對新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012感染具有抑制作用的多肽及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物醫藥領域。本發明提供了一種多肽，該多肽含有如SEQ?ID?NO?9所示的序列并且對新型冠狀病毒HCoV-EMC?2012感染具有抑制作用。本發明還提供了編碼該多肽的核酸分子、相關重組蛋白、核酸分子、表達載體和重組細胞。本發明的多肽可與醫學上常可接受的載體或賦形劑等制成藥劑，用于預防和抑制新型冠狀病毒HCoV-EMC?2012的感染，也可以與其他藥物組合。本發明為新型冠狀病毒HCoV-EMC?2012感染的預防或治療提供候選多肽類藥物。
【專利說明】對新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012感染具有抑制作用的多肽及其應用

【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥領域，涉及一組對新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012感染具有抑制能力的多肽，還涉及編碼該多肽的核酸分子、相關重組蛋白、核酸分子、表達載體和重組細胞。

【背景技術】
[0002]2012年，一種源自中東的新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012，已經導致了多人死亡，并且死亡率高達57%，其余患者也都患上了嚴重疾病。目前研究發現該新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012與SARS冠狀病毒感染所用的受體不同，其受體為二肽基肽酶4(Dipeptidylpeptidase 4, DPP4),—種分布廣泛的人細胞受體,從而導致該病毒對人體細胞均有廣泛的感染能力。另外，新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012能夠感染多種動物，包括蝙蝠和豬，使其成為持續的感染源，這也意味著該病毒有從動物傳播給人類的可能。并且，目前已發現該病毒可在家庭中進行傳播，暗示了其具有了人傳人的能力，加上其高死亡率、未知來源及傳播途徑引起了全球公共健康機構的高度關注。同時，針對新型冠狀病毒HCoV-EMC2012尚無有效的特異性藥物，現有治療措施僅是針對患者癥狀進行支持治療。因此，急需一種針對HCoV-EMC的特異性治療和預防性藥物。
[0003]I型包膜病毒，如艾滋病病毒(HIV)、流感、SRAS冠狀病毒等，其包膜糖蛋白和相應受體介導的病毒融合和進入是該類病毒感染的第一個步驟，也是最關鍵的步驟之一。包膜糖蛋白與受體結合后，S2蛋白N端的融合肽被暴露，使其能夠插入靶細胞膜中。之后S2蛋白發生一系列構象改變，導致蛋白質成為其促進融合的狀態(fusogenic state)，使得病毒和靶細胞膜密切接近并促進膜融合。
[0004]進入抑制劑即是作用于病毒進入細胞階段的藥物。目前，進入抑制劑在艾滋病病毒(HIV)的治療方面已起到重要的作用。例如，恩夫韋肽(Enfuvirtide，Fuzeon，又稱T20)是美國FDA批準的國際上第一個多肽類HIV進入抑制劑，其目前被用于艾滋病的臨床治療，對那些已產生HIV逆轉錄酶抑制劑抗藥性的病人有很好的療效。本申請的發明人之一——姜世勃是T20前體藥物(多肽637-666)的發明人(美國專利號:5，444，044)。
[0005]進入抑制劑多來源于病毒S2蛋白的N-端序列(NHR或HRl)或C-端重復序列(CHR或HR2)。以HIV為例，其gp41的晶體學研究顯示，CHR能夠與NHR相互作用，形成被稱作“發夾三聚體”或“六螺旋束”(6-HB)的構象，其中三個平行的NHR形成三聚體卷曲螺旋核心，三個CHR反向平行地包裝成沿著內部卷曲螺旋表面的高度保守的疏水溝。源自NHR和CHR區的肽分別被稱作NHR-肽和CHR-肽。大部分的CHR-肽是有效的HIV融合抑制劑，它們主要是通過與病毒gp41內部NHR三聚體結合以干擾6-HB形成而發揮作用。


