一種關(guān)節(jié)軟骨移植物及其制備方法
【專利摘要】一種關(guān)節(jié)軟骨移植物及其制備方法，本發(fā)明制備的關(guān)節(jié)軟骨移植物從外至內(nèi)由淺層、中層和深層三層構(gòu)成，每層的厚度、形狀、大小均與軟骨損傷部位相匹配，無需術(shù)前塑形，植入后與周圍正常軟骨各層分布相對(duì)應(yīng)，有利于細(xì)胞間的信號(hào)傳遞、轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控，能夠與周圍正常軟骨組織更好的整合；具有和天然軟骨一致的結(jié)構(gòu)特征，從淺層到深層Ⅱ型膠原含量逐漸降低，GAG含量逐漸升高，抗壓性和耐磨性好；軟骨移植物中的軟骨細(xì)胞被細(xì)胞外基質(zhì)包裹，免疫原性低，避免植入后發(fā)生免疫排斥，能夠長(zhǎng)期存活并發(fā)揮功能，提高軟骨修復(fù)長(zhǎng)期療效。
【專利說明】一種關(guān)節(jié)軟骨移植物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于組織工程學(xué)醫(yī)用生物材料【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種關(guān)節(jié)軟骨移植物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]關(guān)節(jié)軟骨是透明軟骨，由軟骨細(xì)胞、軟骨纖維和軟骨基質(zhì)構(gòu)成。軟骨組織具有層狀分布不均一的特點(diǎn)，從上至下分為淺層(10~20%)、中層(40~60%)和深層(20~30%)三層區(qū)域。近年來研究發(fā)現(xiàn)，軟骨每一區(qū)域結(jié)構(gòu)不同、蛋白成分不同，并執(zhí)行不同的功能，從不同區(qū)域獲得的軟骨細(xì)胞基因表達(dá)和生長(zhǎng)率均不相同。淺層、中層和深層軟骨細(xì)胞密度依次降低，其中淺層軟骨細(xì)胞呈水平方向緊密排列，分泌較多的淺層帶蛋白，有助于潤(rùn)滑軟骨表面，降低摩擦系數(shù)，提高軟骨耐磨性；中層軟骨細(xì)胞呈分散狀態(tài)，分泌的膠原纖維相互交織，使中層軟骨具有抗拉伸和剪切力的性能；深層軟骨細(xì)胞成串排列，分泌最多的蛋白聚糖，使關(guān)節(jié)軟骨富有彈性，深層的膠原纖維最粗，自下而上呈放射狀排列，垂直于軟骨表面，因此具有良好的抗壓性能。
[0003]關(guān)節(jié)軟骨再生能力有限，由于創(chuàng)傷、炎癥、腫瘤、退變等原因?qū)е碌能浌菗p傷、缺失極為常見，且常繼發(fā)骨關(guān)節(jié)炎，嚴(yán)重影響關(guān)節(jié)的功能。傳統(tǒng)的治療方法如關(guān)節(jié)灌洗術(shù)、關(guān)節(jié)清理術(shù)、微骨折手術(shù)、骨膜移植、自體或異體軟骨移植等只能緩解癥狀，不能有效恢復(fù)受損組織功能。近年出現(xiàn)的軟骨細(xì)胞移植技術(shù)，只能一定程度恢復(fù)軟骨組織的結(jié)構(gòu)功能，但需要二次手術(shù)，并且會(huì)對(duì)供區(qū)造成損傷。
[0004]組織工程方法再造軟骨給臨床上軟骨的修復(fù)帶來了希望。自體軟骨細(xì)胞是構(gòu)建組織工程關(guān)節(jié)軟骨的首選種子細(xì)胞，但屬于一種以損傷治療損傷的修復(fù)辦法，并且會(huì)受到患者自身軟骨細(xì)胞狀態(tài)限制，加上自體組織取材量少，有些甚至不能成功分離培養(yǎng)。這些因素都制約了其臨床應(yīng)用；哺乳動(dòng)物源性軟骨細(xì)胞因取材方便，無需損傷自身健康組織，且易培養(yǎng)獲得足夠優(yōu)質(zhì)種子細(xì)胞而倍受歡迎。軟骨細(xì)胞的細(xì)胞膜上帶有的組織相容性抗原是弱抗原，被軟骨基質(zhì)包埋形成保護(hù)性屏障，當(dāng)軟骨面完整時(shí)，由于沒有軟骨細(xì)胞的暴露，而軟骨基質(zhì)為低抗原，故排斥反應(yīng)不明顯。但是，哺乳動(dòng)物源性軟骨細(xì)胞的免疫原性仍不能輕視，已有文獻(xiàn)報(bào)道異體軟骨細(xì)胞移植引起機(jī)體免疫排斥，影響軟骨損傷修復(fù)效果甚至造成修復(fù)失敗。哺乳動(dòng)物源性軟骨移植的免疫反應(yīng)與軟骨基質(zhì)的形態(tài)和數(shù)量有關(guān)，當(dāng)軟骨陷窩基本形成后，免疫排斥反應(yīng)趨于穩(wěn)定并減輕。但是該免疫反應(yīng)以細(xì)胞免疫為主的慢性排斥反應(yīng)，因此，降低哺乳動(dòng)物源性軟骨細(xì)胞的免疫原性仍是構(gòu)建組織工程軟骨不可忽略的問題。
[0005] 組織工程方法再造軟骨所用的支架載體材料可以分為人工合成材料和天然生物可降解材料。人工合成材料主要分固體和液體兩種，固體以聚羥基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)及兩者的共聚物(PLGA)為代表，其主要優(yōu)點(diǎn)為可塑形，有一定的強(qiáng)度，但在生物相容性、理化性能、降解速率的控制等方面尚有許多問題有待解決，如PGA具有良好的生物相容性，但降解較快，易出現(xiàn)崩裂，使PGA整體塌陷，而且由于PGA降解過快，降解產(chǎn)物羥基酸在局部聚集，會(huì)造成pH值下降，使軟骨細(xì)胞中毒甚至死亡；液體材料以氧化己丙烯為代表，它可在體內(nèi)形成軟骨，但該凝膠在常溫下可溶于水，因而不能用于體外細(xì)胞構(gòu)建支架的三維培養(yǎng)，且其體內(nèi)降解產(chǎn)物對(duì)機(jī)體是否存在不良影響尚不清楚。天然生物可降解材料是與體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)同源成分，例如，膠原、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素以及殼聚糖等均為軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成分及其類似物，廣泛存在于自然界中，天然生物可降解材料以其良好的生物相容性在組織工程研究中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
[0006]經(jīng)檢索，中國(guó)專利02136560.1,03147950.2,200310109203.6 公開了構(gòu)建異體細(xì)
