
[0083] 根據(jù)本發(fā)明的PGLYRP1抗體可以通過(guò)直接或間接影響TREM-1的一種機(jī)制或幾種 不同機(jī)制的組合降低或阻斷TREM-1活化。本發(fā)明的抗體可以阻止PGLYRP1產(chǎn)生與TREM-1 的功能復(fù)合物。
[0084] 本發(fā)明的抗體可以通過(guò)降低或阻斷TREM-1活化和下游信號(hào)傳導(dǎo)阻斷PGLYRP1功 能。
[0085] 本發(fā)明還涉及可通過(guò)本文公開(kāi)的方法之外的其它手段鑒定的抑制性PGLYRP1抗 體。
[0086] 本發(fā)明的抗體可以能夠結(jié)合人PGLYRP1和來(lái)自人之外的物種的PGLYRP1。如本 文所用術(shù)語(yǔ)"PGLYRP1"從而涵蓋PGLYRP1的任何天然存在形式，其可以衍生自任何合適的 生物，例如無(wú)脊椎動(dòng)物物種或脊椎動(dòng)物物種。如本文所述使用的PGLYRP1可以是脊椎動(dòng) 物PGLYRP1，例如哺乳動(dòng)物PGLYRP1，例如來(lái)自靈長(zhǎng)類(lèi)(例如人、黑猩猩、食蟹猴或恒河猴）的 PGLYRP1 ;嚙齒動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)，兔形目動(dòng)物(如兔)，或偶蹄動(dòng)物(如牛、綿羊、豬或駱 駝)等等。優(yōu)選地,PGLYRP1 是人 PGLYRP1 (SEQ ID Ν0: 1)。PGLYRP1 可以是 PGLYRP1 的成 熟形式，例如在合適的細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)經(jīng)歷翻譯后加工的PGLYRP1蛋白。這樣的成熟PGLYRP1 蛋白可以例如是糖基化的。PGLYRP1可以是全長(zhǎng)PGLYRP1蛋白。PGLYRP1可以是剪接變體。
[0087] 本發(fā)明的抗體還可以能夠特異性結(jié)合PGLYRP1的變體，例如SEQ ID N0: 37 (II 型 1.0 PGLYRP1)和 / 或 SEQ ID NO: 38 (II 型 1.0 PGLYRP1)。
[0088] 本發(fā)明的抗體可以能夠影響，例如抑制/降低/阻斷人TREM-1和來(lái)自人以外的另 一物種的TREM-1的活性(信號(hào)傳導(dǎo)和/或活化)。如本文所用術(shù)語(yǔ)"TREM-1"從而涵蓋TREM-1 的任何天然存在形式，其可以衍生自任何合適的生物。例如，如本文所述使用的TREM-1可 以是脊椎動(dòng)物TREM-1，例如哺乳動(dòng)物TREM-1，例如來(lái)自靈長(zhǎng)類(lèi)(例如人、黑猩猩、食蟹猴或 恒河猴）的TREM-1 ;嚙齒動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)，兔形目動(dòng)物(如兔)，或偶蹄動(dòng)物(如牛、綿 羊、豬或駱駝）等等。優(yōu)選地，所述TREM-1是人TREM-1。TREM-1可以是TREM-1的成熟形 式，例如在合適的細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)經(jīng)歷翻譯后加工的TREM-1蛋白。這樣的成熟TREM-1蛋白可 以例如是糖基化的。TREM-1可以是全長(zhǎng)TREM-1蛋白。TREM-1可以是剪接變體。
[0089] 本文術(shù)語(yǔ)"抗體"指衍生自種系免疫球蛋白序列的蛋白，其能夠特異性結(jié)合 PGLYRP1或其部分。所述術(shù)語(yǔ)包括任何同種型（S卩，IgA、IgE、IgG、IgM和/或IgY)的全長(zhǎng) 抗體和任何單鏈或其片段。特異性結(jié)合PGLYRP1或其部分的抗體，可以排他性結(jié)合PGLYRP1 或其部分，或其可以結(jié)合有限數(shù)目的同源性抗原或其部分。
[0090] 本發(fā)明的抗體可以是單克隆抗體，在這個(gè)意義上，它們可以直接或間接地衍生自B 淋巴細(xì)胞的單一克隆。本發(fā)明的抗體可以是單克隆抗體，前提是其不是188C424 (Thermo Scientific)、4H230 或 9A319 (US Biological)或克隆 6D653(Santa Cruz Biotechnology)。
[0091] 本發(fā)明的抗體可以是分離的。術(shù)語(yǔ)"分離的抗體"指已從其天然環(huán)境的另一種/其 它一種或多種組分中分離和/或回收，和/或從其天然環(huán)境中組分的混合物純化的抗體。
[0092] 抗體可以在原核細(xì)胞、真核細(xì)胞或衍生自細(xì)胞提取物的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中重組表達(dá)。 所述原核細(xì)胞可以是大腸桿菌。所述真核細(xì)胞可以是酵母、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如衍 生自下列生物的細(xì)胞：靈長(zhǎng)類(lèi)(例如人、黑猩猩、食蟹猴或恒河猴)、嚙齒動(dòng)物(例如小鼠或大 鼠)、兔形目動(dòng)物(如兔)或偶蹄動(dòng)物(如牛、綿羊、豬或駱駝)。合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括但 不限于HEK293細(xì)胞、CH0細(xì)胞和HELA細(xì)胞。PGLYRP1抗體還可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的其它方法產(chǎn)生，例如噬菌體展示或酵母展示。本發(fā)明的抗體可以在體內(nèi)通過(guò)用PGLYRP1、 表達(dá)PGLYRP1的細(xì)胞或兩者的組合免疫合適的哺乳動(dòng)物產(chǎn)生。
[0093] 可以使用例如實(shí)施例中描述的方法產(chǎn)生、篩選和純化PGLYRP1抗體。簡(jiǎn)而言之， 任何合適的小鼠，包括PGLYRP1敲除（K0)小鼠或TREM-1 K0小鼠都可以用PGLYRP1、表達(dá) PGLYRP1的細(xì)胞或兩者的組合進(jìn)行免疫。可以使用直接ELISA或FMAT進(jìn)行雜交瘤上清液的 初篩并且可以使用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)進(jìn)行復(fù)篩。可以隨后篩選結(jié)合例如全長(zhǎng)PGLYRP1的陽(yáng)性雜 交瘤上清液以及純化的抗體。然后可以測(cè)試陽(yáng)性雜交瘤上清液或純化的抗體其降低或阻斷 TREM-1攜帶細(xì)胞的PGLYRP1刺激的能力。本發(fā)明的方法可以用于此目的。
[0094] 本發(fā)明的全長(zhǎng)抗體可以包含至少四條多肽鏈：即通過(guò)二硫鍵相互連接的兩條重 (H)鏈和兩條輕（L)鏈。一個(gè)具有特定藥物興趣的免疫球蛋白亞類(lèi)是IgG家族，其可以細(xì) 分為同種型IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。IgG分子由通過(guò)兩個(gè)或更多個(gè)二硫鍵相互連接的兩 條重鏈和各自通過(guò)二硫鍵連接到重鏈的兩條輕鏈構(gòu)成。重鏈可以包含重鏈可變區(qū)（VH)和 至多三個(gè)重鏈恒定（CH)區(qū)：CH1、CH2和CH3。輕鏈可以包含輕鏈可變區(qū)（VL)和輕鏈恒定區(qū) (CL)。VH和VL區(qū)可以進(jìn)一步細(xì)分為高變區(qū)，稱為互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R)，其間散布更保守的稱 為框架區(qū)（FR)的區(qū)域。VH和VL區(qū)通常由三個(gè)CDR和四個(gè)FR構(gòu)成，以下列順序從氨基端向 羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的高變區(qū)形成能夠與抗原 (PGLYRP1)相互作用的[結(jié)合]結(jié)構(gòu)域，而抗體的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白對(duì)宿主組織或 因子的結(jié)合，包括但不限于免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞)、Fc受體和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第 一組分（Clq)。
[0095] 抗原結(jié)合片段的實(shí)例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab'）2、F(ab)S、Fv(通常為抗 體的單個(gè)臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域）、單鏈Fv(scFv;參見(jiàn)例如Bird等，Science 1988; 242:42S-426;和 Huston 等 PNAS 1988 ;85:5879-5883)、dsFv、Fd (通常為 VH 和 CHI 結(jié) 構(gòu)域）以及dAb (通常為VH結(jié)構(gòu)域）片段；VH、VL、VhH和V-NAR結(jié)構(gòu)域；包含單個(gè)VH和單 個(gè)VL鏈的單價(jià)分子；微型抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體和κ抗體（kappa bodies) (參見(jiàn)，例如111等Protein Eng 1997;10:949-57);駱駝IgG;IgNAR;以及一個(gè)或多個(gè)分 離的CDR或功能互補(bǔ)位，其中分離的CDR或抗原結(jié)合殘基或多肽可以結(jié)合或連接在一起，以 便形成功能抗體片段。抗體片段的各種類(lèi)型已描述于或綜述于，例如Holliger和Hudson, Nat Biotechnol 2005; 2S: 1126-1136 ;W02005040219 和公開(kāi)的美國(guó)專利申請(qǐng) 20050238646 和 20020161201。
[0096] 在本發(fā)明的背景下抗體的某些抗原結(jié)合片段可以是合適的，因?yàn)槠湟呀?jīng)顯示，可 以通過(guò)全長(zhǎng)抗體的片段實(shí)現(xiàn)所述抗體的抗原結(jié)合功能。術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合片段"指抗體 的一個(gè)或多個(gè)片段，其保留特異性結(jié)合如本文所述的抗原例如人PGLYRP1或來(lái)自另一物種 的卩61^1^1的能力。抗原結(jié)合片段的實(shí)例包括？ &13、？&13'、？祕(mì))2、？祕(mì)'）2、？祕(mì))5、？奴通 常為抗體的單個(gè)臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域）、單鏈Fv(scFv ;參見(jiàn)例如Bird等，Science 1988; 242:42S-426;和 Huston 等 PNAS 1988 ;85:5879-5883)、dsFv、Fd (通常為 VH 和 CHI 結(jié) 構(gòu)域）以及dAb (通常為VH結(jié)構(gòu)域）片段；VH、VL、VhH和V-NAR結(jié)構(gòu)域；包含單個(gè)VH和單 個(gè)VL鏈的單價(jià)分子；微型抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體和κ抗體（kappa bodies) (參見(jiàn)，例如111等Protein Eng 1997;10:949-57);駱駝IgG;IgNAR;以及一個(gè)或多個(gè)分 離的CDR或功能互補(bǔ)位，其中分離的CDR或抗原結(jié)合殘基或多肽可以結(jié)合或連接在一起，以 便形成功能抗體片段。抗體片段的各種類(lèi)型已描述于或綜述于，例如Holliger和Hudson, Nat Biotechnol 2005; 2S: 1126-1136 ;W02005040219 和公開(kāi)的美國(guó)專利申請(qǐng) 20050238646 和20020161201。這些抗體片段可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得，并且可以以 與完整抗體相同的方式篩選該片段的效用。
[0097] 本發(fā)明的抗體可以是人抗體或人源化的抗體。如本文所用術(shù)語(yǔ)"人抗體"意在包 括具有可變區(qū)的抗體，其中至少框架區(qū)的一部分和/或至少CDR區(qū)的一部分衍生自人種系 免疫球蛋白序列。（例如，人抗體可以具有可變區(qū)，其中框架區(qū)和CDR區(qū)均衍生自人種系免 疫球蛋白序列)。此外，如果抗體包含恒定區(qū)，則該恒定區(qū)也衍生自人種系免疫球蛋白序列。 本發(fā)明的人抗體可以包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過(guò)隨機(jī)或 位點(diǎn)特異性誘變體外引入的突變或通過(guò)體細(xì)胞突變體內(nèi)引入的突變)。
[0098] 這樣的人抗體可以是人單克隆抗體。這樣的人單克隆抗體可以通過(guò)雜交瘤產(chǎn)生， 其包括融合無(wú)限增殖化細(xì)胞的從具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因 非人動(dòng)物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的B細(xì)胞。
[0099] 可以從建立在人種系序列的選擇上，進(jìn)一步用天然和合成序列多樣性進(jìn)行多樣化 的序列文庫(kù)中分離人抗體。
[0100] 可以通過(guò)人淋巴細(xì)胞的體外免疫隨后是用EB病毒進(jìn)行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化來(lái)制備人抗 體。
[0101] 術(shù)語(yǔ)"人抗體衍生物"指人抗體的任何修飾形式，例如抗體和另一試劑或另一抗體 的綴合物。
[0102] 如本文所用術(shù)語(yǔ)"人源化抗體"指包含衍生自非人免疫球蛋白的一種或多種序列 (CDR區(qū)）的人/非人嵌合抗體。因此，人源化抗體是人免疫球蛋白（受體抗體)，其中至少來(lái) 自受體高變區(qū)的殘基被來(lái)自非人物種的高變區(qū)(供體抗體）的殘基取代，所述非人物種例如 來(lái)自小鼠、大鼠、兔或具有所期望的特異性、親和力和能力的非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。在一些情況 下，人免疫球蛋白的FR殘基被相應(yīng)的非人殘基取代。這樣的修飾的實(shí)例是一個(gè)或多個(gè)所謂 回復(fù)突變的引入。
[0103] 此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中未發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾 以進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。通常，人源化抗體將包含至少一個(gè)一通常兩個(gè)一可變結(jié)構(gòu) 域，其中所有或基本上所有CDR區(qū)對(duì)應(yīng)非人免疫球蛋白的那些，并且其中所有或基本上所 有的FR殘基是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體可以任選地還包含至少一部分免疫 球蛋白恒定區(qū)（Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。
[0104] 術(shù)語(yǔ)"人源化抗體衍生物"指人源化抗體的任何修飾形式，例如抗體和另一試劑或 另一抗體的綴合物。
[0105] 如本文所用術(shù)語(yǔ)"嵌合抗體"指其輕鏈和重鏈基因已從源自不同物種的免疫球蛋 白可變和恒定區(qū)基因進(jìn)行構(gòu)建(通常通過(guò)遺傳工程化）的抗體。例如，來(lái)自小鼠單克隆抗體 的基因的可變區(qū)段可以連接到人恒定區(qū)段。
[0106] 抗體的可結(jié)晶區(qū)片段("Fc區(qū)"/ "Fc結(jié)構(gòu)域"）是抗體的N末端區(qū)域，其包含恒定 CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。Fc結(jié)構(gòu)域可以與稱為Fc受體的細(xì)胞表面受體以及補(bǔ)體系統(tǒng)的一些蛋 白相互作用。Fc區(qū)使抗體能夠與免疫系統(tǒng)相互作用。在本發(fā)明的一個(gè)方面，抗體可以被 工程化以在Fc區(qū)內(nèi)包括修飾，通常改變一種或多種其功能特性，例如血清半衰期、補(bǔ)體結(jié) 合、Fc-受體結(jié)合、蛋白穩(wěn)定性和/或抗原依賴性細(xì)胞毒性、或其缺乏，等等。此外，本發(fā)明 的抗體可以被化學(xué)修飾(例如，一種或多種化學(xué)基團(tuán)可以連接到抗體）或被修飾以改變其糖 基化，仍然為了改變抗體的一種或多種功能特性。優(yōu)選地，修飾的Fc結(jié)構(gòu)域包含一種或多 種，并且可能所有下列突變，其將分別導(dǎo)致對(duì)某些Fc受體的親和力下降（L234A、L235E和 G237A)和Clq介導(dǎo)的補(bǔ)體結(jié)合降低（A330S和P331S)(殘基編號(hào)根據(jù)EU索引）。
