一種腫瘤疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發明提供了一種腫瘤疫苗及其制備方法。從人外周血單核細胞中抽提mRNA，在體外合成cDNA，運用聚合酶鏈反應技術克隆了含有信號肽的粒巨細胞集落刺激因子cDNA，并與仙臺病毒載體進行重組，構建了含粒巨細胞集落刺激因子cDNA的重組仙臺病毒載體GM-CSF-SV。采用安全性較高的包裝細胞293T對含GM-CSF基因的仙臺病毒載體GM-CSF-SV進行包裝，產生出具有高滴度且不具有復制能力的重組仙臺病毒，感染人肺癌細胞株A549，建立了具有GM-CSF表達活性的基因工程人肺癌細胞，采用60Co照射滅活瘤苗并進行熱休克處理，在摸索了不同的照射劑量后，制備了GM-CSF基因修飾人肺癌細胞瘤苗。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域，更具體地，本發明提供了一種腫瘤疫苗及其制備方法。 一種腫瘤疫苗及其制備方法

【背景技術】
[0002] 肺癌是全世界發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。目前我國就診的肺癌患者大 多屬中晚期，手術切除率僅為60 %左右，術后5年生存率只有約50 %。作為手術、放療、化 療后腫瘤治療的第四種方法，生物治療在近年發展迅速。免疫治療是生物治療的主要組成 部分。腫瘤疫苗是腫瘤特異性的主動免疫治療，其誘導的機體特異性主動免疫應答，增強機 體抗腫瘤能力的作用在動物試驗中取得了肯定，許多腫瘤疫苗已進入臨床實驗研究，顯示 出良好的前景。
[0003] 肺癌細胞瘤苗是把肺癌細胞用放射線滅活后利用其抗原性誘導機體產生抗癌效 應。存在免疫原性弱、有致瘤性等缺點。降低、消除腫瘤細胞致瘤性，盡量保存其抗原性是 研究的重點。自體肺癌細胞瘤苗擁有自體特異的腫瘤抗原，比異體腫瘤細胞瘤苗安全有效， 但不適合廣泛臨床應用。異體腫瘤細胞瘤苗適合廣泛臨床應用，但免疫原性較弱，一般在制 備時添加免疫佐劑，如福氏佐劑，病毒，細菌，細胞因子及寡聚脫氧核苷酸等。有些腫瘤疫苗 的已進入臨床III期研究。希望在不久的將來，能看到某些腫瘤疫苗的標準治療方案問世。
[0004] 目前所開展的腫瘤基因治療中，以腫瘤免疫基因治療的研究為最多。腫瘤細胞靶 向的細胞因子基因治療是以主動免疫治療為基礎，即將細胞因子的持續分泌，從而激發機 體產生抗腫瘤免疫反應，達到治療腫瘤的目的。
[0005] GM-CSF (粒巨細胞集落刺激因子，granulocyte macrophage colony-stimulating factor)是一種主要由巨噬細胞和活化細胞產生的細胞因子，其可通過促進分化成熟樹突 狀細胞（dendritic cell，DC)、巨噬細胞等抗原呈遞細胞分化、成熟和活化進而促進Th、Tc、 NK識別腫瘤相關抗原，在腫瘤部位浸潤，引起系統性抗腫瘤反應，殺傷腫瘤的同時還可促進 細胞CD45 T細胞分化成熟及黏附分子B7/BB1的表達，提高其抗原呈遞能力。另外還可增 加巨噬細胞主要組織相容性復合物II (MHC II)的表達，提高其抗原呈遞能力。這些功能均 提示GM-CSF是一個極具潛力的免疫佐劑。
[0006] GM-CSF基因修飾的腫瘤細胞被放射線滅活后往體內注射，可增加局部炎性反應， 大量多核細胞、巨噬細胞和DC浸潤，促進腫瘤抗原呈遞，能夠誘導強烈的抗腫瘤免疫反應。


【發明內容】

[0007] 本發明提供了一種GM-CSF基因修飾的腫瘤疫苗及其制備方法。
[0008] 為解決上述技術問題，本發明的技術方案是：