胞來源組織工程軟骨的方法，但均沒有根據(jù)正常軟骨的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分區(qū)域構(gòu)建，可能導(dǎo)致制備的組織工程軟骨與周圍正常軟骨及軟骨下骨整合情況欠佳，且不能獲得與天然軟骨相一致的耐磨、抗壓能力，專利中亦未采取有效手段降低異體細(xì)胞免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)，不能保證細(xì)胞在受體內(nèi)存活并發(fā)揮功能。中國(guó)專利200610026862.7、200810102842.2分別采用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞以及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞，雖然間充質(zhì)干細(xì)胞來源廣泛，但向軟骨方向誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞可能在基因表達(dá)、細(xì)胞外基質(zhì)分泌、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等方面不能與正常軟骨細(xì)胞完全一樣，且無法確定向軟骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞能否長(zhǎng)期穩(wěn)定保持透明軟骨特性。另外，在構(gòu)建組織工程軟骨時(shí)，采用人工合成的支架材料生物相容性較差，降解產(chǎn)物可能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不良影響。不采用支架材料無法為軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)提供三維空間，無法解決培養(yǎng)過程中軟骨細(xì)胞老化、纖維化等問題。中國(guó)專利200710078264.9構(gòu)建了一種具有軟骨層、鈣化層和軟骨下骨層的仿生功能界面骨軟骨復(fù)合組織一體化工程支架，但未根據(jù)正常軟骨的厚度設(shè)定所構(gòu)建各層的相應(yīng)厚度，容易導(dǎo)致所構(gòu)建的支架在臨床應(yīng)用時(shí)與周圍正常組織各層厚度不一致，植入后引起構(gòu)建的支架各層與周圍正常軟骨各層錯(cuò)配，影響整合效果。按現(xiàn)有技術(shù)分層構(gòu)建的組織工程軟骨均存在這一問題。另外，由于軟骨細(xì)胞被大量的細(xì)胞外基質(zhì)包裹起來，細(xì)胞遷移困難，單純的支架材料用于軟骨組織修復(fù)僅能獲得纖維軟骨修復(fù)，長(zhǎng)期效果欠佳。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種關(guān)節(jié)軟骨移植物及其制備方法，所制備關(guān)節(jié)軟骨移植物的厚度、形狀、大小與軟骨損傷部位相匹配，無需術(shù)前塑形，關(guān)節(jié)軟骨移植物具有淺層、中層和深層結(jié)構(gòu)、與軟骨損傷部位的周圍正常軟骨各層相匹配，免疫原性低,整合性好。
[0008]本發(fā)明所提出的關(guān)節(jié)軟骨移植物的特征為，從外至內(nèi)由淺層、中層和深層三層構(gòu)成，每層的厚度、形狀、大小均與軟骨損傷部位相匹配，其中關(guān)節(jié)軟骨移植物淺層由淺層軟骨細(xì)胞及交聯(lián)的II型膠原、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β )組成，中層由中層軟骨細(xì)胞及交聯(lián)的II型膠原、糖胺聚糖(GAG)、TGF-β、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)組成，深層由深層軟骨細(xì)胞及交聯(lián)的II型膠原、GAG、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、TGF-13組成；各層之間通過交聯(lián)的II型膠原復(fù)合而成；所述淺層軟骨細(xì)胞、中層軟骨細(xì)胞和深層軟骨細(xì)胞分別來源于哺乳動(dòng)物源性正常軟骨組織的淺層、中層和深層；所述交聯(lián)的II型膠原是指II型膠原經(jīng)過紫外線或京尼平交聯(lián)。
[0009]本發(fā)明所提出的關(guān)節(jié)軟骨移植物的制備方法，其特征在于，從哺乳動(dòng)物正常軟骨組織的淺層、中層和深層分別獲得各層的軟骨細(xì)胞，將淺層軟骨細(xì)胞與交聯(lián)的II型膠原溶膠混合，添加TGF-β后得到淺層細(xì)胞溶膠，將中層軟骨細(xì)胞與交聯(lián)的II型膠原溶膠混合，添加GAG、TGF-β、bFGF后得到中層細(xì)胞溶膠，將深層軟骨細(xì)胞與交聯(lián)的II型膠原溶膠混合，添加GAG、BMP、TGF-β后得到深層細(xì)胞溶膠；采用三維打印技術(shù)，將淺層、中層和深層細(xì)胞溶膠按照軟骨缺損部位的大小、形狀和厚度，從淺層至深層的順序分層打印，再經(jīng)體外培養(yǎng)得到關(guān)節(jié)軟骨移植物；各層之間通過交聯(lián)的II型膠原溶膠自然凝固復(fù)合而成。具體步驟包括:
步驟一、軟骨細(xì)胞獲取:將哺乳動(dòng)物源性0.5~3mm3大小的正常淺層軟骨組織先用
0.05~0.2%透明質(zhì)酸酶溶液消化15分鐘~I小時(shí)，每15分鐘振蕩一次，消化結(jié)束后用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次；再用0.15~0.25%的II型膠原酶溶液消化I~10小時(shí)，待組織解散，細(xì)胞間疏松時(shí)用PBS終止消化，200目篩網(wǎng)過濾后用PBS洗滌2遍，分離出原代淺層軟骨細(xì)胞，按細(xì)胞密度I X IO4~5 X IO5個(gè)/cm2接種，加入培養(yǎng)液A，37°C、5%C02條件下進(jìn)行原代培養(yǎng)；培養(yǎng)3~7天，淺層軟骨細(xì)胞達(dá)到80~90%融合時(shí)傳代，用0.1~0.5%胰酶溶液消化2~10分鐘，用PBS終止消化并洗滌2遍，按細(xì)胞密度I X IO4~5X IO5個(gè)/cm2接種，加入培養(yǎng)液A，每3~7天傳代一次，每3天換液一次；
將哺乳動(dòng)物源性0.5~3mm3大小的正常中層軟骨組織采用0.1~0.2% II型膠原酶溶液消化I~15小時(shí)，待組織解散，細(xì)胞間疏松時(shí)用PBS終止消化，200目篩網(wǎng)過濾后用PBS洗滌2遍，獲得中層軟骨細(xì)胞，按細(xì)胞密度I X IO4~2 X IO5個(gè)/cm2接種，加入培養(yǎng)液A，37°C、5%C02條件下進(jìn)行原代培養(yǎng)；培養(yǎng)3~7天，中層軟骨細(xì)胞達(dá)到80~90%融合時(shí)傳代，用
0.1~0.5%胰酶溶液消化2~10分鐘，用PBS終止消化并洗滌2遍，按細(xì)胞密度I X IO4~2 X IO5個(gè)/cm2接種，加入培養(yǎng)液A，每3~7天傳代一次，每3天換液一次；
將哺乳動(dòng)物0.5~3_3大 小的正常深層軟骨組織先用0.05~0.15% X型膠原酶溶液消化0.5~2小時(shí)，消化結(jié)束后用PBS沖洗2次，再用0.05~0.15% II型膠原酶溶液消化I~10小時(shí)，待組織解散，細(xì)胞間疏松時(shí)PBS終止消化，200目篩網(wǎng)過濾后PBS洗滌2遍，獲得深層軟骨細(xì)胞，按細(xì)胞密度5 X IO4~5 X IO5個(gè)/cm2接種，加入培養(yǎng)液A，37°C、5%C02條件下進(jìn)行原代培養(yǎng)；培養(yǎng)3~7天，深層軟骨細(xì)胞達(dá)到80~90%融合時(shí)傳代，用0.1~0.5%胰酶溶液消化2~10分鐘，用PBS終止消化并洗滌2遍，按細(xì)胞密度5 X IO4~5 X IO5個(gè)/cm2接種，加入培養(yǎng)液A，每3~7天可傳代一次，每3天換液一次；
