本發明涉及一種動物關節軟骨加工制品及其制備方法和應用，特別是該動物關節軟骨加工制品在制備用于改善骨關節磨損病痛和軟骨膠原蛋白流失的產品中的應用。
背景技術：
人隨著年齡的增長，由于消化吸收系統的退化，對食物中的鈣及膠原蛋白吸收越來越少，因此缺鈣缺膠原蛋白是老年人的普遍現象。由于缺鈣缺膠原蛋白，許多老年人的骨關節軟骨膠原蛋白流失殆盡，出現了骨頭磨骨頭的狀況，因而很多老年人骨關節疼痛不能走路。
目前，用于關節軟骨磨損的主要藥物是胺糖，但胺糖只能解決骨關節的潤滑和疼痛問題，而不能根本解決關節軟骨磨損的問題。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種動物關節軟骨加工制品及其制備方法和應用。
本發明提供了一種動物關節軟骨加工制品的制備方法，依次包括如下步驟：
(1)按照如下配比將各個物質混合，然后調pH為7.5-8.5(pH具體可為7.5-8、8-8.5、7.5、8或8.5)：
1g關節軟骨膠原蛋白粉：8-10g水(水具體可為8-9g、9-10g、8g、9g或10g)：1×104-3×104U胰蛋白酶(胰蛋白酶具體可為1×104-2×104U、2×104-3×104U、1×104U、2×104U或3×104U)：1×104-3×104U枯草桿菌蛋白酶(枯草桿菌蛋白酶具體可為1×104-2×104U、2×104-3×104U、1×104U、2×104U或3×104U)：5×104-6×104U木瓜蛋白酶(木瓜蛋白酶具體可為5×104-5.5×104U、5.5×104-6×104U、5×104U、5.5×104U或6×104U)：1.5×104-2×104U無花果蛋白酶(無花果蛋白酶具體可為1.5×104-1.8×104U、1.8×104-2×104U、1.5×104U、1.8×104U或2×104U)：28×104-35×104U菠蘿蛋白酶(菠蘿蛋白酶具體可為28×104-32×104U、32×104-35×104U、28×104U、32×104U或35×104U)；
所述關節軟骨膠原蛋白粉是以離體的動物關節軟骨為原料制備得到的；
(2)進行反應。
步驟(2)中，所述反應的條件為：46-48℃(具體可為46-47℃、47-48℃、46℃、47℃或48℃)反應3-4小時(具體可為3小時或4小時)。
步驟(2)中，所述反應具體可為振蕩反應。所述振蕩反應具體可為80-120rpm振蕩反應(例如80-100rpm、100-120rpm、80rpm、100rpm或120rpm)。
所述方法還包括如下步驟：完成步驟(2)后，取整個反應體系，先進行滅菌和酶滅活，然后冷卻，最后過濾并收集濾液。所述滅菌和酶滅活的方法具體可為：100℃、5-10分鐘(具體可為5-8分鐘、8-10分鐘、5分鐘、8分鐘或10分鐘)。所述過濾具體可采用孔徑為0.5mm的濾膜。
所述方法還包括如下步驟：
(3)完成步驟(2)后，取整個反應體系，100℃靜置5-10分鐘(具體可為5-8分鐘、8-10分鐘、5分鐘、8分鐘或10分鐘)；
(4)完成步驟(3)后，取整個反應體系，4-8℃(具體可為4-6℃、6-8℃、4℃、6℃或8℃)靜置36-60小時(具體可為36-48小時、48-60小時、36小時、48小時或60小時)；
(5)完成步驟(4)后，取整個反應體系，過濾并收集濾液。
所述過濾具體可采用孔徑為0.5mm的濾膜。
本發明還保護一種動物關節軟骨加工制品的制備方法，包括如下步驟：
取關節軟骨膠原蛋白粉，用胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶和菠蘿蛋白酶進行處理；
所述關節軟骨膠原蛋白粉是以離體的動物關節軟骨為原料制備得到的。