[0009] 一種腫瘤疫苗及其制備方法，包括mRNA的抽提及CDNA的合成、PCR擴增GM-CSF基 因、GM-CSF cDNA的克隆、含GM-CSF重組仙臺病毒載體的組建、粒巨細胞集落刺激因子重組 仙臺病毒包裝細胞制備、人肺癌細胞株A549的感染，粒巨細胞集落刺激因子表達活性的基 因工程人肺癌細胞的建立及瘤苗的滅活。具體步驟為：用含粒巨細胞集落刺激因子的重組 仙臺病毒上清感染A549,得到粒巨細胞集落刺激因子基因修飾人肺癌細胞，應用6°Co照射 使其滅活并進行熱休克處理。該粒巨細胞集落刺激因子基因修飾人肺癌細胞瘤苗可以用于 治療肺癌。
[0010] 本發明的有益效果是：
[0011] 本項目使用的仙臺病毒載體表達蛋白質效率極高，大大超過了現有的各種載體。 作為新一代病毒載體，仙臺病毒載體開發了治療重癥肢體缺血、冠心病、癌癥等疾病的治療 制劑以及艾滋病疫苗。
[0012] 本發明使用仙臺病毒制備一種腫瘤疫苗及其制備方法，為癌癥的治療提供了一種 新的治療途徑。研究表明，粒巨細胞集落刺激因子基因修飾人肺癌細胞瘤苗治療腫瘤不僅 在一定程度上克服了以往臨床直接應用細胞因子需反復多次且副作用明顯的缺點，而且也 取得了較好的療效。

【具體實施方式】
[0013] 第一步：含信號肽的粒巨細胞集落刺激因子CDNA的制備。
[0014] 1.粒巨細胞集落刺激因子mRNA的制備：
[0015] (1)人外周血淋巴細胞分離液分離出單個核細胞，共約IX 106細胞，經誘導刺激 30小時，使細胞因子基因表達，以備抽提mRNA。
[0016] (2)mRNA的抽提：離心收集細胞，懸浮于L 5mlRNA抽提緩沖液，用注射器反復抽 打勻漿細胞，然后再補加3ml抽提緩沖液，充分混合，離心lOOOcpm 5分鐘，收集上清。取 Oligo(dT)-Cellulose Spun Column,混合內容物，350g離心兩分鐘，棄去柱內液體，取4ml 上清上柱，混勻，棄去液體。然后用高鹽緩沖液洗三遍，低鹽緩沖液洗二遍，最后用經65°C預 熱的洗脫緩沖液洗脫三次，每次用〇. 25ml，收集洗脫液，然后乙醇沉淀。
[0017] 2.粒巨細胞集落刺激因子cDNA的合成：
[0018] (1)引物的設計與合成：根據GenBank中人粒細胞一巨噬細胞集落刺激因子 (GM-CSF)基因序列設計一對引物，上游引物：上游：5' -GCTCAAGCTTCTGGAGGATGTGGCTGC-3 /(內含出11(1111位點）；下游 ：5/-66八〇6八八1'11^(^0：111^八丁66(：1^0：-3'。
[0019] ⑵cDNA的合成：將mRNA溶于20 μ 1 ddH20中，65°C 10分鐘，置于冰上備用。在 第一條鏈反應混合液內加入lmlDTT和熱變性的RNA，37°C保濕1小時，最后加1 μ 1 Klenow 酶，37°C 30分鐘，65°C 10分鐘后再用粉和氯仿抽提，經S印hacryl S-300柱純化后-20°C保 存。
[0020] 3. PCR擴增GM-CSF基因：取制備好的PBL cDNAlOy 1，加入Y和:T擴增引物 1μ 1、10X反應緩沖液5μ 1、(1ΝΤΡ4μ 1、加水至50μ 1，94°C 5分鐘變性。
[0021] 4.GM-CSF cDNA的克隆：為了鑒定PCR產物的準確性，須先將產物克隆入PUC18或 pBluescript DNA，經DNA序列測定確認為GM-CSF cDNA無誤后再將這一片段回收，并與表 達載體重組。故將PCR產物溶于TE，用適當的限制性內切酶水解后，與用同樣酶水解過的載 體DNA重組，轉化TG1后涂于LB/ΑΡ平板，37°C培養過夜。
[0022] 5.質粒DNA小量抽提：將一個單菌落介入含ΑΡ(50μ g/ml)的3ml LB中，37°C培 養過夜。將菌液轉移至1. 58ml離心管中，5000rpm離心2分鐘，沉淀菌體。用100 μ 1溶液 I懸浮菌體，再加200μ 1溶液II，溫和顛倒混勻，置于冰上，待溶液澄清后，加入150μ 1溶 液III，充分混勻。15000rpm 10分鐘離心，收集上清，用等體積苯酚/氯仿/異戊醇抽提一 次，加2. 5倍乙醇混勻，沉淀。離心15000rpml0分鐘，將沉淀用70%乙醇洗一次，水泵抽干， 最后溶于20 μ 1 TE，用200 μ g/ml RNase處理1小時，-20°C存放。