上述消化分離原代細(xì)胞過程中所用消化酶溶液濃度均為質(zhì)量體積比(某組分質(zhì)量體積濃度1%是指IOOmL溶劑中含有Ig該組分,下同),使用體積約為軟骨組織體積的10倍，上述原代及傳代培養(yǎng)消化過程均在37°C、5%C02條件下進(jìn)行；所述培養(yǎng)液A的組成為:在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有，胎牛血清(FBS)IOOmL/ L、L_谷氨酰胺10~500 μ g/mL和維生素 C (Vc) 50 ~100 μ g/mL ο
[0010]本步驟根據(jù)天然軟骨組織具有層狀分布不均一、各層區(qū)域細(xì)胞生長(zhǎng)率和基因表達(dá)不同、細(xì)胞外基質(zhì)成分也不盡相同的特點(diǎn)，分別采用不同的消化方法獲得各層軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞，使所構(gòu)建的關(guān)節(jié)軟骨移植物各層與植入處的周圍正常軟骨組織各層相吻合，二者的細(xì)胞生長(zhǎng)率、基因表達(dá)、細(xì)胞外基質(zhì)成分一致，相互間能夠更好地進(jìn)行信號(hào)傳遞、轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)整合。
[0011]步驟二、軟骨細(xì)胞溶膠制備:用體積濃度為5%。的醋酸溶液溶解II型膠原，4°C攪拌過夜后經(jīng)紫外線或京尼平交聯(lián)，制備15~30mg/mL、10~20mg/mL和6~15mg/mL交聯(lián)的II型膠原溶膠；所述紫外線或京尼平交聯(lián)是指在0°C條件下紫外線照射0.5~5小時(shí)或在O~40°C條件下加入1/5~1/10體積的質(zhì)量體積濃度為0.01~2%的京尼平水溶液，交聯(lián)時(shí)間為0.5~3小時(shí)；
分別將步驟一獲得的第2飛代各層軟骨細(xì)胞分別離心，棄去上清；用培養(yǎng)液A調(diào)整淺層軟骨細(xì)胞懸液濃度為2 X IO6~6 X IO7個(gè)/mL，加入1/40體積的3mol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸溶液(HEPES溶液)后，按體積比1:1與15~30mg/mL交聯(lián)的II型膠原溶膠混合，添加終濃度為5~10ng/mL的TGF-β，制備成淺層細(xì)胞溶膠；用培養(yǎng)液A調(diào)整中層軟骨細(xì)胞懸液濃度為5 X IO5~2 X IO7個(gè)/mL，加入1/40體積的3mol/L的HEPES溶液后，按體積比1:1與10~20mg/mL交聯(lián)的II型膠原溶膠混合，添加終濃度為I~10mg/mL的GAG、I~5ng/mL的TGF-β和I~50ng/mL的bFGF，制備成中層細(xì)胞溶膠；用培養(yǎng)液A調(diào)整深層軟骨細(xì)胞懸液濃度為5 X IO4~5 X IO5個(gè)/mL，加入1/40體積的3mol/L的HEPES溶液后，按體積比1:1與6~15mg/mL交聯(lián)的II型膠原溶膠混合，添加終濃度為5~30mg/mL的GAG、5~IOOng/mL的BMP和I~20ng/mL的TGF- β，制備得到深層細(xì)胞溶膠；
步驟三、關(guān)節(jié)軟骨移植物的構(gòu)建:將三維打印快速成型機(jī)的打印系統(tǒng)進(jìn)行消毒，設(shè)置進(jìn)料倉溫度維持4°C，打印平臺(tái)溫度37°C，三軸運(yùn)動(dòng)控制平臺(tái)參數(shù)設(shè)置為:X軸和y軸間隔均為0.05~5μπι，ζ軸間隔為0.1~2.5 μ m，注射器控制模塊參數(shù)設(shè)定為:注射噴頭內(nèi)徑為110~260 μ m，線性打印速度為I~IOmm/秒，注射器噴頭線性速度為I~50 μ m/秒；將步驟二制備的淺層、中層 和深層細(xì)胞溶膠分別置于進(jìn)料倉，關(guān)節(jié)軟骨移植物的淺層打印厚度為0.02~0.5mm,中層打印厚度為0.1~1.4mm，深層打印厚度為軟骨損傷部位的總厚度與已構(gòu)建的淺層、中層關(guān)節(jié)軟骨移植物的差值；三維打印快速成型機(jī)可根據(jù)軟骨損傷部位的三維數(shù)據(jù)，從淺層至深層逐層打印關(guān)節(jié)軟骨移植物，每層打印完成后，在37°C條件下固化10~30分鐘，構(gòu)建完成關(guān)節(jié)軟骨移植物；
步驟三采用三維打印技術(shù)進(jìn)行關(guān)節(jié)軟骨移植物的構(gòu)建，這種打印技術(shù)能通過將原材料先逐行鋪開后逐層垂直鋪展的方式來打印。將軟骨損傷部位的損傷形狀和大小、軟骨各層的厚度轉(zhuǎn)化為三維數(shù)據(jù)發(fā)送給三維打印快速成型機(jī)，三維打印快速成型機(jī)據(jù)此計(jì)算出需要打印多少層細(xì)胞來修復(fù)軟骨損傷，通過對(duì)三維打印快速成型機(jī)三軸運(yùn)動(dòng)控制平臺(tái)和注射控制模塊多參數(shù)的設(shè)定，實(shí)現(xiàn)三維打印關(guān)節(jié)軟骨移植物。
[0012]步驟四、關(guān)節(jié)軟骨移植物的培養(yǎng):將步驟三獲得的關(guān)節(jié)軟骨移植物置于培養(yǎng)液B中，超過關(guān)節(jié)軟骨移植物高度2~3mm，37°C、5%C02條件下培養(yǎng)3~10天，每3天換液I次，制備得到關(guān)節(jié)軟骨移植物；所述培養(yǎng)液B的組成為:在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有，胎牛血清100mL/L、L_谷氨酰胺146~585 μ g/mL、Vc為50~100 μ g/mL、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β !(TGF-^1)為5~10ng/mL、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2 (bFGF-2)為5~25ng/mL。
[0013]將步驟三構(gòu)建的關(guān)節(jié)軟骨移植物在體外培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)液B中的TGF- β I及bFGF-2能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和基質(zhì)合成代謝，使軟骨細(xì)胞被自身分泌細(xì)胞外基質(zhì)所包裹，為軟骨細(xì)胞提供生物力學(xué)支撐，而且細(xì)胞外基質(zhì)所形成的三維空間結(jié)構(gòu)有助于維持軟骨細(xì)胞的形態(tài)和功能。同時(shí)，交聯(lián)的II型膠原溶膠凝固后能夠避免軟骨細(xì)胞流失，使軟骨細(xì)胞能夠在損傷部位發(fā)揮修復(fù)作用，而且能有效隔離參與機(jī)體免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞即免疫細(xì)胞，避免宿主致敏、降低免疫反應(yīng)的作用。