關節軟骨膠原蛋白粉、胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶和菠蘿蛋白酶的配比如下：1g關節軟骨膠原蛋白粉：1×104-3×104U胰蛋白酶(胰蛋白酶具體可為1×104-2×104U、2×104-3×104U、1×104、2×104U或3×104U)：1×104-3×104U枯草桿菌蛋白酶(枯草桿菌蛋白酶具體可為1×104-2×104U、2×104-3×104U、1×104U、2×104U或3×104U)：5×104-6×104U木瓜蛋白酶(木瓜蛋白酶具體可為5×104-5.5×104U、5.5×104-6×104U、5×104U、5.5×104U或6×104U)：1.5×104-2×104U無花果蛋白酶(無花果蛋白酶具體可為1.5×104-1.8×104U、1.8×104-2×104U、1.5×104U、1.8×104U或2×104U)：28×104-35×104U菠蘿蛋白酶(菠蘿蛋白酶具體可為28×104-32×104U、32×104-35×104U、28×104U、32×104U或35×104U)。
以上任一所述關節軟骨膠原蛋白粉的制備方法如下：取離體的動物關節軟骨，先在沸水煮3-8小時(具體可為3-6小時、6-8小時、3小時、6小時或8小時)，然后用水清洗，然后在100-140℃(具體可為100-120℃、120-140℃、100℃、120℃或140℃)的溫度下烘干，粉碎。
所述關節軟骨膠原蛋白粉的粒度為120微米以下。
以上任一所述動物具體可為豬、雞、牛、鴨、鵝、羊、兔、鹿等。
以上任一所述方法制備得到的動物關節軟骨加工制品也屬于本發明的保護范圍。
以上任一所述方法制備得到的動物關節軟骨加工制品可進行再加工，從而以濃縮液、凍干粉、噴霧干燥干粉、水劑或固體劑等多種形式存在。
本發明還保護所述動物關節軟骨加工制品在制備產品中的應用；所述產品的功能為如下(a)、(b)和(c)中的至少一種：
(a)增加關節軟骨中的膠原蛋白含量；
(b)預防和/或治療關節軟骨磨損；
(c)預防和/或治療退行性關節炎。
所述產品為藥品或保健品或食品。所述食品可以為保健食品或功能食品。
本發明還保護一種產品，其活性成分為所述動物關節軟骨加工制品；所述產品的功能為如下(a)、(b)和(c)中的至少一種：
(a)增加關節軟骨中的膠原蛋白含量；
(b)預防和/或治療關節軟骨磨損；
(c)預防和/或治療退行性關節炎。
所述產品為藥品或保健品或食品。所述食品可以為保健食品或功能食品。
所述產品中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述載體包括藥學領域常規的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等。
所述產品的劑型可為口服液、片劑、顆粒劑、膠囊、膏劑、膜劑等多種形式。
本發明以動物關節軟骨膠原蛋白粉為原料，采用由胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶和菠蘿蛋白酶五種酶形成的復合酶對其進行處理，獲得了動物關節軟骨加工制品。
本發明提供的動物關節軟骨加工制品含有多種氨基酸、多種維生素、鈣及多種人體極易吸收的有機天然的微量元素(這些微量元素與蛋白質天然螯合)。本發明提供的動物關節軟骨加工制品含有大量寡肽，分子量小易吸收，可促進膠原蛋白沉淀在關節軟骨上。本發明提供的動物關節軟骨加工制品無苦味。
本發明提供的動物關節軟骨加工制品可以增加關節軟骨中的膠原蛋白含量，從而預防或治療關節軟骨磨損。由于關節軟骨磨損的引發退行性關節炎，因此本發明提供的動物關節軟骨加工制品也適用于退行性關節炎的預防或治療。
本發明將產生巨大的經濟和社會效益，其前景非常廣闊。
具體實施方式