[0023] 6.質粒DNA的大量抽提：
[0024] (1)接種培養：將一個單菌落接種于3ml LB (含AP)中培養至對數晚期 (0D600 ~ 0. 6)，取500 μ 1接種入50ml含抗菌素的LB中，同樣培養至對數晚期，再取15ml 接種入含相應抗菌素的1. 5L LB中，培養過夜。
[0025] (2)質粒抽提：將1. 5L培養物離心5500rpm 10分鐘，收集菌體。用吸水紙將離心 管壁上殘余液體擦干。將菌體懸浮于30ml溶液I中，置室溫中10分鐘。加液體II60ml，混 合均勻后置冰上10分鐘。加溶液11145ml，置冰浴10分鐘后，15000rpm離心10分鐘。紗 布過濾后取上清，加等體積異丙醇沉淀，15000rpm離心10分鐘，用70 %乙醇洗一次，真空 干燥。將沉淀溶于20mlTE，加入等體積5M LiCl沉淀大分子RNA，在水浴中放置10分鐘， 4°C 15000rpm離心10分鐘，取上清，用等體積異丙醇沉淀。離心，干燥，溶于5mlTE，加入 RNase 至 200μ g/ml，37°C 30 分鐘。加等體積 13% PEG(8000)/1. 5M NaCl 沉淀 DNA，冰浴放 30分鐘。離心沉淀，干燥后用TE5ml溶解，用苯酚、苯酚/氯仿/異戊醇、氯仿/異戊醇各抽 提一次。最后加1/10體積3M NaAc及2倍乙醇沉淀。-20°C保存。用時再離心沉淀，溶于 TE〇
[0026] (3) CsCl超離心純化DNA :如上述堿法抽提的DNA，經LiCl純化后，用CsCl超速離 心，按lg/ml的用量，加入固體CsCl，30°C溶解。每lOmlDNA加入0· 8ml溴乙錠溶液（10mg/ ml)，CsC溶液的最終密度是1. 55g/ml，折射率1. 3860,溴化乙錠濃度約為704 μ g/ml。室 溫8000rpm5分鐘，浮在溶液上的是溴化乙錠和蛋白質形成的復合物。將浮渣下的清亮溶液 用注射器吸入用于超濾芯的離心管中，用輕石蠟油補滿其余部分，并封口。45000轉/分離 心24-48小時（20°C)。離心完畢，在普通光照下可見兩條DNA區帶，下部區帶由閉環質粒 DNA組成，用針頭插入此帶，吸出至1. 5ml管中，用等體積的經水飽和的正丁醇反復抽提，直 至粉紅色從水相和有機相中小時。將水相加3倍TE稀釋，加2. 5倍無水乙醇沉淀。離心后 用70%乙醇洗一次，抽干后溶于TE，-20°C保存。
[0027] 7.限制性內切酶反應：根據不同的限制性內切酶選擇相匹配的緩沖液。一般取 0. 5-1 μ g DNA，限制性內切酶5U，反應體積20μ 1，37°C保濕1-2小時，用1. 2%瓊脂糖凝膠 電泳（含溴化乙錠〇. 5-1 μ g/ml)鑒定酶切結果。
[0028] 8.凍融法回收酶切片段：在紫外燈下將DNA片段從瓊脂糖凝膠中切下來，加入 100μ 1 TE，在干冰：乙醇內凍結后置37°C 15分鐘，反復三次，15000rpm離心10分鐘后吸出 上清，加入1/10體積NaAc和2倍體積乙醇沉淀，離心收集，沉淀經水泵抽干后，溶于TE，即 可進行連接反應。
[0029] 9.DNA連接：將等克分子數的待連接DNA混合，加入5XT4連接酶緩沖液4μ 1，加 水至20μ 1，加入Τ4 DNA連接酶2U，12°C連接過夜，即可用于轉化。
[0030] 10.重組DNA的轉化：
[0031] (1)感受態細胞制備：將培養過夜的受體菌250 μ 1接種于50 μ 1LB中，37°C 1. 5-3 小時至對數中期，菌液至冰浴10分鐘，5000rpm離心5分鐘，沉淀菌體用1/2體積經預冷的 100mM MgCl2懸浮，冰浴20分鐘，4°C 5000rpm離心5分鐘，將菌體懸浮于1/15-1/10體積的 lOOmM CaCl2中，冰浴中放60分鐘，即可用于轉化。