[0107] 本發(fā)明的抗體的同種型可以是IgG，例如IgGl，例如IgG2,例如IgG4。如果需要， 抗體的種類(lèi)可以被已知技術(shù)"轉(zhuǎn)換"。例如，最初作為IgM分子產(chǎn)生的抗體可以類(lèi)別轉(zhuǎn)換為 IgG抗體。類(lèi)別轉(zhuǎn)換技術(shù)也可以用于將一種IgG亞類(lèi)轉(zhuǎn)換為另一種，例如，從IgGl到IgG2 或IgG4 ;從IgG2到IgGl或IgG4 ;或從IgG4到IgGl或IgG2。還可以通過(guò)組合來(lái)自不同 IgG亞類(lèi)的區(qū)域進(jìn)行抗體的工程化以產(chǎn)生恒定區(qū)嵌合分子。
[0108] 在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾CH1的鉸鏈區(qū)使得鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)目被改 變，例如增加或降低。此方法例如在美國(guó)專利號(hào)5, 677, 425中由Bodmer等進(jìn)一步描述。
[0109] 可以進(jìn)一步修飾恒定區(qū)以穩(wěn)定抗體，例如以降低二價(jià)抗體分成兩個(gè)單價(jià)VH-VL片 段的風(fēng)險(xiǎn)。例如，在IgG4恒定區(qū)，可以突變殘基S241成脯氨酸（P)殘基以允許在鉸鏈處完 全的二硫鍵形成（參見(jiàn)，例如 Angal 等，Mollmmunol. 199S;30:105-8)。
[oho] 抗體或其片段還可以根據(jù)它們的互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R)進(jìn)行限定。當(dāng)用于本文時(shí)， 術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)決定區(qū)"或"高變區(qū)"指涉及抗原結(jié)合的氨基酸殘基位于其中的抗體區(qū)域。所 述⑶R通常由輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中氨基酸殘基24-34 (Ll)、50-56 (L2)和89-97 (L3)以 及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中 31-35 (Hl)、50-65 (H2)和 95-102 (H3)構(gòu)成；（Kabat 等（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services，NIH Publication No. 91-3242)和 / 或來(lái)自"高變環(huán)" 的那些殘基（輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中殘基26-32 (LI)、50-52 (L2)和91-96 (L3)，以及重鏈 可變結(jié)構(gòu)域中 26_32 (HI)、53-55 (H2)和 ％-101 (H3);Chothia 和 Lesk，J. Mol. Biol 1987; 196:901-917)構(gòu)成。通常，此區(qū)域中氨基酸殘基通過(guò)上文Kabat等中所述方法進(jìn)行編 號(hào)。短語(yǔ)例如"Kabat位置"、"Kabat殘基"和"根據(jù)Kabat"本文指此編號(hào)系統(tǒng)用于重鏈可 變結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。使用Kabat編號(hào)系統(tǒng)，肽的實(shí)際線性氨基酸序列可包含對(duì)應(yīng) 可變結(jié)構(gòu)域的框架（FR)或CDR的縮短或插入的更少或額外的氨基酸。例如，重鏈可變結(jié)構(gòu) 域可以包括在⑶R H2的殘基52后的氨基酸插入(根據(jù)Kabat，殘基52a、52b和52c)和在重 鏈FR殘基82之后插入的殘基(例如，根據(jù)Kabat，殘基82a、82b和82c等)。對(duì)于給定的抗 體，殘基的Kabat編號(hào)可以通過(guò)在抗體序列的同源性區(qū)域與"標(biāo)準(zhǔn)"Kabat編號(hào)的序列的比 對(duì)來(lái)確定。
[0111] 如本文所定義的術(shù)語(yǔ)"框架區(qū)"或"FR"殘基指不在⑶R內(nèi)的那些VH或VL氨基酸 殘基。
[0112] 本發(fā)明的抗體可以包含來(lái)自一種或多種本文公開(kāi)的特異性抗體的CDR區(qū)，例如來(lái) 自 SEQ ID N0: 15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、35 或 36 內(nèi)的 CDR 區(qū)。
[0113] 1F36抗體具有如SEQ ID N0: 15所示的重鏈和如SEQ ID N0: 16所示的輕鏈。本 發(fā)明的抗體可以包含此可變重鏈序列和/或此可變輕鏈序列。所述1F36抗體具有SEQ ID NO: 15的氨基酸31至35、50至66和98至108和SEQ ID NO: 16的氨基酸24至34、51至 56和89至97所示的⑶R序列。本發(fā)明的抗體可以包含1、2、3、4、5或所有6個(gè)這些⑶R序 列。
[0114] 根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID N0: 15的氨基酸殘基31至35(SYWMN) 的CDRH1序列，其中這些氨基酸殘基之一可以被不同的氨基酸殘基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 15的氨基酸50至66 (MIHPSDSETRLNQKFKD)的⑶RH2序列，其中這些氨基酸的一個(gè)、 兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸殘基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 15的氨基酸殘基98至 108 (DYSDYDGFAY])的⑶RH3序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的 氨基酸取代。
[0115] 根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID N0: 16的氨基酸殘基24至34 (RASQSISDYLH)的⑶RL1序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基 酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 16的氨基酸殘基51至56 (ASQSIS)的CDRL2序列，其中 這些氨基酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)可以被不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 16的氨 基酸殘基89至97 (QNGHSFPLT)的⑶RL3序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)可以被 不同的氨基酸取代。
[0116] 1F10抗體具有如SEQ ID N0:19所示的重鏈和如SEQ ID N0:20所示的輕鏈。本 發(fā)明的抗體可以包含此可變重鏈序列和/或此可變輕鏈序列。所述1F10抗體具有SEQ ID NO: 19的氨基酸31至35、50至66和99至109和SEQ ID NO: 20的氨基酸24至33、49至 55和88至96所示的⑶R序列。本發(fā)明的抗體可以包含1、2、3、4、5或所有6個(gè)這些⑶R序 列。
[0117] 根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID N0: 19的氨基酸殘基31至35(DYNMY) 的CDRH1序列，其中這些氨基酸殘基之一可以被不同的氨基酸殘基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 19的氨基酸50至66 (HDPYNGDTSYNQKFKG)的⑶RH2序列，其中這些氨基酸的一個(gè)、 兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸殘基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 19的氨基酸殘基99至 109 (⑶YGNPFYLDY)的⑶RH3序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的 氨基酸取代。
[0118] 根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包含對(duì)應(yīng)SEQ ID NO: 20的氨基酸殘基24至33 (SVSSSVNYMY)的⑶RL1序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基 酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 20的氨基酸殘基49至55 (DTSKLPS)的CDRL2序列，其中 這些氨基酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)可以被不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 20的氨 基酸殘基88至96 (QQWTSNPPT)的⑶RL3序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)可以被 不同的氨基酸取代。
[0119] 1F105抗體具有如SEQ ID N0: 23所示的重鏈和如SEQ ID N0: 24所示的輕鏈。 本發(fā)明的抗體可以包含此可變重鏈序列和/或此可變輕鏈序列。所述1F105抗體具有SEQ ID N0: 23的氨基酸31至35、50至66和99至108和SEQ ID N0: 24的氨基酸24至33、 49至55和88至96所示的CDR序列。本發(fā)明的抗體可以包含1、2、3、4、5或所有6個(gè)這些 CDR序列。
[0120] 根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID N0: 23的氨基酸殘基31至35(DTYIH) 的CDRH1序列，其中這些氨基酸殘基之一可以被不同的氨基酸殘基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 23的氨基酸50至66 (RIDPANDDTKYDPNFQG)的CDRH2序列，其中這些氨基酸的一個(gè)、 兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸殘基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 23的氨基酸殘基99至 108 (SDNSDSWFAY)的⑶RH3序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨 基酸取代。
[0121] 根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID N0: 24的氨基酸殘基24至33 (SVSSSVNFMN)的⑶RL1序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基 酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 24的氨基酸殘基49至55 (DTSKLAP)的CDRL2序列，其中 這些氨基酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)可以被不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 24的氨 基酸殘基88至96 (HQWSSYSLT)的⑶RL3序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)可以被 不同的氨基酸取代。
[0122] 1F95抗體具有如SEQ ID N0: 27所示的重鏈和如SEQ ID N0: 28所示的輕鏈。本 發(fā)明的抗體可以包含此可變重鏈序列和/或此可變輕鏈序列。所述1F95抗體具有SEQ ID NO: 27的氨基酸31至35、50至66和99至106和SEQ ID NO: 28的氨基酸24至33、49至 54和87至95所示的⑶R序列。本發(fā)明的抗體可以包含1、2、3、4、5或所有6個(gè)這些⑶R序 列。
[0123] 根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID N0: 27的氨基酸殘基31至35(DYNMH) 的CDRH1序列，其中這些氨基酸殘基之一可以被不同的氨基酸殘基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 27的氨基酸50至66 (YVDPYDGGTSSNQKFKG)的⑶RH2序列，其中這些氨基酸的一個(gè)、 兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸殘基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 27的氨基酸殘基99至 106 (EVPYYFDY)的⑶RH3序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基 酸取代。
[0124] 根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID N0: 28的氨基酸殘基24至33 (VASSSVTYMY)的⑶RL1序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基 酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 28的氨基酸殘基49至54 (THPLAS)的CDRL2序列，其中 這些氨基酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)可以被不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 28的氨 基酸殘基87至95 (PHWNTNPPT)的⑶RL3序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)可以被 不同的氨基酸取代。
[0125] 2F5抗體具有如SEQ ID N0: 31所示的重鏈和如SEQ ID N0: 32所示的輕鏈。本 發(fā)明的抗體可以包含此可變重鏈序列和/或此可變輕鏈序列。所述2F5抗體具有SEQ ID NO: 31的氨基酸35至31、50至66和99至109和SEQ ID NO: 32的氨基酸24至33、49至 55和88至96所示的⑶R序列。本發(fā)明的抗體可以包含1、2、3、4、5或所有6個(gè)這些⑶R序 列。
[0126] 根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID N0: 31的氨基酸殘基31至35(DYYMY) 的CDRH1序列，其中這些氨基酸殘基之一可以被不同的氨基酸殘基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 31的氨基酸50至66 (AISDDSTYTYYPDSVKG)的CDRH2序列，其中這些氨基酸的一個(gè)、 兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸殘基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 31的氨基酸殘基99至 109 (GGYGNLYAMDY)的⑶RH3序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的 氨基酸取代。
[0127] 根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID N0: 32的氨基酸殘基24至35 (TASSSVSSSYLH)的⑶RL1序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨 基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 32的氨基酸殘基51至57 (STSNLAS)的CDRL2序列，其 中這些氨基酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)可以被不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 32的 氨基酸殘基90至98 (HQYHRSPFT)的⑶RL3序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)可以 被不同的氨基酸取代。
[0128] 2F7抗體具有如SEQ ID N0: 35所示的重鏈和如SEQ ID N0: 36所示的輕鏈。本 發(fā)明的抗體可以包含此可變重鏈序列和/或此可變輕鏈序列。所述2F5抗體具有SEQ ID NO: 35的氨基酸31至35、50至66和99至109和SEQ ID NO: 36的氨基酸24至34、50至 56和89至96所示的⑶R序列。本發(fā)明的抗體可以包含1、2、3、4、5或所有6個(gè)這些⑶R序 列。