以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。
氨基葡萄糖鹽酸鹽，英文D-Glucosamine Hydrochloride，分子式C6H13NO5·HCl，分子量215.5。硫酸軟骨素：分子式C14H21NO14S。
胰蛋白酶：CAS編號9002-07-7；SIGMA，貨號T4799，固態，規格為1000-2000U/mg。1U的定義：在pH7.6、25℃的條件下，以N-乙酰-L-酪氨酸乙酯(又稱BAEE)為底物，每分鐘ΔA253為0.001的酶量為1BAEE unit，也就是1U。
枯草桿菌蛋白酶：CAS編號9014-01-1；金穗生物，貨號2598337，固態，規格為7-14U/mg。1U的定義：在pH 7.5、37℃的條件下，水解酪蛋白，每分鐘產生1.0μmol酪氨酸的酶量為1U。
木瓜蛋白酶：CAS編號9001-73-4；生工生物工程(上海)股份有限公司，貨號A003118，固態，規格為>15U/mg。1U的定義：在pH6.2、25℃的條件下，每分鐘水解1μmol N-乙酰-L-酪氨酸乙酯(又稱BAEE)的酶量。
無花果蛋白酶：CAS編號9001-33-6；SIGMA，貨號F4165，固態，規格為≥0.1U/mg。1U的定義：在pH 7.0、37℃的條件下，以酪蛋白為底物，每分鐘ΔA280為1.0的酶量為1U。
菠蘿蛋白酶：CAS編號9001-00-7；生工生物工程(上海)股份有限公司，貨號A500243，固態，規格為3-7U/mg。1U的定義：在pH4.6、25℃的條件下，Na-Z-L-lysinep-nitrophenyl ester為底物，每分鐘釋放1.0μmol對硝基苯酚的酶量為1U。
實施例1、制備液態產品
1、制備關節軟骨膠原蛋白粉。
取豬的關節軟骨，先在沸水煮6小時，然后用水清洗，然后在120℃的溫度下烘干，粉碎，得到關節軟骨膠原蛋白粉(粒度為120微米以下)。
2、將各個原料混合，調pH值為8，然后47℃、100rpm振蕩反應3小時。
原料及其配比如下：1g關節軟骨膠原蛋白粉、9g水、2×104U胰蛋白酶、2×104U枯草桿菌蛋白酶、5.5×104U木瓜蛋白酶、1.8×104U無花果蛋白酶和32×104U菠蘿蛋白酶。
3、完成步驟2后，取整個反應體系，100℃靜置8分鐘(目的：滅菌和酶滅活)。
4、完成步驟3后，取整個反應體系，6℃靜置48小時。
5、完成步驟4后，取整個反應體系，采用孔徑為0.5mm的濾膜過濾并收集濾液，即為本發明得到的產品。
實施例2、產品的性能
取實施例1得到的液態產品，檢測各個性能，結果如下：
液態產品中，Ⅱ型膠原蛋白含量為0.1-1mg/ml。
液態產品中，含1.02-2.81mg/ml甘氨酸、1.76-2.81mg/ml丙氨酸、0.62-1.14mg/ml脯氨酸、1.4-2.35mg/ml絲氨酸、0.13-0.43mg/ml酪氨酸、0.54-3.21mg/ml半胱氨酸、2.49-4.69mg/ml天冬氨酸、3.77-5.91mg/ml谷氨酸、0.67-0.43mg/ml精氨酸、0.62-1.2mg/ml組氨酸，2.02-3.47mg/ml賴氨酸、0.31-0.52mg/ml色氨酸、1.23-1.42mg/ml苯丙氨酸、0.82-1.58mg/ml甲硫氨酸、1.24-2.1mg/ml蘇氨酸、1.66-2.76mg/ml異亮氨酸、2.49-4.26mg/ml亮氨酸、0.54-3.21mg/ml纈氨酸。賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸為人體必需而又不能合成的氨基酸。
液態產品中，含167國際單位維生素A、2mg/ml維生素C、1國際單位維生素E、0.05mg/ml維生素Bl、0.06mg/ml維生素B2、0.2μg/ml維生素B12。