[0014]與現(xiàn)有產(chǎn)品相比，本發(fā)明制備的關(guān)節(jié)軟骨移植物優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在:(1)具有和天然軟骨一致的淺層、中層和深層三層結(jié)構(gòu)，構(gòu)建各層的細(xì)胞來源于正常軟骨相對(duì)應(yīng)各層細(xì)胞，因此關(guān)節(jié)軟骨移植物每一層的厚度、大小、形狀、細(xì)胞組成等方面與軟骨損傷區(qū)域相匹配；植入損傷部位后與周圍正常軟骨各層分布相對(duì)應(yīng)，有利于細(xì)胞間的信號(hào)傳遞、轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控，能夠與周圍正常軟骨組織更好的整合。(2)具有和天然軟骨一致的結(jié)構(gòu)特征，即從淺層到深層II型膠原含量逐漸降低，GAG含量逐漸升高，因此制備的關(guān)節(jié)軟骨移植物具有良好的抗壓性和耐磨性；軟骨移植物中的軟骨細(xì)胞被細(xì)胞外基質(zhì)包裹，避免軟骨移植物植入后發(fā)生免疫排斥，使其能夠長(zhǎng)期存活并發(fā)揮功能，提高軟骨修復(fù)長(zhǎng)期療效。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備方法的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在:(I)采用三維打印技術(shù)，按照軟骨損傷部位的三維數(shù)據(jù)由淺層至深層逐層打印關(guān)節(jié)軟骨移植物，植入損傷部位后能夠與周圍正常軟骨各層分布相對(duì)應(yīng)，有利于細(xì)胞間的信號(hào)傳遞、轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控，能夠與周圍正常軟骨組織更好的整合。(2)通過添加TGF-β、bFGF、BMP和步驟四的體外培養(yǎng)過程，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，從而使關(guān)節(jié)軟骨移植物各層細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原纖維在含量、結(jié)構(gòu)和空間分布特點(diǎn)與正常軟骨一致；通過添加不同濃度的II型膠原和GAG，使所制備的關(guān)節(jié)軟骨移植物具備天然軟骨的結(jié)構(gòu)特征，即從淺層到深層II型膠原含量逐漸降低，GAG含量逐漸升高，因此制備的關(guān)節(jié)軟骨移植物具有良好的抗壓性和耐磨性。(3)本發(fā)明采用的紫外線或京尼平的交聯(lián)方法細(xì)胞毒性低，通過增加II型膠原的交聯(lián)強(qiáng)度可提高其機(jī)械強(qiáng)度，從而顯著增加關(guān)節(jié)軟骨移植物的抗壓性，使其能夠承受關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的復(fù)雜的作用力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明制備的關(guān)節(jié)軟骨移植物示意圖，圖中所示1，2，3分別為三維打印技術(shù)打印的關(guān)節(jié)軟骨移植物深層、中層和淺層。
[0017]圖2為本發(fā)明制備的關(guān)節(jié)軟骨移植物外觀照片及組織學(xué)切片甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果，切片結(jié)果可見細(xì)胞周圍基質(zhì)呈現(xiàn)明顯的紫色，形成類似軟骨陷窩將細(xì)胞包裹在內(nèi)，與天然透明軟骨細(xì)胞的染色結(jié)果和存在狀態(tài)一致。
[0018]圖3為本發(fā)明制備的兔關(guān)節(jié)軟骨移植物在同種異體兔背部皮下植入6周取材外觀照片及組織學(xué)切片結(jié)果圖片。結(jié)果顯示，植入的關(guān)節(jié)軟骨移植物已形成明顯的異位軟骨(圖3A)，并且甲苯胺藍(lán)(圖3B)和番紅_0(圖3C)切片染色結(jié)果顯示形成的異位軟骨具有典型的透明軟骨細(xì)胞異染性，并且有大量軟骨陷窩形成，與天然透明軟骨的結(jié)構(gòu)高度一致，并且取材時(shí)并未見明顯的炎癥 反應(yīng)，說明本發(fā)明制備的關(guān)節(jié)軟骨移植物具有免疫原性低的特點(diǎn)。
[0019]圖4為本發(fā)明制備的兔關(guān)節(jié)軟骨移植物修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨損傷8周后取材結(jié)果外觀照片及組織學(xué)切片結(jié)果圖片。取材時(shí)未見關(guān)節(jié)腔內(nèi)有炎癥反應(yīng)，圖4A外觀照結(jié)果顯示修復(fù)部位光滑平整，色澤、亮度與周圍正常軟骨組織接近，與周圍正常軟骨組織分界不明顯，圖4B甲苯胺藍(lán)及圖4C番紅-O切片染色結(jié)果顯示損傷部位的新生軟骨為透明軟骨，具有與天然軟骨一致的淺層、中層、深層的三層結(jié)構(gòu)，說明本發(fā)明采用三維打印技術(shù)構(gòu)建的關(guān)節(jié)軟骨移植物不僅在厚度、大小、形狀、細(xì)胞組成等方面與軟骨損傷區(qū)域相匹配，而且能夠?qū)崿F(xiàn)淺層、中層、深層與正常軟骨結(jié)構(gòu)一致。
[0020]圖5為采用本發(fā)明制備的關(guān)節(jié)軟骨移植物修復(fù)豬關(guān)節(jié)軟骨損傷6月后取材結(jié)果外觀照片及組織學(xué)切片結(jié)果圖片。圖5A外觀照及圖5B番紅-O染色組織學(xué)切片結(jié)果顯示損傷部位的軟骨獲得良好修復(fù)，表面光滑平整，與周圍正常軟骨整合情況良好，未見有任何磨損或壓塌的跡象。說明本發(fā)明制備的關(guān)節(jié)軟骨移植物具有良好的抗壓耐磨性能，能夠應(yīng)用于負(fù)重部位及大面積的軟骨損傷修復(fù)。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)例I中所采用的正常兔各層軟骨組織來源于第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供健康成年兔關(guān)節(jié)軟骨；實(shí)例2中所采用的正常豬各層軟骨組織取自屠宰場(chǎng)新鮮屠殺的健康豬關(guān)節(jié)，清除肌肉、滑膜和血潰等；實(shí)例中淺層、中層及深層三層軟骨組織的獲取采用Vibratome公司的半自動(dòng)震動(dòng)切片機(jī)Vibratomel500，先測(cè)量軟骨組織總厚度，按照淺層厚度占10~20%、中層厚度占40~60%和深層厚度占20~30%計(jì)算各層的厚度，輸入切片機(jī)中完成各層的分離；實(shí)例I中使用的三維打印快速成型機(jī)為Z Corporation生產(chǎn)的Z510 ;實(shí)例2中使用的三維打印快速成型機(jī)為北京上拓科技有限公司生產(chǎn)的Pro jet? CP CPX 3500 3D打印機(jī)；實(shí)例I中使用的64層螺旋CT及核磁共振(MRI)為德國(guó)西門子生產(chǎn)；實(shí)例2中使用的三維掃描儀是北京上拓科技有限公司的非接觸式Rexcan III三維掃描儀。