【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一組對新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012感染具有抑制功能的多肽片段。
[0007]本發明的另外一個目的是提供對新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012感染具有抑制功能的重組蛋白，該蛋白的核心區域是本申請中所涉及的具有抑制HCov-EMC 2012病毒感染能力的多肽序列。
[0008]
本發明經過一系列的篩選和驗證確定了新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012 S蛋白的S2蛋白區域，通過同源性比較分析了 S2蛋白的N-端序列(HRl)和C端序列(HR2)。根據該序列設計了針對于新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012的進入抑制劑，為進一步研發新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012的預防和治療藥物提供重要的理論及應用基礎，填補了本【技術領域】的空白。本發明以此為理論基礎。
[0009]本發明提供了一種多肽，該多肽含有如SEQ ID NO 9所示的序列并且對新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012感染均具有抑制作用。
[0010]所述的多肽包括由如SEQ ID NO 9所示的多肽經過取代、缺失或添加一個或者多個氨基酸而構成并且能夠抑制HCoV-EMC病毒感染的多肽。
[0011]在本發明的一個實施例中，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 6、SEQ ID NO7或者SEQ ID NO 8所示。
[0012]上述多肽可以根據其氨基酸序列人工合成。
[0013]本發明還涉及了一組核酸分子，其編碼本發明所述分離的肽。包括密碼子優化衍生物。
[0014]本發明還涉及了一組表達載體，其包含本發明所述分離的核酸分子。
[0015]本發明還涉及了一組分離的重組細胞，其包含本發明所述的表達載體。
[0016]本發明還涉及了本發明所述的分離的肽、分離的核酸分子、表達載體或重組細胞作為藥物的應用。
[0017]本發明還涉及了一組藥物組合物，其包含本發明所述的多肽、核酸分子、表達載體和/或重組細胞以及任選存在的藥物可接受的載體或賦形劑。例如，其有效成分包含上述多肽、重組蛋白、核酸、表達載體或者重組細胞。
[0018]本發明還涉及了本發明所述的多肽、核酸分子、表達載體或重組細胞在制備用于抑制新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012感染藥物組合物中的應用。
[0019]本發明還涉及了一種抑制或預防新型冠狀病毒HCOV-EMC 2012感染的方法，包括給予被新型冠狀病毒HCOV-EMC 2012感染或有被新型冠狀病毒HCOV-EMC 2012感染風險的對象，例如體外培養的細胞等，施用本發明所述的多肽、核酸分子、表達載體、重組細胞或藥物組合物。
[0020]本發明還涉及上述多肽在制備抗新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012感染藥物中的應用。例如，將上述多肽用于預防新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012感染細胞。
[0021]
新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012源自中東，至今已經導致了多人死亡，并且死亡率高達57%.HCoV-EMC 2012能夠感染多種動物，包括蝙蝠和豬，使其成為持續的感染源，并且，目前已發現該病毒可在家庭中進行傳播，暗示了其具有了人傳人的能力，加上其高死亡率、未知來源及傳播途徑引起了全球公共健康機構的高度關注。由于新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012尚無有效的特異性藥物，因此，急需一種針對HCoV-EMC的特異性治療和預防性藥物。
[0022]本發明提供了一組含有如SEQ ID NO 9所示序列的多肽，試驗表明其對新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012感染具有抑制作用。與該多肽共同孵育的非洲綠猴腎細胞具有顯著抗病毒活性，其IC50值甚至達到nM級。進一步試驗表明，HR1-5與HR2-2能相互結合，形成hCoV-EMC的融合六螺旋，因而推測HR2系列多肽能與病毒的HRl區域結合，從而干擾病毒與細胞膜之間的融合，阻斷病毒感染。本發明的多肽可與醫學上常可接受的載體或賦形劑等制成藥劑，用于預防和抑制新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012的感染，也可以與其他藥物組合。本發明為新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012感染的預防或治療提供候選多肽類藥物。
[0023]本發明獲得了能夠抑制新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012的感染的多肽抑制劑，為進一步研發新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012的預防和治療藥物提供重要的理論及應用基礎，填補了國際空白。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1、HCoV-EMC2012 S2蛋白分子中的功能結構域以及多肽在該蛋白中的位置，其中，殘基編號對應于其在S蛋白全長的位置；FP，融合肽；HR1，七肽重復序列I ;HR2，七肽重復序列2 ;TM，跨膜結構域；CP，胞質結構域。
[0025]圖2、顯示HR2系列多肽對HCoV-EMC 2012的病毒抑制實驗結果，
其中，a、b 、c分別為HR2-1、HR2-2、HR2-3多肽對HCoV-EMC 2012的病毒抑制實驗結果O
[0026]圖3、顯示HRl系列多肽對HCoV-EMC 2012的病毒抑制實驗結果，其中，HR1-1、HR1-2、HR1-3、HR1-4和HR1-5在2-7 μΜ均未顯示明顯的抑制活性。
[0027]圖4、顯示HR2多肽的抗病毒作用機制。HR2多肽與HR1-5結合。
[0028]表1、多肽序列及抑制活性。其中，IC50即半數抑制濃度，是指抑制50% HCoV-EMC感染的藥物濃度。