[0129] 根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID N0: 35的氨基酸殘基31至35(NYVMH) 的CDRH1序列，其中這些氨基酸殘基之一可以被不同的氨基酸殘基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 35的氨基酸50至66 (WINPFNDGTNYNENFKN)的CDRH2序列，其中這些氨基酸的一個(gè)、 兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸殘基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 35的氨基酸殘基99至 109 (SGFITTLIEDY)的⑶RH3序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的 氨基酸取代。
[0130] 根據(jù)本發(fā)明的抗體可以包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID N0: 36的氨基酸殘基24至34 (KASESVGSFVS)的⑶RL1序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基 酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 36的氨基酸殘基50至56 (GASNRYT)的⑶RL2序列，其中 這些氨基酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)可以被不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 36的氨 基酸殘基89至96 (GQYYTHPT)的⑶RL3序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)可以被不 同的氨基酸取代。
[0131] 術(shù)語(yǔ)"抗原"(Ag)指用于免疫具有免疫能力的脊椎動(dòng)物以產(chǎn)生識(shí)別Ag的抗體(Ab) 的分子實(shí)體。本文中，Ag更廣泛地定義并且通常意在包括被Ab特異性識(shí)別的目標(biāo)分子， 從而包括在免疫方法或用于生成Ab的其它方法如噬菌體展示中使用的分子的片段或模擬 物。
[0132] 如本文所用術(shù)語(yǔ)"表位"在"抗原結(jié)合多肽"例如抗體(Ab)，與其相應(yīng)抗原（Ag)之 間的分子相互作用的背景下進(jìn)行定義。通常，"表位"指Ab特異性結(jié)合到的Ag上的面積或 區(qū)域，即與Ab物理接觸的面積或區(qū)域。可以使用各種標(biāo)準(zhǔn)(例如，2-6 A的距離截止值，例 如3 A，例如4 A，例如5 A ;或溶劑可及性）對(duì)于Ab和Ag分子中的原子定義物理接觸。蛋 白表位可以包含Ag中結(jié)合Ab直接參與的氨基酸殘基(也稱為表位的免疫顯性成分)和不直 接參與結(jié)合的其它氨基酸殘基，例如被Ab有效封閉的Ag的氨基酸殘基，即在Ab的"溶劑排 除表面"和/或"足跡"內(nèi)的氨基酸殘基。
[0133] 本文術(shù)語(yǔ)表位包含特異性結(jié)合PGLYRP1抗體的PGLYRP1的任何特定區(qū)域中兩種類(lèi) 型的結(jié)合區(qū)域。PGLYRP1可以包含許多不同表位，其可以包括但不限于構(gòu)象表位(其由成熟 PGLYRP1構(gòu)象中位置彼此接近的一個(gè)或多個(gè)非鄰接氨基酸組成)，和翻譯后表位(其整體或 部分由共價(jià)連接PGLYRP1的分子結(jié)構(gòu)，例如碳水化合物基團(tuán)組成)。PGLYRP1還可以包含線 性表位。
[0134] 對(duì)于給定抗體(Ab) /抗原（Ag)對(duì)的表位可以使用多種實(shí)驗(yàn)性的和計(jì)算的表位作 圖方法在不同的細(xì)節(jié)層次上進(jìn)行描述和表征。所述實(shí)驗(yàn)性方法包括誘變、X射線晶體學(xué)、 核磁共振（NMR)光譜、氫氘交換質(zhì)譜（ΗΧ-MS)和各種競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的方法；這是本領(lǐng)域已知的方 法。由于每個(gè)方法依賴于獨(dú)特的原理，所以表位的描述與確定其的方法密切相關(guān)。因此，取 決于所采用的表位作圖的方法，對(duì)于給定的Ab/Ag對(duì)的表位可以不同地描述。
[0135] 在其最詳細(xì)的水平上，用于Ag和Ab之間的相互作用的表位可以通過(guò)限定Ag-Ab 相互作用中存在的原子接觸的空間坐標(biāo)，以及關(guān)于它們對(duì)結(jié)合熱力學(xué)的相對(duì)貢獻(xiàn)的信息來(lái) 描述。在更不詳細(xì)的水平上，該表位可以通過(guò)限定Ag和Ab之間的原子接觸的空間坐標(biāo)來(lái) 表征。在甚至更不詳細(xì)的水平上，表位可以通過(guò)氨基酸殘基表征，所述氨基酸殘基包括由特 定標(biāo)準(zhǔn)所定義的氨基酸殘基，諸如Ab:Ag復(fù)合物中原子之間的距離或溶劑可及性。在進(jìn)一 步更不詳細(xì)的水平上，表位可以通過(guò)功能，例如通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合其它Ab來(lái)表征。該表位也可 以更一般地定義為包括這樣的氨基酸殘基，其被另一種氨基酸的取代將改變Ab和Ag之間 的相互作用的特征。
[0136] 在由Ab如Fab片段與其Ag之間的復(fù)合物的空間坐標(biāo)限定的X射線衍生的晶體結(jié) 構(gòu)的背景下，術(shù)語(yǔ)表位在本文中，除非另有說(shuō)明或根據(jù)上下文矛盾，明確限定為PGLYRP1殘 基，其特征在于距離Ab中的重原子（S卩，非氫原子)，例如2-6 A，例如3 A，例如4 A，例如5 A內(nèi)具有重原子。
[0137] 根據(jù)表位的描述和定義取決于所使用的表位作圖方法在不同細(xì)節(jié)水平獲得的事 實(shí)，可以得出，對(duì)于相同Ag上的不同Ab的表位的比較可以類(lèi)似地在不同的細(xì)節(jié)水平上進(jìn) 行。
[0138] 在氨基酸水平描述的表位，例如根據(jù)X射線結(jié)構(gòu)確定，如果它們包含同一組氨基 酸殘基，則認(rèn)為是相同的。如果至少一個(gè)氨基酸被多個(gè)表位共有，則認(rèn)為表位是重疊的。如 果沒(méi)有氨基酸殘基被多個(gè)表位共有，則認(rèn)為表位是分開(kāi)的(獨(dú)特的)。
[0139] 術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)位"的定義通過(guò)反轉(zhuǎn)角度（reversing the perspective)衍生自"表 位"的上述定義。因此，術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)位"指Ab上的Ag特異性結(jié)合的面積或區(qū)域，即Ab用其 與Ag進(jìn)行物理接觸。
[0140] 在由Ab如Fab片段與其Ag之間的復(fù)合物的空間坐標(biāo)限定的X射線衍生的晶體結(jié) 構(gòu)的背景下，術(shù)語(yǔ)互補(bǔ)位在本文中，除非另有說(shuō)明或根據(jù)上下文矛盾，明確限定為Ag殘基， 其特征在于距離PGLYRP1中的重原子（S卩，非氫原子）4 A內(nèi)具有重原子。
[0141] 對(duì)于給定抗體（Ab) /抗原（Ag)對(duì)的表位和互補(bǔ)位可以通過(guò)常規(guī)方法鑒定。例 如，表位的通常定位可以通過(guò)評(píng)價(jià)抗體結(jié)合不同片段或變體PGLYRP1多肽的能力來(lái)確定。 PGLYRP1內(nèi)與抗體接觸的特定氨基酸(表位）和抗體內(nèi)與PGLYRP1接觸的特定氨基酸(互補(bǔ) 位）也可以使用常規(guī)方法確定。例如，可以組合抗體和目標(biāo)分子，并且可以結(jié)晶Ab :Ag復(fù)合 物。可以確定復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)并用于鑒定抗體和其目標(biāo)之間的相互作用的特異性位點(diǎn)。
[0142] 結(jié)合相同抗原的抗體可以關(guān)于它們同時(shí)結(jié)合它們共同的抗原的能力進(jìn)行表征，并 且可以進(jìn)行"競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合"/ "框并"（binning)。在本上下文中，術(shù)語(yǔ)"框并"指對(duì)結(jié)合相同 抗原的抗體分組的方法。抗體的"框并"可以基于兩種抗體對(duì)它們共同的抗原的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié) 合，在基于標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如表面等離子共振（SPR)、ELISA或流式細(xì)胞術(shù)的測(cè)定中。
[0143] 抗體的"框（bin) "使用參考抗體進(jìn)行限定。如果第二抗體不能與參考抗體同時(shí)結(jié) 合抗原，則所述第二抗體被認(rèn)為屬于與參考抗體相同的"框"。在此情況下，參考抗體和第二 抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗原的相同部分并且共同稱為（coined) "競(jìng)爭(zhēng)性抗體"。如果第二抗體能 夠與參考抗體同時(shí)結(jié)合抗原，則所述第二抗體被認(rèn)為屬于分開(kāi)的"框"。在此情況下，參考抗 體和第二抗體不競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗原的相同部分并且共同稱為"非競(jìng)爭(zhēng)性抗體"。
[0144] 抗體"框并"不提供關(guān)于表位的直接信息。競(jìng)爭(zhēng)抗體，即屬于相同"框"的抗體，可 以具有相同的表位、重疊的表位或甚至分開(kāi)的表位。后者是這樣的情況，即結(jié)合抗原上其表 位的參考抗體是否占據(jù)了第二抗體接觸抗原上其表位所需的空間（"空間位阻")。非競(jìng)爭(zhēng)性 抗體通常具有分開(kāi)的表位。
[0145] 根據(jù)本發(fā)明的抗體可以能夠與1F10競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PGLYRP1。根據(jù)本發(fā)明的抗體可以 能夠與lF36/mAb 0182競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PGLYRP1。根據(jù)本發(fā)明的抗體可以能夠與1F95競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 PGLYRP1。根據(jù)本發(fā)明的抗體可以能夠與lF105/mAb 0184競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PGLYRP1。根據(jù)本發(fā)明 的抗體可以能夠與2F5競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PGLYRP1。根據(jù)本發(fā)明的抗體可以能夠與2F7競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 PGLYRP1。因此，根據(jù)本發(fā)明的抗體可以屬于與這些抗體的任何一種或多種相同的框。
[0146] 本文術(shù)語(yǔ)"結(jié)合親和力"指兩個(gè)分子，例如抗體，或其片段，和抗原之間非共價(jià)相互 作用的強(qiáng)度的測(cè)量。術(shù)語(yǔ)"結(jié)合親和力"用于描述單價(jià)相互作用（內(nèi)在活性)。
[0147] 兩個(gè)分子，例如抗體或其片段和抗原之間通過(guò)單價(jià)相互作用的結(jié)合親和力可以通 過(guò)確定平衡解離常數(shù)（K D)來(lái)定量。接下來(lái)，KD可以通過(guò)測(cè)量復(fù)合物形成和解離的動(dòng)力學(xué)來(lái) 確定，例如通過(guò)SPR法。單價(jià)復(fù)合物的結(jié)合和解離相應(yīng)的速率常數(shù)分別稱作結(jié)合速率常數(shù) ka (或km)和解離速率常數(shù)kd (或kj。KD通過(guò)公式KD = kd / ka與ka和kd相關(guān)。
[0148] 按照上述定義，與不同分子相互作用相關(guān)的結(jié)合親和力，例如不同抗體對(duì)于給定 抗原的結(jié)合親和力的比較，可以通過(guò)比較單個(gè)抗體/抗原復(fù)合物的K D值進(jìn)行比較。
[0149] 本發(fā)明的PGLYRP1抗體對(duì)于其目標(biāo)（PGLYRP1)可以具有1 X 1(Γ6Μ或更低，1 X ΚΓ7 Μ或更低，1 X 1(Γ8Μ或更低，或1 X 1(Γ9Μ或更低，或1 X Κ^Μ或更低，1 X 1(ΓηΜ或更 低，1 X 1(Γ12Μ或更低或1 X 1(Γ13Μ或更低的KD。
[0150] 根據(jù)本發(fā)明的抗體可以能夠與另一分子，例如天然存在的配體或受體或另一種抗 體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PGLYRP1。因此，根據(jù)本發(fā)明的抗體可以能夠結(jié)合PGLYRP1，具有比也能夠結(jié)合 PGLYRP1的另一分子更高的親和力。抗體與天然配體/受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗原的能力可以通過(guò) 確定和比較目的相互作用的KD值和非目的相互作用的KD值來(lái)評(píng)估，所述目的相互作用例如 抗體和抗原之間的特異性相互作用。
[0151] 本文術(shù)語(yǔ)"結(jié)合特異性"指分子例如抗體或其片段與單個(gè)專屬抗原，或與有限數(shù)目 的高度同源性抗原（或表位）的相互作用。能夠特異性結(jié)合PGLYRP1的抗體不能結(jié)合不相 似的分子。根據(jù)本發(fā)明的抗體可以不能結(jié)合PGLYRP家族成員，例如PGLYRP2、PGLYRP3和 PGLYRP4。根據(jù)本發(fā)明的抗體可以不能結(jié)合人PGLYRP家族成員，例如人PGLYRP2、人PGLYRP3 和人 PGLYRP4。
[0152] 相互作用的特異性和平衡結(jié)合常數(shù)的值可以通過(guò)熟知的方法直接確定。評(píng)價(jià)配體 (例如抗體）結(jié)合它們的目標(biāo)的能力的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法是本領(lǐng)域已知的，并且包括，例如ELISA、 蛋白質(zhì)印跡、RIA和流式細(xì)胞術(shù)分析。抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)和結(jié)合親和力也可以通過(guò)本領(lǐng)域 已知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定，例如SPR來(lái)評(píng)價(jià)。
[0153] 可以進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定，其中抗體對(duì)目標(biāo)的結(jié)合與該目標(biāo)的另一配體(例如另 一抗體）對(duì)目標(biāo)的結(jié)合進(jìn)行比較。
[0154] 在另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的分子，例如本文所述PGLYRP1抗體、多核 苷酸、載體和細(xì)胞的組合物和制劑。例如，本發(fā)明提供了與藥學(xué)上可接受的載體一起配制的 包含一種或多種本發(fā)明的PGLYRP1抗體的藥物組合物。
[0155] 因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供包含這樣的PGLYRP1抗體的藥物制劑，所述抗體 以0.25 mg/ml至250 mg/ml的濃度存在，并且其中所述制劑具有2.0至10.0的pH。所 述制劑可以進(jìn)一步包含一種或多種緩沖系統(tǒng)、防腐劑、張力劑、螯合劑、穩(wěn)定劑或表面活性 齊U，以及它們的各種組合。防腐劑、等滲劑、螯合劑、穩(wěn)定劑和表面活性劑在藥物組合物中 的用途是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。可以參考Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995。
[0156] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物制劑是含水制劑。該制劑通常是溶液或懸浮液，但是 還可以包括膠體、分散液、乳狀液和多相材料。術(shù)語(yǔ)"含水制劑"定義為包含至少50%w/w水 的制劑。類(lèi)似地，術(shù)語(yǔ)"水溶液"定義為包含至少50%w/w水的溶液，并且術(shù)語(yǔ)"水懸浮液"定 義為包含至少50%w/w水的懸浮液。
[0157] 在另一實(shí)施方案中，所述藥物制劑是凍干的制劑，在使用前醫(yī)師或患者向其中添 加溶劑和/或稀釋劑。
[0158] 在進(jìn)一步的方面，所述藥物制劑包含這樣的抗體的水溶液，和緩沖液，其中所述抗 體以lmg/ml或以上的濃度存在，并且其中所述制劑具有約2. 0至約10. 0的pH。