[0022]實(shí)施例1、
步驟一、軟骨細(xì)胞獲取:將兔淺層軟骨組織剪成0.5~3mm3大小，先用10倍體積的
0.l%(w/v)透明質(zhì)酸酶溶液消化30分鐘，每15分鐘振蕩一次，消化結(jié)束后用PBS沖洗2次；再加入10倍體積0.2% (w/v)的II型膠原酶溶液消化4小時(shí)，用PBS終止消化并充分吹打細(xì)胞，200目篩網(wǎng)過濾后用PBS洗滌2遍，分離出原代淺層軟骨細(xì)胞，按細(xì)胞密度I X IO5個(gè)/cm2接種于培養(yǎng)瓶，加入培養(yǎng)液A，37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天后，淺層軟骨細(xì)胞達(dá)到80%以上融合時(shí)傳代，加入10倍體積0.25% (w/v)胰酶溶液消化3分鐘，PBS終止并洗滌2遍，按細(xì)胞密度I X IO4個(gè)/cm2接種，加入培養(yǎng)液A，每3天傳代一次；
將兔中層軟骨組織剪成0.5~3_3大小，采用10倍體積的0.15% (w/v) II型膠原酶溶液消化5小時(shí)，PBS終止消化并充分吹打，200目篩網(wǎng)過篩，PBS洗滌2遍后獲得中層軟骨細(xì)胞，按細(xì)胞密度5 X IO4個(gè)/cm2接種，加入培養(yǎng)液A，37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天后，細(xì)胞達(dá)到80%以上融合時(shí)傳代，用10倍體積的0.25% (w/v)胰酶溶液消化4分鐘，PBS終止并洗滌2遍，按細(xì)胞密度2 X IO4個(gè)/cm2接種，加入培養(yǎng)液A，每3天傳代一次；
將兔深層軟骨組織剪成0.5~3_3大小，先用10倍體積的0.1% (w/v) X型膠原酶溶液消化45分鐘，消化結(jié)束后用PBS沖洗2次，再用10倍體積的0.1% (w/v) II型膠原酶溶液消化3小時(shí)，用PBS終止消化，并充分吹打，200目篩網(wǎng)過篩，PBS洗滌2遍后獲得深層軟骨細(xì)胞，按細(xì)胞密度I X IO5個(gè)/cm2接種，加入培養(yǎng)液A，37°C、5%C02培養(yǎng)3天后，細(xì)胞達(dá)到80%以上融合時(shí)傳代，加入10倍體積0.25% (w/v)胰酶溶液消化4分鐘，PBS終止并洗滌2遍，按細(xì)胞密度5 X IO4個(gè)/cm2接種，加入培養(yǎng)液A，每3天傳代一次；
上述原代及傳代培養(yǎng)消化過程均在37°C、5%C02條件下進(jìn)行；所述培養(yǎng)液A的組成為:在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有，胎牛血清100mL/L、L-谷氨酰胺100 μ g/mL和Vc 50 μ g/mL。
[0023]步驟二、軟骨細(xì)胞溶膠制備:用5%。(v/v)的醋酸溶液溶解II型膠原，4°C攪拌過夜，放置冰浴中紫外照射2小時(shí)后,制備16mg/mL、10mg/mL、8mg/mL 3個(gè)濃度的交聯(lián)的II型膠原溶膠；分別將步驟一獲得的第5代各層軟骨細(xì)胞離心，棄去上清；用培養(yǎng)液A調(diào)整淺層軟骨細(xì)胞懸液濃度2 X IO6個(gè)/mL，加入1/40體積的3mol/L的HEPES后，取0.5mL與0.5mL的16mg/mL交聯(lián)的II型膠原溶膠混合，添加終濃度為5ng/mL的TGF-β，制備成淺層細(xì)胞溶膠；用培養(yǎng)液A調(diào)整中層軟骨細(xì)胞懸液濃度為I X IO6個(gè)/mL，加入1/40體積的3mol/L的HEPES后，取2mL與2mL的10mg/mL交聯(lián)的II型膠原溶膠混合，添加終濃度為2mg/mL的GAG、Ing/mL的TGF- β和20ng/mL的bFGF，制備成中層細(xì)胞溶膠；用培養(yǎng)液A調(diào)整深層軟骨細(xì)胞懸液濃度為I X IO5個(gè)/mL,加入1/40體積的3mol/L的HEPES后，取1.5mL與1.5mL的8mg/mL交聯(lián)的II型膠原溶膠混合，添加終濃度為10mg/mL的GAG、10ng/mL的BMP和5ng/mL的TGF- β，得到深層細(xì)胞溶膠；
步驟三、關(guān)節(jié)軟骨移植物的構(gòu)建:采用64層螺旋CT及MRI對(duì)兔軟骨損傷部位進(jìn)行檢測(cè)，從而得知軟骨損傷部位的總厚度、損傷的形狀和大小，用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)(CAD)軟件將所獲得的檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)化為立體光刻(STL)文件，傳輸給三維打印快速成型機(jī)。[0024]將三維打印快速成型機(jī)的打印系統(tǒng)消毒，設(shè)置進(jìn)料倉維持4°C，打印平臺(tái)維持37°C，三軸運(yùn)動(dòng)控制平臺(tái)參數(shù)設(shè)置為:x軸和y軸間隔均為0.1 μ m，z軸間隔為0.15μπι，注射器控制模塊參數(shù)設(shè)定為:注射噴頭內(nèi)徑為110 μ m，線性打印速度為5_/秒，注射器噴頭線性速度為20 μ m/秒。
[0025]根據(jù)掃描得到的兔關(guān)節(jié)軟骨損傷部位總深度為0.5mm以及文獻(xiàn)報(bào)道兔軟骨各層的比例(淺層比例14%，中層56%)計(jì)算得到淺層厚度為0.07 mm、中層厚度為0.28mm和深層厚度為0.15 mm (0.5-0.07-0.28=0.15 mm)，按照計(jì)算結(jié)果設(shè)置淺層、中層和深層的關(guān)節(jié)軟骨移植物打印厚度(兔軟骨各層比例參考文獻(xiàn)=Bairati A, De Biasi S，Cheli F，etal.The head cartilage of cephalopods.1.Architecture and ultrastructure ofthe extracellular matrix[J].Tissue Cell.1987;19 (5):673-685.)。
[0026]將步驟三得到的淺層、中層、深層細(xì)胞溶膠分別放置于打印機(jī)的三個(gè)進(jìn)料倉，三維打印快速成型機(jī)從淺層至深層開始逐層打印關(guān)節(jié)軟骨移植物，各層的打印形狀、大小按照打印指令要求進(jìn)行，每層打印完成后在打印平臺(tái)靜置10分鐘使其自然凝固，將三維打印快速成型機(jī)進(jìn)料口連接至裝有下一層細(xì)胞溶膠的進(jìn)料倉進(jìn)行下一層打印；