液態產品中，含5.4mg/ml鈣元素、0.2mg/ml鋅元素、0.83μg/ml硒元素、3.3mg/ml鎂元素、0.07mg/ml銅元素、0.6mg/ml鐵元素、0.08mg/ml錳元素。
液態產品中，含10mg/ml酪蛋白磷酸肽。
液態產品中，含9mg/ml寡肽(寡肽的相對分子質量在1000Da以下，由2-6個氨基酸組成)。
液態產品無苦味。
實施例3、產品的服用效果
BALB/c小鼠，分成三組，每組20只，分組處理如下：
第一組：每天每只小鼠口服1ml實施例1制備的液態產品；
第二組：每天每只小鼠口服5mg氨基葡萄糖鹽酸鹽和5mg硫酸軟骨素；
第三組：不進行任何處理；
各組小鼠正常飼喂和飲水。
90天后，取各組小鼠，處死，取腿關節軟骨，檢測其中的Ⅱ型膠原蛋白含量。
以第三組小鼠的腿關節軟骨中的Ⅱ型膠原蛋白含量為1，第一組小鼠的腿關節軟骨中的Ⅱ型膠原蛋白含量為1.6，第二組小鼠的的腿關節軟骨中的Ⅱ型膠原蛋白含量為1.2。
實施例4、產品的服用效果
BALB/c小鼠，分成三組，每組20只，分組處理如下：
第一組：每天每只小鼠口服1ml實施例1制備的液態產品；
第二組：每天每只小鼠口服5mg氨基葡萄糖鹽酸鹽和5mg硫酸軟骨素；
第三組：不進行任何處理；
各組小鼠正常飼喂和飲水，每天每只小鼠連續跑步5公里。
分別于30天后和60天后，取各組小鼠(每次每組取10只)，處死，解剖觀察腿關節的磨損狀況。
30天后，第三組小鼠的腿關節磨損情況最嚴重，第二組小鼠腿關節存在一定磨損，第一組小鼠基本沒有觀察到腿關節磨損。60天后，第三組小鼠的腿關節磨損情況非常嚴重，第二組小鼠腿關節磨損情況也比較嚴重，第一組小鼠基本沒有觀察到腿關節磨損。
實施例5、液態產品的制備和效果
一、液態產品Ⅰ的制備
1、制備關節軟骨膠原蛋白粉。
取雞的關節軟骨，先在沸水煮3小時，然后用水清洗，然后在100℃的溫度下烘干，粉碎，得到關節軟骨膠原蛋白粉(粒度為120微米以下)。
2、將各個原料混合，調pH值為7.5，然后46℃、80rpm振蕩反應3小時。
原料及其配比如下：1g關節軟骨膠原蛋白粉、8g水、1×104U胰蛋白酶、3×104U枯草桿菌蛋白酶、5×104U木瓜蛋白酶、2×104U無花果蛋白酶和28×104U菠蘿蛋白酶。
3、完成步驟2后，取整個反應體系，100℃靜置5分鐘。
4、完成步驟3后，取整個反應體系，4℃靜置60小時。
5、完成步驟4后，取整個反應體系，采用孔徑為0.5mm的濾膜過濾并收集濾液，即為液態產品Ⅰ。
二、液態產品Ⅱ的制備
1、制備關節軟骨膠原蛋白粉。
取牛的關節軟骨，先在沸水煮8小時，然后用水清洗，然后在140℃的溫度下烘干，粉碎，得到關節軟骨膠原蛋白粉(粒度為120微米以下)。
2、將各個原料混合，調pH值為8.5，然后48℃、120rpm振蕩反應4小時。
原料及其配比如下：1g關節軟骨膠原蛋白粉、10g水、3×104U胰蛋白酶、1×104U枯草桿菌蛋白酶、6×104U木瓜蛋白酶、1.5×104U無花果蛋白酶和35×104U菠蘿蛋白酶。
3、完成步驟2后，取整個反應體系，100℃靜置10分鐘。
4、完成步驟3后，取整個反應體系，8℃靜置36小時。
5、完成步驟4后，取整個反應體系，采用孔徑為0.5mm的濾膜過濾并收集濾液，即為液態產品Ⅱ。
三、產品的服用效果
BALB/c小鼠，分成三組，每組20只，分組處理如下：
第一組：每天每只小鼠口服1ml步驟一制備的液態產品Ⅰ；
第二組：每天每只小鼠口服1ml步驟二制備的液態產品Ⅱ；
第三組：不進行任何處理；
各組小鼠正常飼喂和飲水，每天每只小鼠連續跑步5公里。
60天后，取各組小鼠處死，解剖觀察腿關節的磨損狀況。
60天后，第三組小鼠的腿關節磨損情況非常嚴重，第二組小鼠和第一組小鼠腿關節磨損不顯著。