[0159] 本發(fā)明的PGLYRP1抗體和包括這樣的抗體的藥物組合物可用于炎性疾病的治療， 例如下列炎性疾病：炎性腸病（IBD)、克羅恩病（CD)、潰瘍性結(jié)腸炎（UC)、腸易激綜合征、類(lèi) 風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA)、銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)、狼瘡性腎炎、I型糖尿病、 格雷夫斯氏病、多發(fā)性硬化(MS )、自身免疫性心肌炎、川崎病、冠狀動(dòng)脈疾病、慢性阻塞性肺 疾病、間質(zhì)性肺疾病、自身免疫性甲狀腺炎、硬皮病、系統(tǒng)性硬化癥、骨關(guān)節(jié)炎、特應(yīng)性皮炎、 白癜風(fēng)、移植物抗宿主病、Sjogrens綜合征、自身免疫性腎炎、Goodpasture綜合征、慢性炎 性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病、過(guò)敏癥、哮喘和急性或慢性炎癥導(dǎo)致的其它自身免疫性疾病。本 發(fā)明的PGLYRP1抗體和包含這些抗體的藥物組合物可以用于心血管疾病、中風(fēng)、缺血再灌 注損傷、肺炎、敗血病和癌癥的治療。
[0160] 本發(fā)明的PGLYRP1抗體適合在患有炎性腸病的個(gè)體的治療中使用。炎性腸病 (IBD)是可影響從口腔到肛門(mén)的胃腸道任何部分，引起多種癥狀的疾病。IBD主要引起腹 痛、腹瀉(可能帶血)、嘔吐或體重下降，但也可能引起胃腸道外的并發(fā)癥如皮疹、關(guān)節(jié)炎、目艮 的炎癥、疲勞和注意力不集中。患有IBD的患者可以分成兩大類(lèi)，患有潰瘍性結(jié)腸炎（UC)的 那些和患有克羅恩病（CD)的那些。雖然CD通常涉及回腸和結(jié)腸，其可以影響腸中的任何 區(qū)域，但往往是不連續(xù)的(疾病的集中區(qū)域散布到整個(gè)腸)，UC總是涉及直腸(結(jié)腸)，并且更 連續(xù)。在⑶中，炎癥是透壁的，導(dǎo)致膿腫、瘺和狹窄，而在UC中，炎癥通常局限于粘膜。對(duì) 于克羅恩病沒(méi)有已知的藥物或手術(shù)治療，而一些患有UC的患者可以通過(guò)手術(shù)移除結(jié)腸治 愈。治療選擇限于控制癥狀、維持緩解和預(yù)防復(fù)發(fā)。炎性腸病在臨床的效力可以測(cè)量為對(duì) 于CD的克羅恩病活動(dòng)指數(shù)（CDAI)評(píng)分的降低，其是基于實(shí)驗(yàn)室測(cè)試和生活質(zhì)量問(wèn)卷的評(píng) 分量表。在動(dòng)物模型中，效力主要通過(guò)體重增加，并且還通過(guò)疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI)的增加來(lái) 測(cè)量，所述疾病活動(dòng)指數(shù)是大便稠度、體重和血便的組合。
[0161] 本發(fā)明的PGLYRP1抗體適合在患有類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的個(gè)體的治療中使用。類(lèi)風(fēng)濕關(guān) 節(jié)炎（RA)是全身性疾病，其影響幾乎身體的所有部分(如果不是全部)，并且是關(guān)節(jié)炎的最 常見(jiàn)形式之一。其特征在于關(guān)節(jié)的炎癥應(yīng)答，其導(dǎo)致疼痛、僵硬、發(fā)熱、發(fā)紅和腫脹。這種炎 癥是炎癥細(xì)胞侵入關(guān)節(jié)的結(jié)果，并且這些炎性細(xì)胞釋放的酶可以消化骨和軟骨。結(jié)果是，這 種炎癥除其他生理效應(yīng)之外還可以導(dǎo)致嚴(yán)重的骨和軟骨損傷和關(guān)節(jié)退化和重度疼痛。所涉 及的關(guān)節(jié)可能會(huì)失去它的形狀和取向，導(dǎo)致疼痛和運(yùn)動(dòng)喪失。
[0162] 本領(lǐng)域已知有幾種動(dòng)物模型用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。例如，在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎 (CIA)模型中，小鼠發(fā)生類(lèi)似于人類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的炎性關(guān)節(jié)炎。由于CIA與RA共有類(lèi)似的 免疫學(xué)和病理學(xué)特征，這使得其成為合適的模型用于篩選潛在的人抗炎化合物。此模型中 的效力通過(guò)關(guān)節(jié)腫脹降低來(lái)測(cè)量。RA在臨床中的效力通過(guò)降低患者中癥狀的能力測(cè)量，其 作為關(guān)節(jié)腫脹、紅細(xì)胞沉降率、C-反應(yīng)蛋白水平和血清因子如抗瓜氨酸化蛋白抗體的水平 的組合進(jìn)行測(cè)量。
[0163] 本發(fā)明的PGLYRP1抗體適合在患有銀屑病的個(gè)體的治療中使用。銀屑病是可造成 相當(dāng)大的不適感的T細(xì)胞介導(dǎo)的皮膚的炎性病癥。它是這樣的疾病，對(duì)于其目前還沒(méi)有治 愈方法，并影響所有年齡的人。雖然患有輕度銀屑病的個(gè)體往往可以用外用制劑控制他們 的疾病，但全世界一百多萬(wàn)患者需要紫外線照射治療或全身性免疫抑制治療。不幸的是，紫 外線輻射的不便和風(fēng)險(xiǎn)以及很多療法的毒性限制了其長(zhǎng)期使用。另外，患者通常具有銀屑 病復(fù)發(fā)，并在某些情況下，停止免疫抑制治療后不久就反彈。最近開(kāi)發(fā)的基于CD4+ T細(xì)胞 轉(zhuǎn)移的銀屑病模型模擬人銀屑病的很多方面，并且因此可以用于鑒定適合在銀屑病的治療 中使用的化合物（Davenport 等，Internat. Immunopharmacol 2: 653-672，2002)。此模 型的效力使用評(píng)分系統(tǒng)通過(guò)皮膚病理學(xué)的降低進(jìn)行測(cè)量。同樣，患者中的效力通過(guò)皮膚病 理學(xué)降低進(jìn)行測(cè)量。
[0164] 本發(fā)明的PGLYRP1抗體適合在患有銀屑病關(guān)節(jié)炎的個(gè)體的治療中使用。銀屑病關(guān) 節(jié)炎（PA)是一種發(fā)生在銀屑病患者的亞群中的炎性關(guān)節(jié)炎。在這些患者中，皮膚病理學(xué)/ 癥狀伴有關(guān)節(jié)腫脹，類(lèi)似于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中見(jiàn)到的那些。其特征在于具有起鱗（scaling) 的皮膚炎癥的斑片狀、隆起、紅色區(qū)域。銀屑病經(jīng)常影響肘部和膝蓋的頂端、頭皮、肚臍和生 殖器區(qū)域周?chē)蚋亻T(mén)。大約10%的患有銀屑病的患者也發(fā)生他們的關(guān)節(jié)相關(guān)的炎癥。
[0165] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"治療"，指有需要的任何人或其它動(dòng)物對(duì)象的醫(yī)學(xué)治療。所述 對(duì)象預(yù)計(jì)由醫(yī)生或獸醫(yī)醫(yī)生進(jìn)行體檢，其已給予暫定的或明確的診斷，其將表明，使用所述 治療有益于所述人或其它動(dòng)物對(duì)象的健康。根據(jù)許多因素，如對(duì)象的健康的現(xiàn)狀，所述治療 的時(shí)機(jī)和目的可以從一個(gè)個(gè)體到另一個(gè)進(jìn)行變化。因此，所述治療可以是預(yù)防性的、姑息性 的、針對(duì)癥狀性的和/或治療性的。
[0166] 在本發(fā)明中，預(yù)防性的、姑息性的、針對(duì)癥狀性的和/或治療性的治療可以代表本 發(fā)明的單獨(dú)的方面。
[0167] 本發(fā)明的抗體可被胃腸外施用，如靜脈內(nèi)，如肌內(nèi)，如皮下。可選地，本發(fā)明的抗體 可以通過(guò)非腸胃外途徑施用，如口服或局部施用。本發(fā)明的抗體可被預(yù)防性施用。本發(fā)明 的抗體可以治療性施用（按需)。
[0168] 示例性實(shí)施方案 1.細(xì)胞，其表達(dá)TREM-1、TREM-1的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和被所述信號(hào)傳導(dǎo)蛋白活化的報(bào)道 基因構(gòu)建體。
[0169] 2.根據(jù)實(shí)施方案1的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是造血來(lái)源的。
[0170] 3.根據(jù)實(shí)施方案2的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是髓樣細(xì)胞。
[0171] 4.根據(jù)實(shí)施方案2的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是T細(xì)胞。
[0172] 5.根據(jù)實(shí)施方案1-4任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述信號(hào)傳導(dǎo)蛋白是DAP10。
[0173] 6.根據(jù)實(shí)施方案1-4任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述信號(hào)傳導(dǎo)蛋白是DAP12。
[0174] 7.根據(jù)實(shí)施方案1-4任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述信號(hào)傳導(dǎo)蛋白是TCIU。
[0175] 8.根據(jù)實(shí)施方案1-4任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述信號(hào)傳導(dǎo)蛋白是Fc YRIII。
[0176] 9.根據(jù)實(shí)施方案1-4任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述信號(hào)傳導(dǎo)蛋白是Fc受體。
[0177] 10.根據(jù)實(shí)施方案1-9任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述報(bào)道基因構(gòu)建體包含轉(zhuǎn)錄因子和 報(bào)道基因。
[0178] 11.根據(jù)實(shí)施方案10的細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)錄因子是NFAT。
[0179] 12.根據(jù)實(shí)施方案11的細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)錄因子是NFkB。
[0180] 13.根據(jù)實(shí)施方案10-12任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述報(bào)道基因編碼β-半乳糖苷酶。
[0181] 14.根據(jù)實(shí)施方案10-12任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述報(bào)道基因編碼熒光素酶。
[0182] 15.根據(jù)實(shí)施方案10-12任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述報(bào)道基因編碼綠色熒光蛋白 (GFP)。
[0183] 16.根據(jù)實(shí)施方案10-12任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述報(bào)道基因編碼氯霉素轉(zhuǎn)移酶。
[0184] 17.根據(jù)實(shí)施方案1_4、6、10-11和13任一項(xiàng)的細(xì)胞，其是BWZ. 36/ hTREM-l:DAP12:NFAT-LacZ Τ-細(xì)胞。
[0185] 18.刺激根據(jù)實(shí)施方案1-17任一項(xiàng)的細(xì)胞的方法，其包括使所述細(xì)胞與PGLYRP1 接觸。
[0186] 19.刺激根據(jù)實(shí)施方案1-17任一項(xiàng)的細(xì)胞的方法，其包括使所述細(xì)胞與PGLYRP1 和PGN接觸。
[0187] 20.根據(jù)實(shí)施方案18-19任一項(xiàng)的方法，其中所述PGLYRP1由細(xì)胞表達(dá)。
[0188] 21.根據(jù)實(shí)施方案20的方法，其中表達(dá)PGLYRP1的細(xì)胞是原核細(xì)胞。
[0189] 22.根據(jù)實(shí)施方案20的方法，其中表達(dá)PGLYRP1的細(xì)胞是真核細(xì)胞。
[0190] 23.根據(jù)實(shí)施方案22的方法，其中表達(dá)PGLYRP1的細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0191] 24.根據(jù)實(shí)施方案23的方法，其中表達(dá)PGLYRP1的細(xì)胞是活化的嗜中性粒細(xì)胞。
[0192] 25.根據(jù)實(shí)施方案23的方法，其中表達(dá)PGLYRP1的細(xì)胞是HEK細(xì)胞。
[0193] 26.鑒定TREM-1配體的方法，其包括：（a)培養(yǎng)根據(jù)實(shí)施方案1-18任一項(xiàng)的細(xì) 胞；（b)當(dāng)它與細(xì)胞、流體例如生物流體或組織接觸時(shí)(其觸發(fā)TREM-1的活化)，對(duì)所述表達(dá) TREM-1的細(xì)胞的活性進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)選定量；（c)使（b)的培養(yǎng)物與TREM-1蛋白接觸；（d)分 離結(jié)合TREM-1的組分以及（e)表征所分離的組分。
[0194] 27.鑒定特異性結(jié)合PGLYRP1并且修飾TREM-1介導(dǎo)的細(xì)胞活性的分子的方法，其 包括：（a)根據(jù)實(shí)施方案1-18中任一項(xiàng)培養(yǎng)細(xì)胞；（b)當(dāng)它與PGLYRP1和任選地，多聚化試 劑如PGN接觸時(shí)，對(duì)表達(dá)TREM-1的所述細(xì)胞的活性進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)選定量；（c)將（b)的培養(yǎng) 物與特異性結(jié)合PGLYRP1的分子接觸；和（d)檢測(cè)，優(yōu)選定量表達(dá)TREM-1的所述細(xì)胞的活 性小于或大于如（b)中測(cè)量的它的活性。
[0195] 28.鑒定修飾TREM-1介導(dǎo)的細(xì)胞活性的PGLYRP1抗體或其片段的方法，其包括： (a)根據(jù)實(shí)施方案1-18中任一項(xiàng)培養(yǎng)細(xì)胞；（b)當(dāng)它與PGLYRP1和任選地，多聚化試劑如 PGN接觸時(shí)，對(duì)表達(dá)TREM-1的所述細(xì)胞的活性進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)選定量；（c)將（b)的培養(yǎng)物與 結(jié)合PGLYRP1的抗體接觸；和（d)檢測(cè)，優(yōu)選定量表達(dá)TREM-1的所述細(xì)胞的活性小于或大 于如（b)中測(cè)量的它的活性。
[0196] 29.根據(jù)實(shí)施方案27的方法，其中所述PGLYRP1抗體或其片段降低TREM-1介導(dǎo) 的細(xì)胞活性，并且其中所述第一細(xì)胞在（d)中測(cè)量時(shí)的活性低于其在（b)中測(cè)量時(shí)的活性。
[0197] 30.根據(jù)實(shí)施方案27的方法，其中所述PGLYRP1抗體或其片段增加 TREM-1介導(dǎo) 的細(xì)胞活性，并且其中所述第一細(xì)胞在（d)中測(cè)量時(shí)的活性多于其在（b)中測(cè)量時(shí)的活性。
[0198] 31. PGLYRP1抗體或其片段，其通過(guò)根據(jù)實(shí)施方案28-30任一項(xiàng)的方法鑒定。
[0199] 32. PGLYRP1抗體或其片段，其能夠特異性結(jié)合PGLYRP1并降低PGLYRP1介導(dǎo)的 TREM-1 活性。
[0200] 33.根據(jù)實(shí)施方案31-32任一項(xiàng)的抗體或其片段，其能夠降低從表達(dá)TREM-1的細(xì) 胞中一種或多種細(xì)胞因子的釋放。
[0201] 34.根據(jù)實(shí)施方案31-33任一項(xiàng)的抗體或其片段，其是單克隆抗體。
[0202] 35.根據(jù)實(shí)施方案31-34任一項(xiàng)的抗體或其片段，其是人源化抗體。
[0203] 36.根據(jù)實(shí)施方案31-34任一項(xiàng)的抗體或其片段，其是人抗體。
[0204] 37.根據(jù)實(shí)施方案31-34任一項(xiàng)的抗體或其片段，其是嵌合抗體。
[0205] 38.根據(jù)實(shí)施方案31-37任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體的同種型是IgG。
[0206] 39.根據(jù)實(shí)施方案38的抗體，其中所述同種型是IgGl、IgG2或IgG4。
[0207] 40.根據(jù)實(shí)施方案37的抗體，其中所述抗體的同種型是IgGl。
[0208] 41.根據(jù)實(shí)施方案37的抗體，其中所述抗體的同種型是IgG4。
[0209] 42.根據(jù)實(shí)施方案31-41任一項(xiàng)的抗體或其片段，其能夠與抗體1F10競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 PGLYRP1。