步驟四、關(guān)節(jié)軟骨移植物的培養(yǎng):將步驟三獲得的關(guān)節(jié)軟骨移植物置于培養(yǎng)液B中，沒過關(guān)節(jié)軟骨移植物高度2mm，37°C、5%C02條件下培養(yǎng)7天，每3天換液I次，制備完成關(guān)節(jié)軟骨移植物；所述培養(yǎng)液B是指在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有，胎牛血清100mL/L，L-谷氨酰胺 146 μ g/mL、Vc 為 50 μ g/mL、TGF- β ι 為 5ng/mL、bFGF-2 為 5ng/mL。
[0027]本實(shí)例中制備各層細(xì)胞溶膠時(shí)使用的淺層、中層和深層細(xì)胞濃度相對(duì)較低，避免接種細(xì)胞過多導(dǎo)致新生軟骨部位局部的軟骨細(xì)胞量過大而與周圍正常軟骨組織形成明顯分界，所用II型膠原及GAG濃度相對(duì)較低，更適用于軟骨損傷面積較小或非負(fù)重部位的軟骨修復(fù)。將制備得到的關(guān)節(jié)軟骨移植物植入同種異體兔關(guān)節(jié)軟骨的非負(fù)重?fù)p傷部位，其形狀、大小與損傷部位相匹配，術(shù)前無需塑形，8周后取材，取材結(jié)果外觀照(圖4A)及組織學(xué)切片(圖4B、圖4C)結(jié)果顯示損傷部位新生軟骨表面光滑平整，與周圍正常軟骨分界不明顯，損傷部位新生軟骨具有與周圍正常軟骨一致的淺層、中層、深層的分層結(jié)構(gòu)，并且與周圍正常軟骨各層相對(duì)應(yīng)。
[0028]實(shí)施例2、步驟一、軟骨細(xì)胞獲取:將豬淺層軟骨組織剪成0.5~3mm3大小，先用10倍體積的
0.15% (w/v)透明質(zhì)酸酶溶液消化45分鐘，每15分鐘振蕩一次，消化結(jié)束后用PBS沖洗2次；再加入10倍體積的0.25% (w/v) II型膠原酶溶液消化8小時(shí)，PBS終止消化并充分吹打，200目篩網(wǎng)過濾后用PBS洗滌2遍，分離出原代淺層軟骨細(xì)胞，按細(xì)胞密度5父105個(gè)/cm2接種于培養(yǎng)瓶，加入培養(yǎng)液A，37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天后，軟骨細(xì)胞達(dá)到90%以上融合時(shí)傳代，用10倍體積的0.5% (w/v)胰酶溶液消化8分鐘，PBS終止并洗滌2次，按細(xì)胞密度I X IO5個(gè)/cm2接種，加入培養(yǎng)液A，每7天傳代一次，每3天換液一次；
將豬中層軟骨組織剪成0.5~3mm3大小，采用10倍體積的0.2% (w/v) II型膠原酶溶液消化14小時(shí)，PBS終止消化并充分吹打，200目篩網(wǎng)過篩，PBS洗滌2遍后獲得中層軟骨細(xì)胞，按細(xì)胞密度1\105個(gè)八1112接種，加入培養(yǎng)液4，371:、5%0)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天后，細(xì)胞達(dá)到90%以上融合時(shí)傳代，用10倍體積的0.5% (w/v)胰酶溶液消化8分鐘，PBS終止并洗滌2次，按細(xì)胞密度I X IO5個(gè)/cm2接種，加入培養(yǎng)液A，每7天傳代一次，每3天換液一次；將豬深層軟骨組織剪成0.5~3mm3大小，先用10倍體積的0.15% X型膠原酶溶液消化I小時(shí)，消化結(jié)束后PBS沖洗2次，再用10倍體積的0.15% (w/v) II型膠原酶溶液消化10小時(shí)，用PBS終止消化，并充分吹打，200目篩網(wǎng)過篩，PBS洗滌2遍后獲得深層軟骨細(xì)胞，按細(xì)胞密度5 X IO5個(gè)/cm2接種，加入培養(yǎng)液A，37°C、5%C02培養(yǎng)7天后，細(xì)胞達(dá)到90%以上融合時(shí)傳代，用10倍體積的0.5% (w/v)胰酶溶液消化8分鐘，PBS終止并洗滌2次，按細(xì)胞密度I X IO5個(gè)/cm2接種，加入培養(yǎng)液A，每7天傳代一次，每3天換液一次；
上述原代及傳代培養(yǎng)消化過程均在37°C、5%C02條件下進(jìn)行；所述培養(yǎng)液A的組成為:在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有，胎牛血清100mL/L、L-谷氨酰胺500 μ g/mL和Vc 75 μ g/mL。
[0029]步驟二、軟骨細(xì)胞溶膠制備:用5%。(v/v)的醋酸溶液溶解II型膠原，4°C攪拌過夜得到II型膠原溶液；用純化水將京尼平配成0.03% (w/v)的溶液，4°C下按體積比1:5與II型膠原溶液混合，充分?jǐn)嚢?，交?lián)I小時(shí)，制備24mg/mL、18mg/mL、12mg/mL 3個(gè)濃度的交聯(lián)的II型膠原溶膠；
分別將步驟一獲得的第2代各層軟骨細(xì)胞離心，棄去上清；用培養(yǎng)液A調(diào)整淺層軟骨細(xì)胞懸液濃度5 X IO7個(gè)/mL，加入1/40體積的3mol/L的HEPES后，取ImL與ImL的25mg/mL交聯(lián)的II型膠原溶膠混合，添加終濃度為8ng/mL的TGF-β，制備成淺層細(xì)胞溶膠；用培養(yǎng)液A調(diào)整中層軟骨細(xì)胞懸液濃度為I X IO7個(gè)/mL，加入1/40體積的3mol/L的HEPES后，取3mL與3mL的18mg/mL交聯(lián)的II型膠原溶膠混合，添加終濃度為8mg/mL的GAG、5ng/mL的TGF-β和30ng/mL的bFGF，制備成中層細(xì)胞溶膠；用培養(yǎng)液調(diào)整深層軟骨細(xì)胞懸液濃度為5X IO5個(gè)/mL,加入1/40體積的3mol/L的HEPES后,取3mL與3mL的14mg/mL交聯(lián)的II型膠原溶膠混合，添加終濃度為25mg/mL的GAG、80ng/mL的BMP和15ng/mL的TGF- β，得到深層細(xì)胞溶膠；
步驟三、關(guān)節(jié)軟骨移植物的構(gòu)建:通過Rexcan III三維掃描儀掃描豬軟骨損傷部位，將3D影像傳送至與三維打印快速成型機(jī)相連的計(jì)算機(jī)上，然后根據(jù)程序形成打印指令，即軟骨損傷部位的總厚度、損傷的形狀和大小。
[0030]將三維打印快速成型機(jī)的打印系統(tǒng)消毒，設(shè)置進(jìn)料倉維持4°C，打印平臺(tái)維持370C，三軸運(yùn)動(dòng)控制平臺(tái)參數(shù)設(shè)置為:x軸和y軸間隔均為4 μ m，z軸間隔為2 μ m,注射器控制模塊參數(shù)設(shè)定為:注射噴頭內(nèi)徑為240 μ m,線性打印速度為8_/秒，注射器噴頭線性速度為45 μ m/秒。