【具體實施方式】
[0029]本發明通過下述實施例進一步闡明，但任何實施例或其組合不應當理解為對本發明的范圍或實施方式的限制。本發明的范圍由所附權利要求書限定，結合本說明書和本領域一般常識，本領域普通技術人員可以清楚地明白權利要求書所限定的范圍。在不偏離本發明的精神和范圍的前提下，本領域技術人員可以對本發明的技術方案進行任何修改或改變，這種修改和改變也包含在本發明的范圍內。
[0030]
實驗材料:
多肽:
發明人通過將新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012 S蛋白與已知SARS冠狀病毒S2蛋白進行同源性比對和試驗測定，確定了新型冠狀病毒HcoV-EMC 2012 S2蛋白的HRl和HR2序列位置。選取來自HRl和HR2片段的36-42個氨基酸大小的多肽片段。共獲的來自于HRl的5條多肽和來自于HR2的3條多肽,通過公司(GL B1chem Shanghai Ltd)進行合成及純化，其純度>99%。
[0031]
實施例1多肽對新型冠狀病毒Hc0V-EMC 2012進入抑制實驗
將多肽 HR1-1、HR1-2、HR1-3、HR1-4、HR1-5、HR2-1、HR2_2 和 HR2-3 (圖1 所示)進行 4倍梯度稀釋；每種樣品取100 μL加入預先鋪有每孔50，000個非洲綠猴腎細胞(Veix)細胞)的96孔細胞培養板，37°C孵育2小時，之后去除上清，用PBS洗細胞2次，加入100 μL新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012 (10TCID50)，37°C孵育I小時；之后再將細胞用PBS洗2次。之后再將100 μL樣品/孔加入96孔板與細胞進一步作用。之后細胞在37°C培養3天。記錄細胞病變效應(CPE)，之后每孔加入10 μL MTT。37°C孵育4小時；每孔再加入100 μL含有1%SDS的0.01M HCl，37°C孵育過夜后于波長570nm測量吸光度。
[0032]抗病毒結果如圖2所示，C-端(HR2)多肽中HR2-1、HR2_2和HR2-3均顯示出了抗病毒活性，其IC50分別為1.82μΜ 、0.62 μΜ和0.43 μΜ，其中HR2-1的活性相對較弱，而HR2-2和 HR2-3 的活性均在 nM 級。但 N-端(HRl)多肽，如 HR1-1、HR1-2、HR1-3、HR1-4 和 HR1-5在2-7 μΜ均未顯示明顯的抑制活性(圖3)。
[0033]表1是多肽序列及抑制HCoV-EMC感染的活性。
[0034]
表1

【權利要求】
1.一種對新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012感染均具有抑制作用的多肽，其特征在于，該多肽含有如SEQ ID NO 9所示的序列。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽能夠抑制HCoV-EMC病毒感染并且該多肽的氨基酸序列由如SEQ ID NO 9所示的多肽經過取代、缺失或添加一個或者多個氨基酸而構成。
3.如權利要求2所述的多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列如SEQID NO 6、SEQ ID NO 7 或者 SEQ ID NO 8 所示。
4.含有權利要求1所述的多肽的重組蛋白。
5.一種核酸，其特征在于，所述的核酸編碼權利要求1所述的多肽。
6.—種表達載體,其特征在于,所述的表達載體包含權利要求5所述的核酸。
7.—種重組細胞，其特征在于，所述的重組細胞含有權利要求6所述的表達載體。
8.—種藥物組合物，其特征在于，其有效成分包含權利要求1所述的多肽、權利要求4所述的重組蛋白、權利要求5所述的核酸、權利要求6所述的表達載體或者權利要求7所述的重組細胞。
9.權利要求1所述的多肽在制備抗新型冠狀病毒HCoV-EMC2012感染藥物中的應用。
10.如權利要求 9所述的應用，其特征在于，將權利要求1所述的多肽加入可能受到新型冠狀病毒HCoV-EMC 2012感染的體外培養物。
【文檔編號】A61K48/00GK104072592SQ201310099025
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年3月26日 優先權日:2013年3月26日
【發明者】姜世勃, 陸路, 劉奇 申請人:復旦大學