[0210] 43.根據(jù)實(shí)施方案31-41任一項(xiàng)的抗體或其片段，其能夠與抗體lF36/mAb 0182 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PGLYRP1。
[0211] 44.根據(jù)實(shí)施方案31-41任一項(xiàng)的抗體或其片段，其能夠與抗體1F95競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 PGLYRP1。
[0212] 45.根據(jù)實(shí)施方案31-41任一項(xiàng)的抗體，其能夠與抗體lF105/mAb 0184競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 PGLYRP1。
[0213] 46.根據(jù)實(shí)施方案31-41任一項(xiàng)的抗體，其能夠與抗體2F5競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PGLYRP1。
[0214] 47.根據(jù)實(shí)施方案31-41任一項(xiàng)的抗體，其能夠與抗體2F7競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PGLYRP1。
[0215] 48.根據(jù)實(shí)施方案31-47任一項(xiàng)的抗體或其片段，其能夠特異性結(jié)合SEQ ID N0: 37 (II 型 1.0 PGLYRP1)和 / 或 SEQ ID NO: 38 (II 型 2.0 PGLYRP1)。
[0216] 49.根據(jù)實(shí)施方案31-48任一項(xiàng)的抗體或其片段，當(dāng)使用表面等離子共振測(cè)量 時(shí)，其對(duì)于其目標(biāo)具有1 X 1(Γ6Μ或更低，1 X 10_7M或更低，1 X 10_8M或更低，或1 X 10_9 Μ或更低，或1 X Κ^Μ或更低，1 X 1(ΓηΜ或更低，1 X 1(Γ12Μ或更低或1 X 1(Γ13Μ或更 低的KD。
[0217] 50.根據(jù)實(shí)施方案31-49任一項(xiàng)的抗體，其重鏈包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID NO: 15的氨基 酸殘基31至35 (SYWMN)的⑶RH1序列，其中所述氨基酸殘基之一可以被不同的氨基酸殘 基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 15的氨基酸50至66 (MIHPSDSETRLNQKFKD)的CDRH2序 列，其中所述氨基酸的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸殘基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 15的氨基酸殘基98至108 (DYSDYDGFAY])的⑶RH3序列，其中所述氨基酸殘基的一 個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸取代。
[0218] 51.根據(jù)實(shí)施方案31-49任一項(xiàng)的抗體，其重鏈包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID N0: 19的氨基 酸殘基31至35 (DYNMY)的⑶RH1序列，其中所述氨基酸殘基之一可以被不同的氨基酸殘 基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 19的氨基酸50至66 (HDPYNGDTSYNQKFKG)的CDRH2序 列，其中所述氨基酸的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸殘基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 19的氨基酸殘基99至109 (⑶YGNPFYLDY)的⑶RH3序列，其中所述氨基酸殘基的一 個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸取代。
[0219] 52.根據(jù)實(shí)施方案31-49任一項(xiàng)的抗體，其重鏈包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID N0: 23的氨基 酸殘基31至35 (DITIH)的⑶RH1序列，其中所述氨基酸殘基之一可以被不同的氨基酸殘 基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 23的氨基酸50至66 (RIDPANDDTKYDPNFQG)的CDRH2序 列，其中所述氨基酸的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸殘基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 23的氨基酸殘基99至108 (SDNSDSWFAY)的⑶RH3序列，其中所述氨基酸殘基的一個(gè)、 兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸取代。
[0220] 53.根據(jù)實(shí)施方案31-49任一項(xiàng)的抗體，其重鏈包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID N0: 27的氨基 酸殘基31至35 (DYNMH)的⑶RH1序列，其中所述氨基酸殘基之一可以被不同的氨基酸殘 基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 27的氨基酸50至66 (YVDPYDGGTSSNQKFKG)的CDRH2序 列，其中所述氨基酸的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸殘基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 27的氨基酸殘基99至106 (EVPYYFDY)的⑶RH3序列，其中所述氨基酸殘基的一個(gè)、兩 個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸取代。
[0221] 54.根據(jù)實(shí)施方案31-49任一項(xiàng)的抗體，其重鏈包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID N0: 31的氨基 酸殘基31至35 (DYYMY)的⑶RH1序列，其中這些氨基酸殘基之一可以被不同的氨基酸殘 基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 31的氨基酸50至66 (AISDDSTYTYYPDSVKG)的CDRH2序 列，其中這些氨基酸的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸殘基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 31的氨基酸殘基99至109 (GGYGNLYAMDY)的⑶RH3序列，其中這些氨基酸殘基的一 個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸取代。
[0222] 55.根據(jù)實(shí)施方案31-49任一項(xiàng)的抗體，其重鏈包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID N0: 35的氨基 酸殘基31至35 (NYVMH)的⑶RH1序列，其中這些氨基酸殘基之一可以被不同的氨基酸殘 基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 35的氨基酸50至66 (WINPFNDGTNYNENFKN)的CDRH2序 列，其中這些氨基酸的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸殘基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 35的氨基酸殘基99至109 (SGFITTLIEDY)的CDRH3序列，其中這些氨基酸殘基的一 個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸取代。
[0223] 56.根據(jù)實(shí)施方案50-55任一項(xiàng)的抗體，其輕鏈包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID N0: 16的氨基 酸殘基24至34 (RASQSISDYLH)的⑶RL1序列，其中所述氨基酸殘基的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可 以被不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 16的氨基酸殘基51至56 (ASQSIS)的 CDRL2序列，其中所述氨基酸的一個(gè)或兩個(gè)可以被不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 16的氨基酸殘基89至97 (QNGHSFPLT)的⑶RL3序列，其中所述氨基酸殘基的一個(gè)或 兩個(gè)可以被不同的氨基酸取代。
[0224] 57.根據(jù)實(shí)施方案50-55任一項(xiàng)的抗體，其輕鏈包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID N0: 20的氨基 酸殘基24至33 (SVSSSVNYMY)的⑶RL1序列，其中所述氨基酸殘基的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可 以被不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 20的氨基酸殘基49至55 (DTSKLPS)的 CDRL2序列，其中所述氨基酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)可以被不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 20的氨基酸殘基88至96 (QQWTSNPPT)的⑶RL3序列，其中所述氨基酸殘基的一個(gè) 或兩個(gè)可以被不同的氨基酸取代。
[0225] 58.根據(jù)實(shí)施方案50-55任一項(xiàng)的抗體，其輕鏈包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID N0: 24的氨基 酸殘基24至33 (SVSSSVNFMN)的⑶RL1序列，其中所述氨基酸殘基的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可 以被不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 24的氨基酸殘基49至55 (DTSKLAP)的 CDRL2序列，其中所述氨基酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)可以被不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 24的氨基酸殘基88至96 (HQWSSYSLT)的⑶RL3序列，其中所述氨基酸殘基的一個(gè) 或兩個(gè)可以被不同的氨基酸取代。
[0226] 59.根據(jù)實(shí)施方案50-55任一項(xiàng)的抗體，其輕鏈包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID N0: 28的氨基 酸殘基24至33 (VASSSVTYMY)的⑶RL1序列，其中所述氨基酸殘基的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可 以被不同的氨基酸殘基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 28的氨基酸殘基49至54 (THPLAS) 的CDRL2序列，其中所述氨基酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)可以被不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng) SEQ ID N0: 28的氨基酸殘基87至95 (PHWNTNPPT)的⑶RL3序列，其中所述氨基酸殘基的 一個(gè)或兩個(gè)可以被不同的氨基酸取代。
[0227] 60.根據(jù)實(shí)施方案50-55任一項(xiàng)的抗體，其輕鏈包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID N0: 32的氨基 酸殘基24至35(TASSSVSSSYLH)的CDRL1序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可 以被不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 32的氨基酸殘基51至57 (STSNLAS)的 CDRL2序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)可以被不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 32的氨基酸殘基90至98 (HQYHRSPFT)的⑶RL3序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè) 或兩個(gè)可以被不同的氨基酸取代。
[0228] 61.根據(jù)實(shí)施方案50-55任一項(xiàng)的抗體，其輕鏈包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID NO: 36的氨基 酸殘基24至34 (KASESVGSFVS)的⑶RL1序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可 以被不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 36的氨基酸殘基50至56 (GASNRYT)的 CDRL2序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)可以被不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID N0: 36的氨基酸殘基89至96 (GQYYTHPT)的⑶RL3序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè) 或兩個(gè)可以被不同的氨基酸取代。
[0229] 62.根據(jù)實(shí)施方案31-61任一項(xiàng)的抗體，其用作藥物。
[0230] 63.根據(jù)實(shí)施方案31-62任一項(xiàng)的抗體，其用于治療炎性疾病。
[0231] 64.抗體，其能夠特異性結(jié)合PGLYRP1并降低PGLYRP1介導(dǎo)的TREM-1活性，所述 抗體用作藥物。
[0232] 65.抗體，其能夠特異性結(jié)合PGLYRP1并降低PGLYRP1介導(dǎo)的TREM-1活性，所述 抗體用于治療炎性疾病。
[0233] 66.根據(jù)實(shí)施方案62-65任一項(xiàng)的用途，其中所述炎性疾病是自身免疫性疾病。
[0234] 67.根據(jù)實(shí)施方案66的用途，其中所述自身免疫性疾病是類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA)。
[0235] 68.根據(jù)實(shí)施方案66的用途，其中所述自身免疫性疾病是炎性腸病（IBD)和/或 潰瘍性結(jié)腸炎。
[0236] 69.根據(jù)實(shí)施方案66的用途，其中所述自身免疫性疾病是銀屑病關(guān)節(jié)炎（PA)。
[0237] 70.實(shí)施方案62或64在心血管疾病、中風(fēng)、缺血再灌注損傷、敗血癥和/或癌癥 治療中的用途。
[0238] 本發(fā)明進(jìn)一步通過(guò)下列實(shí)施例闡明，其不應(yīng)理解為進(jìn)一步的限制。本申請(qǐng)中引用 的所有附圖和所有參考文獻(xiàn)、專利和公開(kāi)的專利申請(qǐng)的內(nèi)容明確地通過(guò)引用并入本文。 實(shí)施例