[0031]根據(jù)檢測(cè)得到的豬關(guān)節(jié)軟骨損傷部位總深度為1.8mm以及文獻(xiàn)報(bào)道豬軟骨各層的比例(淺層比例15%，中層55%)計(jì)算得到淺層厚度為0.24 mm、中層厚度為0.88mm和深層厚度為0.68 mm (1.8-0.24-0.88=0.68 mm)，按照計(jì)算結(jié)果設(shè)置淺層、中層和深層的關(guān)節(jié)軟骨移植物打印厚度(豬軟骨各層比例參考文獻(xiàn)=Redler I, Zimny ML.Scanning electronmicroscopy of normal and abnormal articular cartilage and synovium [J].J BoneJoint Surg Am，1970，52(7):1395-1404.)。
[0032]將步驟三得到的淺層細(xì)胞溶膠置于打印機(jī)的進(jìn)料倉，三維打印快速成型機(jī)按照STL文件完成淺層打印后，在37°C條件下靜置20分鐘使其自然凝固，同上操作進(jìn)行中層、深層打印，最后構(gòu)建完成關(guān)節(jié)軟骨移植物。
[0033]步驟四、關(guān)節(jié)軟骨移植物的培養(yǎng):將步驟三獲得的關(guān)節(jié)軟骨移植物置于培養(yǎng)液B中，沒過關(guān)節(jié)軟骨移植物高度3mm，37°C、5%C02條件下培養(yǎng)10天，每3天換液I次，得到體外制備的關(guān)節(jié)軟骨移植物。所述培養(yǎng)液B是指在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有，胎牛血清100mL/L, L-谷氨酰胺 585 μ g/mL、Vc 為 100 μ g/mL、TGF-β 丨為 10ng/mL、bFGF-2 為 IOng/mL。 [0034]本實(shí)例中采用的各層細(xì)胞濃度比實(shí)例I中高，使制備的關(guān)節(jié)軟骨移植物中的軟骨細(xì)胞能夠更快的與周圍軟骨細(xì)胞建立細(xì)胞間聯(lián)系，有利于更快的修復(fù)損傷部位，并與周圍正常軟骨組織更好的整合，可用于大面積或康復(fù)期較長(zhǎng)的陳舊性軟骨損傷修復(fù)；采用的II型膠原和GAG濃度比實(shí)例I中高，使制備的關(guān)節(jié)軟骨移植物具有更好的機(jī)械強(qiáng)度，可用于負(fù)重部位軟骨損傷修復(fù)。本實(shí)例使用的京尼平交聯(lián)劑比紫外的交聯(lián)強(qiáng)度高，交聯(lián)后能夠進(jìn)一步提高膠原強(qiáng)度并延長(zhǎng)關(guān)節(jié)軟骨移植物體內(nèi)降解時(shí)間，使關(guān)節(jié)軟骨移植物體內(nèi)降解時(shí)間與軟骨再生時(shí)間相匹配，有助于獲得較好的修復(fù)效果。將制備的關(guān)節(jié)軟骨移植物植入同種異體豬關(guān)節(jié)軟骨負(fù)重部位的大面積損傷部位，6月后取材，取材外觀照(圖5A)及番紅-O組織學(xué)切片染色(圖5B)結(jié)果均顯示，損傷部位軟骨已經(jīng)獲得良好修復(fù)，損傷部位新生軟骨與周圍正常軟骨整合良好。
【權(quán)利要求】
1.本發(fā)明所提出的關(guān)節(jié)軟骨移植物的特征為，從外至內(nèi)由淺層、中層和深層三層構(gòu)成，每層的厚度、形狀、大小與軟骨損傷部位的相匹配，其中關(guān)節(jié)軟骨移植物淺層由淺層軟骨細(xì)胞及交聯(lián)的II型膠原、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β組成，中層由中層軟骨細(xì)胞及交聯(lián)的II型膠原、糖胺聚糖、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子組成，深層由深層軟骨細(xì)胞及交聯(lián)的II型膠原、糖胺聚糖、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β組成；各層之間通過交聯(lián)的II型膠原復(fù)合而成；所述淺層軟骨細(xì)胞、中層軟骨細(xì)胞和深層軟骨細(xì)胞分別來源于哺乳動(dòng)物源性正常軟骨組織的淺層、中層和深層；所述交聯(lián)的II型膠原是指II型膠原經(jīng)過紫外線或京尼平交聯(lián)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述關(guān)節(jié)軟骨移植物，其特征在于紫外線或京尼平交聯(lián)是指在.0.C條件下紫外線照射0.5~5小時(shí)或在O~40°C條件下加入1/5~1/10體積的質(zhì)量體積濃度為0.01~2%的京尼平水溶液，交聯(lián)時(shí)間為0.5~3小時(shí)。
3.制備權(quán)利要求1所述的關(guān)節(jié)軟骨移植物的方法，其特征在于，從哺乳動(dòng)物正常軟骨組織的淺層、中層和深層分別獲得各層的軟骨細(xì)胞，將淺層軟骨細(xì)胞與交聯(lián)的II型膠原溶膠混合，添加轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β后得到淺層細(xì)胞溶膠，將中層軟骨細(xì)胞與交聯(lián)的II型膠原溶膠混合，添加糖胺聚糖、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子后得到中層細(xì)胞溶膠，將深層軟骨細(xì)胞與交聯(lián)的II型膠原溶膠混合，添加糖胺聚糖、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β后得到深層細(xì)胞溶膠；采用三維打印技術(shù)，將淺層、中層和深層細(xì)胞溶膠按照軟骨缺損部位的大小、形狀和厚度，從淺層至深層的順序分層打印，再經(jīng)體外培養(yǎng)得到關(guān)節(jié)軟骨移植物；各層之間通過交聯(lián)的II型膠原溶膠自然凝固復(fù)合而成；所述淺層軟骨細(xì)胞、中層軟骨細(xì)胞和深層軟骨細(xì)胞分別來源于哺乳動(dòng)物源性正常軟骨組織的淺層、中層和深層；所述交聯(lián)的II型膠原溶膠是指將II型膠原配制成溶液，在(TC條件下紫外線照射0.5~5小時(shí)或在O~40°C條件下加入1/5~1/10體積的質(zhì)量體積濃度為0.01~2%的京尼平水溶液，交聯(lián)時(shí)間為0.5~3小時(shí)，再調(diào)節(jié)pH至中性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3中所述關(guān)節(jié)軟骨移植物的制備方法，其特征在于，具體步驟包括: 步驟一、軟骨細(xì)胞獲取:將哺乳動(dòng)物源性0.5~3mm3大小的正常淺層軟骨組織先用.0.05~0.2%透明質(zhì)酸酶溶液消化15分鐘~I小時(shí)，每15分鐘振蕩一次，消化結(jié)束后用磷酸鹽緩沖液沖洗2次；再用0.15~0.25%的II型膠原酶溶液消化I~10小時(shí)，待組織解散，細(xì)胞間疏松時(shí)用磷酸鹽緩沖液終止消化，200目篩網(wǎng)過濾后用磷酸鹽緩沖液洗滌2遍，分離出原代淺層軟骨細(xì)胞，按細(xì)胞密度I X 104~5 X 105個(gè)/cm2接種，加入培養(yǎng)液A，37°C、.5%C02條件下進(jìn)行原代培養(yǎng)；培養(yǎng)3~7天，淺層軟骨細(xì)胞達(dá)到80~90%融合時(shí)傳代，用.0.1~0.5%胰酶溶液消化2~10分鐘，用磷酸鹽緩沖液終止消化并洗滌2遍，按細(xì)胞密度.I