[0239] 實(shí)施例1 :BWZ. 36人TREM-1 :DAP12穩(wěn)定細(xì)胞系的生成 BWZ. 36/hTREM-l:DAP12:NFAT-LacZ 細(xì)胞系（本文也稱為 "BWZ/hTREM-Ι 報(bào)道基因細(xì) 胞"）衍生自BW5147 T細(xì)胞（小家鼠胸腺淋巴瘤細(xì)胞系，ATCC TIB-47, LGC Standards, Middelsex，UK)并包含由NFAT啟動(dòng)子元件的四個(gè)拷貝調(diào)控的LacZ報(bào)道基因 構(gòu)建體（參見(jiàn) Karttunen, J. & Shastri，N. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88， 3972-3976 和Fiering，S·，Northrop, J. P·，Nolan, G. P·，Matilla，P·，Crabtree, G. R. & Herzenberg, L. A. (1990) Genes Dev. 4，1823-1834)。將使用 TREM-1 cDNA (Gene Bank 參考 ID: NM_018643. 2，Sino Biological Inc.，Beijing, China))作為模 板和寡聚物 TAGTAGGGATCCGCTGGTGCACAGGAAGG (SECHO MO: 51》_ 5' TM3TAGGCGGCCGCTTCGTGGGCCTAGGGTAC(SEQ ID NO: 52)作為引物，克隆 入pIREShyg載體GenBank登錄號(hào)U89672 (目錄號(hào) 6061-1，Clontech Laboratories, CA, USA)的 TREM/DAP12/pMX-IRES 載體(從 Smal 位點(diǎn)至 BamHI 位點(diǎn)編碼 786 bp 的 TREM-1 )，轉(zhuǎn) 染入PLAT-E包裝細(xì)胞系（由華盛頓大學(xué)的W. Yokoyama提供；或者目錄號(hào)RV-101，Cell Biolabs Inc, Bio-Mediator KY, Vantaa, Finland)，其使用 Superfect 轉(zhuǎn)染試劑（目錄號(hào) 301305，Qiagen Nordic, Denmark)。包含 TREM/DAP12/pMX-IRES 病毒顆粒的 PLAT-E 上清 液用于如下感染BWZ. 36細(xì)胞：2xl05個(gè)BWZ. 36細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)，并且培養(yǎng)基用1. 5ml 包含病毒顆粒+ 8 mg/ml聚凝胺的上清液替換。6-8小時(shí)后，將1.5 ml正常培養(yǎng)基添加到 板中并且將細(xì)胞孵育額外24小時(shí)。穩(wěn)定表達(dá)TREM-1的BWZ. 36細(xì)胞系用抗TREM-1單克隆 抗體（克隆 21C7; Bouchon 等，2000，J. Immunol vol. 164 第 4991-4995 頁(yè))染色，并通 過(guò)細(xì)胞分選分離。
[0240] 實(shí)施例2 :用于鑒定表達(dá)TREM-1的配體的細(xì)胞的生物測(cè)定的建立 如實(shí)施例1所述，通過(guò)用hTREM-Ι和DAP12轉(zhuǎn)染NFAT-lacZ攜帶細(xì)胞系BWZ. 36 (Sanderson S, Int. Immun. 1994)生成 TREM-1 報(bào)道基因細(xì)胞系。此 BWZ. 36/ hTREM-1: DAP12: NFAT-LacZ細(xì)胞系(本文也稱為BWZ/hTREM-Ι報(bào)道基因細(xì)胞）對(duì)TREM-1 的抗體介導(dǎo)的交聯(lián)是高度敏感的，當(dāng)用1-10 μ g/ml板結(jié)合的可商購(gòu)的抗TREM-1抗體刺 激時(shí)，相比同種型對(duì)照，給出NFAT-驅(qū)動(dòng)的LacZ產(chǎn)生的約40倍的誘導(dǎo)。在報(bào)道基因細(xì)胞 中NFAT-驅(qū)動(dòng)的LacZ產(chǎn)生可以使用基于發(fā)光的試劑盒Beta Glow? (Promega E4720， Madison，WI)進(jìn)行測(cè)定。板用同種型對(duì)照或aTREM-1 MAB1278 (在PBS中濃度3 ug/ml，100 ul/孔）（R&D Systems, Minneapolis, USA)在 4°C包被 16 小時(shí)或在 37°C，5 % C02 包被 2 小時(shí)，并且通過(guò)添加 l〇ml維爾烯（VerseneK目錄號(hào)#15040，Gibco, Carlsbad CA, USA) 使BWZ/hTREM-1報(bào)道基因細(xì)胞脫離，以400g離心5分鐘，并在PBS和培養(yǎng)基（RPMI-1640 w/o 酚紅；目錄號(hào)11835，Gibco，Carlsbad CA，USA)中清洗，然后添加到包被的板中（1 x 106 細(xì)胞/ml，4xl04細(xì)胞/孔）到總體積100 ul并在37°C，5 % 0)2孵育過(guò)夜（16-20小時(shí))。
[0241] 這些TREM-1反應(yīng)性細(xì)胞用于鑒定表達(dá)TREM-1配體的細(xì)胞。一種這樣的細(xì)胞被證 明是來(lái)自全血的嗜中性粒細(xì)胞。通過(guò)Ficoll和葡聚糖沉降純化健康供體的嗜中性粒細(xì)胞， 并用 PGN(InVivogen, tlrl-pgnsa, SanDiego, CA, USA)刺激過(guò)夜。簡(jiǎn)而言之，以 1:3 的 報(bào)道基因細(xì)胞：嗜中性粒細(xì)胞的比例將BWZ/hTREM-Ι報(bào)道基因細(xì)胞添加到活化的嗜中性粒 細(xì)胞培養(yǎng)物中。在聚-D-賴氨酸包被的Black細(xì)胞培養(yǎng)板（# 356640,來(lái)自BD Biosciences， San Jose, CA，USA)中運(yùn)行此測(cè)定。TREM-1活化在培養(yǎng)24小時(shí)后使用BetaGlo試劑 (E4720,來(lái)自 Promega, Madison, WI, USA)讀出并且使用來(lái)自 Perkin Elmer 的 TopCount 發(fā)光計(jì)數(shù)器測(cè)量發(fā)光。
[0242] 體外刺激的嗜中性粒細(xì)胞具有能夠誘導(dǎo)TREM-1信號(hào)傳導(dǎo)的配體，并且來(lái)自健康 供體的全血的嗜中性粒細(xì)胞通過(guò)葡聚糖沉降純化，并用多種試劑刺激過(guò)夜。能刺激來(lái)自嗜 中性粒細(xì)胞的TREM-1應(yīng)答信號(hào)的唯一試劑是PGN_SA(Invivogen, tlrl-pgnsa, SanDiego, CA，USA),其模擬細(xì)胞的細(xì)菌活化。這些活化的嗜中性粒細(xì)胞然后通過(guò)共培養(yǎng)細(xì)胞用來(lái)刺 激BWZ/hTREM-Ι報(bào)道基因細(xì)胞系。簡(jiǎn)而言之，以1 :3的報(bào)道基因細(xì)胞：嗜中性粒細(xì)胞的比 例將BWZ/hTREM-Ι報(bào)道基因細(xì)胞添加到活化的嗜中性粒細(xì)胞培養(yǎng)物中。在聚-D-賴氨酸包 被的黑細(xì)胞培養(yǎng)板（目錄號(hào)356640 BD Biosciences，San Jose, CA，USA)中運(yùn)行此測(cè)定。 TREM-1活化在培養(yǎng)24小時(shí)后使用BetaGlo試劑（目錄號(hào)E4720, Promega, Madison, WI, USA)讀出并且使用（來(lái)自Perkin Elmer, Waltham MA, USA)的TopCount發(fā)光計(jì)數(shù)器測(cè)量 發(fā)光。如圖1所示，在與PGN刺激的嗜中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)的BWZ/hTREM-Ι細(xì)胞中觀察到報(bào) 道基因活性的顯著誘導(dǎo)。此誘導(dǎo)高度依賴嗜中性粒細(xì)胞活化。對(duì)于靜息嗜中性粒細(xì)胞沒(méi)有 看到應(yīng)答(柱2嗜中性粒細(xì)胞)。類(lèi)似地，當(dāng)在不存在嗜中性粒細(xì)胞的情況下用TLRL混合物 中PGN-SA刺激BWZ/hTREM-Ι報(bào)道基因細(xì)胞時(shí)(柱1-TLRL)沒(méi)有看到應(yīng)答，證明應(yīng)答不僅僅 是PGN對(duì)BWZ/hTREM-Ι細(xì)胞的直接作用。用細(xì)胞因子混合物活化嗜中性粒細(xì)胞(柱3+4嗜 中性粒細(xì)胞+細(xì)胞因子）也不提供正確的TREM-1活化信號(hào)。
[0243] 實(shí)施例3 :可溶性TREM-1對(duì)PGN活化的嗜中性粒細(xì)胞的結(jié)合 PGN-刺激的嗜中性粒細(xì)胞能夠誘導(dǎo)TREM-1活化，表明在PGN刺激的嗜中性粒細(xì)胞培 養(yǎng)物中存在TREM-1刺激因子。為了證實(shí)嗜中性粒細(xì)胞上TREM-1相互作用蛋白的存在，將 PGN-刺激的嗜中性粒細(xì)胞用重組TREM-1四聚體蛋白染色并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析。簡(jiǎn)而言 之，從獲自Astarte Biologies (Redmond, WA, USA)的人全血中經(jīng)由Ficoll-葡聚糖沉 降法分離粒細(xì)胞。在50ml管中用3份Ficoll和4份血液的比例，使血液在FicollPaque (17-0840-03，GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)梯度上分層，然后在 400xg在 22? 不間斷（without brake)離心30分鐘。中間的PBMC帶輕輕吸去。吸取濃縮的RBC上分層 的粒細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到50ml聚丙烯管。粒細(xì)胞和污染的RBC用lxPBS稀釋到40ml并隨后添加 10ml PBS溶液中的4% DEXTRAN 500 (Sigma, 31392，St Louis, M0, USA)。通過(guò)輕輕顛倒 混合后，管在22°C放置20-30分鐘。然后將富含粒細(xì)胞的上清液轉(zhuǎn)移到新管并在250xg在 22°C離心5分鐘；吸取上清液并丟棄。用滲透壓裂解去除污染的RBC，簡(jiǎn)而言之，將細(xì)胞沉 淀重懸在7. 5ml的0. 2% NaCl中；輕輕混合55-60秒，并且添加17. 5ml的1. 2% NaCl溶液。 然后用PBS使體積達(dá)到50ml，并在250xg離心5分鐘，將沉淀重懸在7. 5ml的0. 2% NaCl中 以第二次重復(fù)裂解。最終的粒細(xì)胞沉淀重懸在RPMI/10% FBS中。
[0244] 分離的粒細(xì)胞以 3. 8 E6/ml 的密度在 RPMI/10%FBS + 10 μ g/ml PGN-SA (Invivogentlrl-pgnsa, San Diego, CA, USA)中培養(yǎng)7天。通過(guò)離心沉淀細(xì)胞并重懸 在PBS/2%FBS用于染色。然后在存在或不存在2 μ g/ml探針，具有或不具有100 μ g/ml (50X)的特異性的或不相關(guān)的競(jìng)爭(zhēng)蛋白的情況下，以100, 000/孔的密度將重懸的粒細(xì)胞鋪 板在96孔板（圓底）中。在50 μ 1/孔體積中將細(xì)胞在4°C與探針/競(jìng)爭(zhēng)蛋白孵育1小時(shí)。 在孵育結(jié)束時(shí)，添加150 μ 1/孔PBS/2%FBS并沉淀細(xì)胞。沉淀的細(xì)胞重懸在50 μ 1/孔的 山羊抗 hFc F(ab，）2/ΡΕ 綴合物（Jackson ImmunoResearch 109-116-098, West Grove, PA，USA)中并在4°C孵育30分鐘。添加150 μ?/孔PBS/2%FBS并沉淀細(xì)胞。沉淀的細(xì)胞 進(jìn)一步在200 μ 1/孔PBS/2%FBS中洗滌并沉淀。然后將洗滌的細(xì)胞重懸在100 μ 1/孔固 定劑（1:1 PBS: Cytofix. 554655，BD Biosciences, San Jose, CA, USA)中并在室溫孵 育5分鐘。向固定的細(xì)胞添加100 μ 1/孔PBS/2%FBS，并然后沉淀細(xì)胞。染色/固定的細(xì) 胞然后重懸在100 μ 1/孔PBS/2%FBS用于在LSR II流式細(xì)胞儀上進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)〇 ----/--: Fcmui 5.36 mgimi SEQ ID NO: 3 hTREM-1 tet/Fc mu! 1,〇?mg/m) SEQ ID NO: 2 hmElf-i tet Ft mtuM-i SOX DCIR COMP 0.3 mg/mt SEQ IO NO: 4 50X TRIM COMP 1,14 mg/mf SEQ ID NO: 5
[0245] 從流式細(xì)胞數(shù)據(jù)創(chuàng)建直方圖。來(lái)自山羊抗hFc/ΡΕ綴合物的背景熒光在每個(gè)直方 圖中顯示為背景并指定為"PE"。在每個(gè)直方圖上繪制相同的標(biāo)志物以指定結(jié)合第二山羊抗 hFc/ΡΕ綴合抗體的細(xì)胞的百分比。陰性對(duì)照Fcmut蛋白顯示2%陽(yáng)性結(jié)合細(xì)胞，其與單獨(dú)用 山羊抗hFc/PE綴合物看到的背景熒光相同（圖2A)。當(dāng)細(xì)胞用2 μ g/ml hTREM-1/四聚體 染色時(shí)，它們?yōu)?9%陽(yáng)性（圖2B)。當(dāng)在100 μ g/ml DCIR COMP蛋白的背景下完成TREM-1 四聚體結(jié)合時(shí)，細(xì)胞為41%陽(yáng)性，證實(shí)DCIR COMP不競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TREM-1四聚體（圖2C)。當(dāng)在 100 μ g/ml TREM-1 COMP蛋白存在的情況下完成TREM-1四聚體結(jié)合時(shí)，細(xì)胞為10%陽(yáng)性， 顯示TREM-1 COMP蛋白的確與TREM-1四聚體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合細(xì)胞（圖2D)。
[0246] 實(shí)施例4 :作為嗜中性粒細(xì)胞表達(dá)的TREM-1配體的PGLYRP1的鑒定 通過(guò)使用免疫沉淀偶聯(lián)質(zhì)譜（IP-MS)將PGLYRP1鑒定為T(mén)REM-1配體。可溶性TREM-1 四聚體用作親和"誘餌"分子以鑒定配體。簡(jiǎn)而言之，TREM-1-四聚體-Fc (SEQ ID N0:2) 和分開(kāi)的⑶83-Fc (SEQ ID NO:5)各自以100 μ g/ml的終濃度與270百萬(wàn)個(gè)通過(guò)如上述 的葡聚糖沉降純化的人嗜中性粒細(xì)胞在1 mL PBS中在4°C一起孵育90分鐘并溫和搖動(dòng)。 沉淀后，細(xì)胞重懸在lmL PBS緩沖液中，其包含交聯(lián)劑3, 3'-二硫代雙[磺酸琥珀酰亞氨 丙酸酯](DTSSP) (Thermo Scientific :21578, Rockford，IL，USA)，以 2 mM 的濃度并在室 溫孵育30分鐘。細(xì)胞用lmL PBS洗滌3X，隨后在1 mL RIPA緩沖液（Thermo Scientific, 89901，Rockford, IL，USA)中裂解。裂解物以15, 000 Xg在4°C離心10分鐘以去除不溶 的材料。使用蛋白 A Mag Sepharose? 珠 （GE Healthcare Life Sciences, 28-9670-56， Piscataway，NJ，USA)從上清液中將交聯(lián)到偶聯(lián)探針的Fc的嗜中性粒細(xì)胞蛋白免疫沉 淀。簡(jiǎn)而言之，50 yL珠首先用200 yLPBS洗滌，然后重懸在lmL細(xì)胞裂解物中，在4°C 孵育60分鐘，磁力捕獲并隨后用200 μ L RIPA緩沖液洗滌2次，然后用200 μ L PBS洗滌 3次。從最終的磁力捕獲物去除PBS后，使用200 yL包含8M尿素、100 mM Tris (ρΗ8·0) 和 15mM TCEP (Thermo Scientific, 77720，Rockford, IL, USA)的緩沖液從磁性珠上洗 脫蛋白，并在室溫孵育30分鐘，捕獲珠并將上清液轉(zhuǎn)移到Microcon Ultracel YM-30濾 器（Millipore, 42410，Billerica, MA, USA)。樣品在 14，000 x g, 2(TC 離心 30-60 分鐘，直至濾膜頂部上沒(méi)有液體保留。然后用100 μ L 8M尿素中的50mM IAA (碘乙酰胺） 在室溫下黑暗中將保留的蛋白烷基化30分鐘。濾器用100 yL 50mM NH4HC03洗滌2次并 然后轉(zhuǎn)移到新的收集管中。添加在60 yL 50 mM NH4HC03中的1 yg胰蛋白酶（目錄號(hào) ￥5111，？1'〇1^83，]\&1(^8〇1111，舊4)然后在371：孵育過(guò)夜。通過(guò)在 14,000 18離心30 分鐘收集胰蛋白酶消化物，隨后用50 yL 50 mM順4!10)3洗滌濾器。通過(guò)LC/MS/MS使用 LTQ-〇rbitrap-XL 質(zhì)譜儀（Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)分析 10 μ L 消化物。 針對(duì) ΙΡΙ 人數(shù)據(jù)庫(kù)（ν3· 81)使用 SEQUEST-Sorcerer 引擎（4· 0· 4 樣式（build)) (SageN, Milpitas, CA, USA)搜索數(shù)據(jù)，并且然后用 Scaffold 3 (Proteome Software, Portland, OR, USA)后處理以用1%的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率過(guò)濾蛋白ID。陰性對(duì)照扣除后，發(fā)現(xiàn)PGLYRP1是與 hTREM-Ι四聚體特異性結(jié)合的高可信度蛋白。在嗜中性粒細(xì)胞中的免疫沉淀顯示在148個(gè) 鑒定的蛋白中，72個(gè)蛋白通過(guò)對(duì)照構(gòu)建體（CD83 )單獨(dú)免疫沉淀，73個(gè)蛋白對(duì)于TREM-1和 CD83是相同的，而只有三個(gè)是TREM-1特異性的（圖3)。該實(shí)驗(yàn)后來(lái)使用來(lái)自不同的供體的 嗜中性粒細(xì)胞進(jìn)行了重復(fù)并且PGLYRP1再次被鑒定為特異性與hTREM-Ι相互作用。
[0247] 實(shí)施例5 :從HEK293 6E表達(dá)的人PGLYRP1的純化 通過(guò)將人CD33信號(hào)肽序列（SEQ ID N0: 53)與人成熟PGLYRP1編碼序列（SEQ ID NO: 1)融合構(gòu)建重組蛋白序列。所獲得的開(kāi)放閱讀框克隆入pcDNA3. l/Zeo(+)載體 (Life Technologies, Carlsbad CA, USA) CMV 啟動(dòng)子后。然后用 293fectinTM (Life Technologies, Carlsbad CA, USA)按照供貨商的方案將所述 pcDNA3.1_hPGLYRPl 構(gòu)建 體轉(zhuǎn)染入HEK293 6E細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后5天，包含分泌的人PGLYRP1的培養(yǎng)上清液通過(guò)離心 (15,000 rpmX 20 min, 4 C)收獲，并且然后通過(guò)用0.22 μπι硝酸纖維素膜過(guò)濾澄清。然 后將澄清的上清液首先稀釋10倍到20mM檸檬酸鈉 ρΗ5. 0中，并且然后應(yīng)用到Hitrap SP HP 5 ml 柱（17-1151-01 GE Healthcare, Uppsala, Sweden)，然后用 5 倍柱體積的 20 mM 檸檬酸鈉 PH5.0洗滌。然后用20 mM檸檬酸鈉 pH 5.0、1 M NaCl的0-100%線性梯度以 30倍柱體積洗脫結(jié)合的人PGLYRP1。分開(kāi)合并包含人PGLYRP1的二聚體和單體形式的級(jí)分 并通過(guò)Amicon ultra 15 離心單兀（UFC800324 3,000 kDa MWCO, Millipore, Hellerup， Denmark)濃縮到少于4ml。二聚體和單體合并物進(jìn)一步精加工并且通過(guò)Hiload 26/60 Superdex 75 318ml 柱（17-1070-01 GE Healthcare, Uppsala, Sweden)緩沖液交換到憐 酸鹽緩沖鹽水（PBS)。離心后，通過(guò)用NANODROP UV分光光度計(jì)測(cè)量280nm吸光度來(lái)確定最 終蛋白濃度。通過(guò)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)評(píng)價(jià)蛋白純度。
[0248] 實(shí)施例6 :大腸桿菌表達(dá)的人PGLYRP1的重折疊和純化 人PGLYRP1作為包含體在大腸桿菌BL21 (DE3)細(xì)胞中表達(dá)。通過(guò)離心收獲細(xì)菌，重 懸在 50mM Tris-HCl pH8.0,500 mM NaCl，5 mM EDTA，0.5% Triton X-100 中并通過(guò)離心 破碎。不溶沉淀用50 mM Tris，pH 8. 0，1% TritonX-100,2 M尿素洗滌三次并用50mM Tris pH8. 0洗滌一次，然后溶解在50 mM Tris-HC1，6M鹽酸胍，pH7. 4，1 mM DTT中（終蛋 白濃度20mg/ml)。對(duì)于體外折疊，溶解的人PGLYRP1包涵體稀釋在50 mM Tris，pH 8.0， 2mM EDTA，5 mM半胱胺，0.5 mM胱胺，0.4 Μ精氨酸中（終蛋白濃度lmg/ml)。在4°C過(guò)夜 后，通過(guò)離心/過(guò)濾使折疊混合物澄清，并且然后稀釋12倍到10mM MES pH3.5中以降低 電導(dǎo)率和pH (最終pH約5. 8,電導(dǎo)率約6mS/cm)。然后將稀釋的折疊混合物應(yīng)用到Hitrap SP HP 5ml 柱（17-1151-01 GE Healthcare, Uppsala, Sweden)，然后用 5 倍柱體積的 50 mM MES pH5. 8洗滌。然后用50 mM MES pH 5. 8，1 M NaCl的0-60%線性梯度以20倍柱 體積洗脫結(jié)合的人PGLYRP1。合并包含重折疊的人PGLYRP1的級(jí)分并通過(guò)Amicon ultra 15 離心單兀（UFC800324 3,000 kDa MWCO, Millipore, Hellerup, Denmark)濃縮到少 于 4ml。然后使用 Hiload 26/60 Superdex 75 318ml 柱（（17-1070-01 GE Healthcare, Uppsala, Sweden)精加工并將蛋白緩沖液交換到磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)中。大部分重折疊 的人PGLYRP1蛋白以單體形式。離心后，通過(guò)用NAN0DR0P UV分光光度計(jì)測(cè)量280nm吸光 度來(lái)確定最終蛋白濃度。通過(guò)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)評(píng)價(jià)蛋白 純度。
[0249] 實(shí)施例7 :小鼠免疫和mAb的鑒定 使用純化的人PGLYRP1免疫小鼠以產(chǎn)生抗體。簡(jiǎn)而言之，小鼠免疫3次，每次免疫用20 μ g重組PGLYRP1。第一次免疫使用完全福氏佐劑（目錄號(hào)3018，Statens Serum Institut, Copenhagen, Denmark)皮下進(jìn)行。隨后的兩次免疫使用不完全福氏佐劑（目錄號(hào)3016， Statens Serum Institut, Copenhagen, Denmark)腹膜內(nèi)進(jìn)行。最后一次免疫后 10 天，臉 頰抽血并在直接ELISA中針對(duì)PGLYRP1測(cè)試血清。
[0250] 實(shí)施例8 :可溶性TREM-1與PGLYRP1的結(jié)合 驗(yàn)證新的蛋白-蛋白相互作用的一個(gè)常規(guī)方法是通過(guò)使用重組試劑重建相互作用。 為此，表達(dá)具有信號(hào)傳導(dǎo)糖基磷脂酰肌醇（GPI)結(jié)構(gòu)的翻譯后添加的C末端表位的重組人 PGLYRP1。包含末端GPI結(jié)構(gòu)的蛋白靶向在質(zhì)膜上展示。此通常應(yīng)用的技術(shù)允許其它可溶 性蛋白被展示并通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)試結(jié)合。在圖4a中，HEK-2936E細(xì)胞用p⑶NA 3. 1/ zeo(+) hPGLYRPl-GPI (SEQ IDNO: 7)轉(zhuǎn)染，3 ygDNA 稀釋入 100 μ? 的Optimem (目 錄號(hào) 31985062，Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)。將4μ1 的 293fectin (目錄 號(hào) 51-0031, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)添加到 100 μ 1 的Optimem (目錄 號(hào) 31985062, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)并在 22°C孵育 5 分鐘。合并 DNA/ Optimem混合物和293fectin/0ptimem混合物并在室溫下孵育額外20分鐘。HEK-2936E細(xì) 胞在 Freestyle 培養(yǎng)基（目錄號(hào) 12338, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)中以 le6/ml 稀釋到 3 ml 并鋪板在 6 孔皿中（目錄號(hào) 35-3046, Biosciences San Jose, CA, USA)并且然后將DNA/293fectin混合物逐滴添加到細(xì)胞。細(xì)胞在37°C搖動(dòng)孵育48小時(shí)。 1 μ g/ml 的人 TREM-l-G4Sx3-TREM-l/Fc6mut (SEQ ID NO: 2)稀釋到 PBS/2%FBS 中并且將 50μ1探針添加到圓底96孔板（目錄號(hào)3799, Costar, Lowell, MA, USA)中的80, 000個(gè) 轉(zhuǎn)染的HEK293-6E細(xì)胞中。細(xì)胞在4°C孵育1小時(shí)，隨后用200 μ 1 PBS/2%FBS洗滌2次。 添加50 μ? 1 yg/ml PE 山羊抗人 Fc (目錄號(hào) 109-116-098，Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA，USA)，并孵育額外1小時(shí)隨后用PBS/2%FBS洗滌2次。細(xì)胞在1:1 PBS 稀釋的BDCytofix (目錄號(hào) 554655，BDBiosciences, San Jose, CA, USA)中固定5分鐘， 并且孵育5分鐘隨后用200 μ 1 PBS/2%FBS洗滌。細(xì)胞重懸在100 μ 1 PBS/2%FBS中然后在 FACS LSRII (BD Biosciences, San Jose, CA)上分析。此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在圖4a中，其 中未染色的細(xì)胞通過(guò)黑實(shí)線顯示（G03)。模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞的TREM-l-G4Sx3-TREM-l/Fc6mut染 色顯示為虛線，并且顯示相對(duì)未染色的細(xì)胞無(wú)結(jié)合。最終，用人PGLYRP1-GPI轉(zhuǎn)染的細(xì)胞強(qiáng) 力結(jié)合TREM-l-G4S X3-TREM-l/Fc6mut，其用點(diǎn)線顯示。結(jié)合的定量表示為平均熒光強(qiáng)度， MFI。
[0251] 除了流式細(xì)胞術(shù)，通常還通過(guò)測(cè)量表面等離子共振（SPR)評(píng)價(jià)蛋白-蛋白相互作 用。使用 BiacoreT200 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)設(shè)備分析人 TREM-1 和人 PGLYRP1之間并且還有人PGLYRP1和超聲的可溶性大腸桿菌肽聚糖（目錄號(hào)tlrl-ksspgn, Invivogen, SanDiego, CA, USA)之間的相互作用。所有測(cè)定以20-30 yL/分鐘的流速 在 IX HBS-P 運(yùn)行緩沖液（目錄號(hào) BR-1006-71, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) 中在25°C進(jìn)行。
[0252] 在圖4B中，按照制造商推薦的方法將4641. 1 RU的人TREM-1四聚體（SEQ ID NO: 2)胺偶聯(lián)到 Biacore CM5 芯片（目錄號(hào) BR-1005-30, BR-1000-50, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)。在存在或不存在10 yg/mL可溶性大腸桿菌肽聚糖（目錄號(hào) tlrl-ksspgn, Invivogen, San Diego, CA, USA)的情況下，將PGLYRP1 (目錄號(hào) 2590-PG, R&D Systems, Minneapolis, USA)在 IX HBS-P 運(yùn)行緩沖液（目錄號(hào) BR-1006-71, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)中稀釋到150 nM,并注射經(jīng)過(guò)TREM-1表面。數(shù)據(jù)相 對(duì)活化的和封閉的(用乙醇胺）參考表面進(jìn)行參考扣除。盡管在存在和不存在PGN的情況 下，PGLYRP1均結(jié)合TREM-1，但當(dāng)PGLYRP1被PGN交聯(lián)時(shí)，似乎存在顯著的親合力效應(yīng)。
[0253] 在圖 4C 中，將 274. 8 RU 的 PGLYRP1 二聚體（SEQ ID NO: 1)胺偶聯(lián)到 Biacore CM5 芯片（目錄號(hào) BR-1005-30, BR-1000-50, GE Healthcare, Piscataway, NJ)。可溶性 大腸桿菌肽聚糖（目錄號(hào) tlrl-ksspgn, Invivogen, San Diego, CA, USA)在 IX HBS-P 運(yùn)行緩沖液中（目錄號(hào) BR-1006-71, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)稀釋到 10 μ g/mL，并注射經(jīng)過(guò)PGLYRP1表面。數(shù)據(jù)相對(duì)活化的和封閉的(用乙醇胺）參考表面進(jìn)行參 考扣除。
[0254] 在圖4D中，使用與圖4C相同的芯片（274. 8 RU的PGLYRP1二聚體，（SEQ ID NO: 1)。將 TREM-1 二聚體（SEQ ID NO: 8)在 IX HBS-P 運(yùn)行緩沖液中（BR-1006-71, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)稀釋到150nM,并且在重復(fù)注射肽聚糖（圖4B中描述） 之前和之后注射。數(shù)據(jù)相對(duì)活化的和封閉的(用乙醇胺）參考表面進(jìn)行參考扣除，并且也扣 除緩沖液空白注射的信號(hào)。TREM-1顯示清楚地結(jié)合固定化的PGLYRP1。可溶性TREM-1二 聚體類(lèi)似地結(jié)合單獨(dú)的固定化的PGLYRP1或結(jié)合已加載PGN的PGLYRP1。表面固定化的 TREM-1受體被可溶性PGLYRP1和PGN的總體結(jié)合由對(duì)被來(lái)自高度交聯(lián)的PGLYRP1的親和力 效應(yīng)增強(qiáng)的PGLYRP1:TREM-1復(fù)合物的適度親和力組成。
[0255] 實(shí)施例9 :TREM-1_應(yīng)答被重組PGLYRP1的活化 為了測(cè)試是否重組PGLYRP1可以活化TREM-1應(yīng)答，將BWZ/ hTREM-Ι報(bào)道基因細(xì)胞系 接種到黑96孔板并在存在或不存在的l(^g/mlPGN的情況下用重組人PGLYRP1 (目錄號(hào) 2590-PG-050, R&D Systems: Minneapolis, MN)刺激。TREM-1 活化在培養(yǎng) 24 小時(shí)后使 用 BetaGlo 試劑（目錄號(hào) E4720，Promega, Madison, WI, USA)讀出并且使用來(lái)自 Perkin Elmer的TopCount發(fā)光計(jì)數(shù)器測(cè)量發(fā)光。如圖5a所示，TREM-1報(bào)道基因細(xì)胞系用PGLYRP1 刺激在存在PGN的情況下誘導(dǎo)劑量依賴性的TREM-1的活化。測(cè)試了幾種不同的PGN，包括 PGN-EC (來(lái)自大腸桿菌）、PGN_SA (來(lái)自金黃色葡萄球菌(51· atfreiAs))和PGN-BS (來(lái)自枯 草芽抱桿菌(漢 San Diego, CA, USA)，并且均能夠促進(jìn)PGLYRP1 誘導(dǎo)的TREM-1應(yīng)答。
[0256] 重組PGLYRP1誘導(dǎo)的應(yīng)答可以通過(guò)添加重組TREM-1-Fc-融合蛋白（SEQ ID N0: 2)抑制（圖5b)，或通過(guò)添加多克隆抗PGLYRP1抗體（目錄號(hào)AF-2590，R&DSystems: Minneapolis, MN, USA)抑制，證實(shí)PGLYRP1是TREM-1配體并且可溶性TREM-1和抗 PGLYRP1潛在地可用作TREM-1拮抗劑。
[0257] 實(shí)施例10 :來(lái)自PGLYRP1刺激的Ml巨噬細(xì)胞的TNF- α釋放 單核細(xì)胞分化成Ml巨噬細(xì)胞并用PGLYRP1復(fù)合物刺激，導(dǎo)致在兩個(gè)不同的供體中的 TNF-α釋放。
[0258] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到建立冷凍庫(kù)收集來(lái)自多個(gè)供體的原代細(xì)胞從而提供方 便的實(shí)驗(yàn)重復(fù)的價(jià)值。如下從外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生體外衍生的巨噬細(xì)胞。使用Rosette Sep 試劑盒（目錄號(hào) 15068 Stem Cell Technologies, Vancouver BC, Canada)按照制造商的 指導(dǎo)從獲自 Research Blood Components (Brighton, MA, USA)的外周血 "leukopak" 分 離負(fù)富集的單核細(xì)胞。分離的單核細(xì)胞懸浮在50e6細(xì)胞/ml的10% DMS0/FBS等分試樣中 并逐漸冷卻到_80°C。為了產(chǎn)生巨噬細(xì)胞，在37°C水浴中快速融化一瓶或多瓶?jī)龃嫘∑康?單核細(xì)胞，用具有 10% FBS(目錄號(hào) 03-600-511，Themo Fisher, Waltham MA, USA)的生 長(zhǎng)培養(yǎng)基 RPMI 1640 (目錄號(hào) 72400-047, Life Technologies, Carlsbad CA, USA)稀 釋到10ml并在250g離心5分鐘。細(xì)胞在補(bǔ)充50 ng/ml人MCSF (目錄號(hào)PHC9501, Life Technologies, Carlsbad CA, USA)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中懸浮至2e6個(gè)細(xì)胞/ml,置入組織培養(yǎng) 物處理的佩特里式（petri style)組織培養(yǎng)板并放入加濕的培養(yǎng)箱，設(shè)置維持5% C02,2%02 的"低氧"氣氛。在培養(yǎng)的第三天，將細(xì)胞飼喂添加等體積的補(bǔ)充有50 ng/ml人MCSF生長(zhǎng) 培養(yǎng)基。培養(yǎng)6天后，所述單核細(xì)胞已分化成M0巨噬細(xì)胞。通過(guò)將培養(yǎng)基換成補(bǔ)充有50 ng/ml 人 IFNg (目錄號(hào)，PHC4031, Life Technologies, Carlsbad CA, USA)(對(duì)于 Ml 巨噬細(xì)胞）或 40 ng/ml 人 IL-4 (目錄號(hào) PHC0045, Life Technologies, Carlsbad CA, USA)(對(duì)于M2巨噬細(xì)胞)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基并放回培養(yǎng)箱額外22小時(shí)，使MO細(xì)胞進(jìn)一步分化。 在第7天，巨噬細(xì)胞合適地分化用于生物測(cè)定中。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)用lx PBS隨后是PBS中 的5mM EDTA洗滌，將巨噬細(xì)胞從培養(yǎng)板回收。然后將板放回37°C 30分鐘，并且將細(xì)胞使用 l〇ml注射器和22G針頭從板上"強(qiáng)力洗下（power washed)"。然后將細(xì)胞稀釋到生長(zhǎng)培養(yǎng) 基中，在250g離心5分鐘，之后將細(xì)胞沉淀懸浮到le6/ml的終濃度。