X 104~5 X 105個(gè)/cm2接種，加入培養(yǎng)液A，每3~7天傳代一次，每3天換液一次； 將哺乳動(dòng)物源性0.5~3mm3大小的正常中層軟骨組織采用0.1~0.2% II型膠原酶溶液消化I~15小時(shí)，待組織解散，細(xì)胞間疏松時(shí)用磷酸鹽緩沖液終止消化，200目篩網(wǎng)過濾后用磷酸鹽緩沖液洗滌2遍，獲得中層軟骨細(xì)胞，按細(xì)胞密度I X 104~2 X 105個(gè)/cm2接種，加入培養(yǎng)液A，37°C、5%C02條件下進(jìn)行原代培養(yǎng)；培養(yǎng)3~7天，中層軟骨細(xì)胞達(dá)到80~90%融合時(shí)傳代，用0.1~0.5%胰酶溶液消化2~10分鐘，用磷酸鹽緩沖液終止消化并洗滌2遍，按細(xì)胞密度I X 104~2 X 105個(gè)/cm2接種，加入培養(yǎng)液A，每3~7天傳代一次，每3天換液一次；將哺乳動(dòng)物源性0.5~3mm3大小的正常深層軟骨組織先用0.05~0.15% X型膠原酶溶液消化0.5~2小時(shí)，消化結(jié)束后用磷酸鹽緩沖液沖洗2次，再用0.05~0.15% II型膠原酶溶液消化I~10小時(shí)，待組織解散，細(xì)胞間疏松時(shí)磷酸鹽緩沖液終止消化，200目篩網(wǎng)過濾后磷酸鹽緩沖液洗滌2遍，獲得深層軟骨細(xì)胞，按細(xì)胞密度5 X IO4~5 X IO5個(gè)/cm2接種，加入培養(yǎng)液A，37°C、5%C02條件下進(jìn)行原代培養(yǎng)；培養(yǎng)3~7天，深層軟骨細(xì)胞達(dá)到80~.90%融合時(shí)傳代，用0.1~0.5%胰酶溶液消化2~10分鐘，用磷酸鹽緩沖液終止消化并洗滌2遍，按細(xì)胞密度5 X IO4~5 X 1O5個(gè)/cm2接種，加入培養(yǎng)液A，每3~7天可傳代一次，每3天換液一次； 上述消化分離原代細(xì)胞過程中所用消化酶溶液濃度均為質(zhì)量體積比，使用體積約為軟骨組織體積的10倍，上述原代及傳代培養(yǎng)消化過程均在37°C、5%C02條件下進(jìn)行；所述培養(yǎng)液A的組成為:在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有，胎牛血清100mL/L、L-谷氨酰胺10~.500 μ g/mL 和維生素 C 50 ~100 μ g/mL ； 步驟二、軟骨細(xì)胞溶膠制備:用體積濃度為5%。的醋酸溶液溶解II型膠原，4°C攪拌過夜后經(jīng)紫外線或京尼平交聯(lián)，制備15~30mg/mL、10~20mg/mL和6~15mg/mL交聯(lián)的II型膠原溶膠；所述紫外線或京尼平交聯(lián)是指在(TC條件下紫外線照射0.5~5小時(shí)或在O~.40°C條件下加入1/5~1/10體積的質(zhì)量體積濃度為0.01~2%的京尼平水溶液，交聯(lián)時(shí)間為0.5~3小時(shí)； 分別將步驟一獲得的第2飛代各層軟骨細(xì)胞分別離心，棄去上清；用培養(yǎng)液A調(diào)整淺層軟骨細(xì)胞懸液濃度為2 X IO6~6 X IO7個(gè)/mL，加入1/40體積的3mol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸溶液后，按體積比1:1與15~30mg/mL交聯(lián)的II型膠原溶膠混合，添加終濃度為5~10ng/mL的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 -β，制備成淺層細(xì)胞溶膠；用培養(yǎng)液A調(diào)整中層軟骨細(xì)胞懸液濃度為5Χ1O5~2Χ 1O7個(gè)/mL，加入1/40體積的3mol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸溶液后，按體積比1:1與10~20mg/mL交聯(lián)的II型膠原溶膠混合，添加終濃度為I~10mg/mL的糖胺聚糖、1~5ng/mL的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β和I~50ng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子,制備成中層細(xì)胞溶膠；用培養(yǎng)液A調(diào)整深層軟骨細(xì)胞懸液濃度為5 X 1O4~5 X IO5個(gè)/mL，加入.1/40體積的3mol/L的4-輕乙基哌嗪乙磺酸溶液后,按體積比1:1與6~15mg/mL交聯(lián)的II型膠原溶膠混合，添加終濃度為5~30mg/mL的糖胺聚糖、5~100ng/mL的骨形態(tài)發(fā)生蛋白和1~20ng/mL的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β，制備得到深層細(xì)胞溶膠； 步驟三、關(guān)節(jié)軟骨移植物的構(gòu)建:采用步驟二制備的淺層、中層和深層細(xì)胞溶膠，使用三維打印快速成型機(jī)從淺層至深層逐層打印關(guān)節(jié)軟骨移植物，關(guān)節(jié)軟骨移植物的淺層打印厚度為0.02~0.5mm,中層打印厚度為0.1~1.4mm，深層打印厚度為軟骨損傷部位的總厚度與已構(gòu)建的淺層、中層關(guān)節(jié)軟骨移植物的差值；每層打印完成后，在37°C條件下固化.10~30分鐘，構(gòu)建完成關(guān)節(jié)軟骨移植物； 步驟四、關(guān)節(jié)軟骨移植物的培養(yǎng):將步驟三獲得的關(guān)節(jié)軟骨移植物置于培養(yǎng)液B中，超過關(guān)節(jié)軟骨移植物高度2~3mm，37°C、5%C02條件下培養(yǎng)3~10天，每3天換液I次，制備得到關(guān)節(jié)軟骨移植物；所述培養(yǎng)液B的組成為:在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有，胎牛血清100mL/L、L_谷氨酰胺146~585 μ g/mL、維生素C為50~100 μ g/mL、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β ι為5~10ng/mL、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2為5~25ng/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中所述關(guān)節(jié)軟骨移植物，其特征在于，所述關(guān)節(jié)軟骨移植物在軟骨`損傷修復(fù)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61F2/30GK103920190SQ201310012363
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2013年1月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月14日
【發(fā)明者】叢麗媛, 劉影 申請(qǐng)人:陜西博鴻生物科技有限公司