[0259] 如上制備的巨噬細(xì)胞用在生物測(cè)定中，其中通過(guò)ELISA在條件培養(yǎng)基中測(cè)量應(yīng)答 于用TREM-1配體刺激細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子例如TNF-α。進(jìn)一步利用這樣的生物測(cè)定來(lái)測(cè) 量通過(guò)TREM-1特異性抗體的TREM-1配體刺激的阻斷。在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中以4X濃度制備TREM 配體或陰性對(duì)照，并且將50微升/孔添加到96孔微量滴定板中。TREM-1配體的終濃度由 7.5ng/ml重組人PGLYRP1(如實(shí)施例5所述生成)和3Pg/ml PGN-BS (目錄號(hào)，tlrl-pgnbs, Invivogen, SanDiego CA, USA)組成。如上述在加濕低氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞22小時(shí)，之后 收集條件培養(yǎng)基并且按照制造商的指導(dǎo)（目錄號(hào)DY210, R&D Systems, Minneapolis MN, USA)通過(guò)ELISA測(cè)量TNF-α水平。
【權(quán)利要求】
1. 抗體或其片段，其能夠特異性結(jié)合PGLYRP1并降低PGLYRP1介導(dǎo)的TREM-1活性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或其片段，其能夠特異性結(jié)合SEQ ID NO: 37 (l_ 1.0PGLYRP1)和 / 或 SEQ IDNO: 38< IlM 1.0PGLYRP1}。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的抗體，其能夠與抗體1F10、抗體1F36 (mAb 0182)、抗 體1F95、抗體1F105 (mAb 0184)、抗體2F5和/或抗體2F7競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合PGLYRP1。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的抗體，其重鏈包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID NO: 15的氨基酸殘 基31至35 (SVWMN}的CDRH1序列，其中所述氨基酸殘基之一可以被不同的氨基酸殘基 取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 15的氨基酸50至66 _HPSDSETRLNQKFKD)的CDRH2序 列，其中所述氨基酸的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸殘基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 15的氨基酸殘基98至108 (DYSDYDGFAY]}的CDRH3序列，其中所述氨基酸殘基的一 個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸取代。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的抗體，其重鏈包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID NO: 19的氨基酸殘基 31至35 (DYNMY)的CDRH1序列，其中所述氨基酸殘基之一可以被不同的氨基酸殘基取代； 和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 19的氨基酸50至66《YIDPYNGDTSYNQKFKG)的CDRH2序列，其 中所述氨基酸的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸殘基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 19的氨基酸殘基99至109 (GDYGNPFYLDY)的CDRH3序列，其中所述氨基酸殘基的一個(gè)、 兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸取代。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的抗體，其重鏈包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID NO: 23的氨基酸殘基 31至35《DTYIH)的⑶RH1序列，其中所述氨基酸殘基之一可以被不同的氨基酸殘基取代； 和 / 或 SEQ ID NO: 23 的氨基酸 50 至 66 (RIDPANDDTKYDPNFQG)的 CDRH2 序列，其中所 述氨基酸的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸殘基取代；和/或SEQ ID NO: 23的氨基 酸殘基99至108 (SDNSDSWFAY)的CDRH3序列,其中所述氨基酸殘基的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè) 可以被不同的氨基酸取代。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的抗體，其重鏈包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID NO: 27的氨基酸殘 基31至35 (DYNMH)的CDRH1序列，其中所述氨基酸殘基之一可以被不同的氨基酸殘基取 代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 27的氨基酸50至66《YVDPYDGGTSSNQKFKG)的CDRH2序 列，其中所述氨基酸的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸殘基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 27的氨基酸殘基99至106 (EVPYYFDY)的⑶RH3序列，其中所述氨基酸殘基的一個(gè)、 兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸取代。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的抗體，其重鏈包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID NO: 31的氨基酸殘基 31至35 (DYYMY)的CDRH1序列，其中這些氨基酸殘基之一可以被不同的氨基酸殘基取代； 和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 31的氨基酸50至66《AfSDDSTYTYYPDSVKG)的CDRH2序列，其 中這些氨基酸的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸殘基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 31的氨基酸殘基99至109 (GGYGNLYAMDY)的CDRH3序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)、 兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸取代。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的抗體，其重鏈包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID NO: 35的氨基酸殘基 31至35 (NYVMH)的CDRH1序列，其中這些氨基酸殘基之一可以被不同的氨基酸殘基取代； 和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 35的氨基酸50至66 (WINPFNDGTNYNENFKN》的CDRH2序列，其 中這些氨基酸的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸殘基取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 35的氨基酸殘基99至109 (SGFITTL1ED+Y丨的⑶RH3序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)、兩 個(gè)或三個(gè)可以被不同的氨基酸取代。
10. 根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一項(xiàng)的抗體，其輕鏈包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID NO: 16的氨基酸 殘基24至34 {RASQSISDYLH)的⑶RL1序列，其中所述氨基酸殘基的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可 以用不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 16的氨基酸殘基51至56 <ASQS丨S丨的 CDRL2序列，其中所述氨基酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)可以用不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 16的氨基酸殘基89至97《QNGHSFPLT)的⑶RL3序列，其中所述氨基酸殘基的一 個(gè)或兩個(gè)可以用不同的氨基酸取代。
11. 根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一項(xiàng)的抗體，其輕鏈包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID NO: 20的氨基酸 殘基24至33 (SVSSSVNYMY)的⑶RL1序列，其中所述氨基酸殘基的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可 以用不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 20的氨基酸殘基49至55 {DTSKLPS)的 CDRL2序列，其中所述氨基酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)可以用不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 20的氨基酸殘基88至96 (QQWTSNPPT)的CDRL3序列，其中所述氨基酸殘基的一 個(gè)或兩個(gè)可以用不同的氨基酸取代。
12. 根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一項(xiàng)的抗體，其輕鏈包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID NO: 24的氨基酸 殘基24至33《SVSSSVNFMN)的CDRL1序列，其中所述氨基酸殘基的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可 以用不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 24的氨基酸殘基49至55 (DTSKLAP)的 CDRL2序列，其中所述氨基酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)可以用不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 24的氨基酸殘基88至96 (HQWSSYSLT)的CDRL3序列，其中所述氨基酸殘基的一 個(gè)或兩個(gè)可以用不同的氨基酸取代。
13. 根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一項(xiàng)的抗體，其進(jìn)一步包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID NO: 28的氨基酸 殘基24至33 (VASSSVTYMY丨的⑶RL1序列，其中所述氨基酸殘基的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可 以用不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 28的氨基酸殘基49至54 {TOPLAS)的 CDRL2序列，其中所述氨基酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)可以用不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 28的氨基酸殘基87至95 (PHWNTNPPT)的CDRL3序列，其中所述氨基酸殘基的一 個(gè)或兩個(gè)可以用不同的氨基酸取代。
14. 根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一項(xiàng)的抗體，其進(jìn)一步包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID NO: 32的氨基酸 殘基24至35 (TASSSVSSSYLH)的⑶RL1序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè) 可以用不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 32的氨基酸殘基51-57 (STSNLAS)的 CDRL2序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)可以用不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 32的氨基酸殘基90-98 (HQYHRSPFT)的⑶RL3序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè) 或兩個(gè)可以用不同的氨基酸取代。
15. 根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一項(xiàng)的抗體，其進(jìn)一步包含：對(duì)應(yīng)SEQ ID NO: 36的氨基酸 殘基24至34 (KASESVGSFVS)的⑶RL1序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可 以用不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 36的氨基酸殘基50至56 (GASNRYT)的 CDRL2序列，其中這些氨基酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)可以用不同的氨基酸取代；和/或?qū)?yīng)SEQ ID NO: 36的氨基酸殘基89至96 iGQYYTHPT)的⑶RL3序列，其中這些氨基酸殘基的一 個(gè)或兩個(gè)可以用不同的氨基酸取代。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的抗體，其用作藥物。
【文檔編號(hào)】A61K39/395GK104203977SQ201280069905
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月15日
【發(fā)明者】V.W.斯坦尼科, C.B.里德, J.奎珀, X.唐, M.海佩, S.A.喬斯 申請(qǐng)人:諾和諾德A/S（股份有限公司）