[0032] (2)重組DNA的轉化：將連接過夜的DNA加入lOOul感受態細胞，混勻，冰浴中放 置40分鐘，間或輕輕混勻，42 °C 2分鐘，涂布于含抗菌素的LB平板上，37 °C培養過夜。
[0033] 10.雙鏈 DNA 測序：
[0034] (1)雙鏈變性：樣品DNA約1. 5-2ug，溶于8ulddH20后，加2MNa0H2ul，至室溫10分 鐘，加3ul3MNaAc中和，再加7ulddH20后，加60ul乙醇沉淀，離心1500rpml0分鐘，抽干后 溶于 10ulddH20。
[0035] (2)退火反應：10ul變性模板，加2ul引物，2ul退火緩沖液，65°C 5分鐘，緩慢冷 卻至室溫。
[0036] (3)延伸反應：將退火后的反應液加入lulddH20標記物3ul、T7聚合酶2ul (3U)、 和0. 5ul同位素 （α -32P)標記的dATP，室溫反應5分鐘。
[0037] (4)終止反應：取上述反應液4. 5ul至預先分裝好的4管分別標記有G、A、T、C的終 止混合物中（各2. 5ul)，混勻，37°C 5分鐘，加5ul終止液，在電泳上樣前樣品置75-80°C 2 分鐘變性。
[0038] 第二步：含GM-CSF重組仙臺病毒載體的組建。
[0039] 將用EcoRI和BamHI酶切，與經同樣酶切的GM-CSF相連接，重組載體經酶切鑒定 后有正確的插入片段，命名為GM-CSF-SV。
[0040] 第三步：產生含粒巨細胞集落刺激因子重組仙臺病毒的包裝細胞的建立。
[0041] 仙臺病毒載體是一種很有效的基因轉移系統。復制仙臺病毒載體經包裝細胞包 裝，可產生出高滴度的病毒顆粒，并能高效感染靶細胞，通過整合至宿主細胞基因而獲得長 期穩定表達。本研究采用安全性較高的包裝細胞293T對含GM-CSF基因的仙臺病毒載體 GM-CSF-SV進行包裝，產生出具有高滴度且不具有復制能力的重組仙臺病毒。
[0042] 1.病毒滴度測定
[0043] 病毒滴度測定一 NIN313/TK為指示靶細胞。1X105靶細胞培養1天后，加入經過稀 釋的含病毒上清液，并加入Polybrene (8 μ g/ml)。37°C，5 % C02培養3天后，更換培養液， 并加入G418(0. 5mg/ml)進行篩選。10-14天后可見抗G418細胞克隆形成，Giemsa染色后， 計算克隆數確定病毒滴度。
[0044] 2.病毒上清的保存
[0045] 選擇病毒滴度大于1 X 104CFU/ml的293T克隆進行擴增培養，收集24小時新鮮上 清，于-70°C凍存備用。
[0046] 第四步：粒巨細胞集落刺激因子基因修飾人肺癌細胞種子細胞庫的建立
[0047] L重組仙臺病毒感染：
[0048] 當細胞生產成80%融合時，加入GM-CSF-SV重組仙臺病毒上清（滴度1 X 106CFU/ ml)，并加入Polybrene至終濃度為8yg/ml，置37°C，5%C02培養24小時，按1 : 2或 1 : 4傳代后加入終濃度為0. 5mg/ml的G418,篩選培養約二周后，可見G418抗性細胞呈克 隆化生產。挑取單個克隆至24孔板中繼續擴增培養，建立克隆化細胞系。
[0049] 2.基因組DNA的抽提：
[0050] 分別將1X106腫瘤細胞用PBS洗二次，0.25%胰酶消化，800轉離心6分鐘，力口 0. 9ml細胞裂解液（STE20y 1，20% SDS 15μ 1，蛋白酶K10mg/ml)，37°C保溫過夜后，苯酚： 氯仿：異戊醇（25 : 24 : 1)抽提二次，氯仿：異戊醇24 : 1抽提一次，按1/10體積加入 5M NaCl，按2倍體積加入無水乙醇混勻后得DNA沉淀，70%乙醇洗一次后TE溶解備用。
[0051] 3.細胞總RNA抽提：
[0052] 按異硫氰酸胍-酚氯仿一步抽提法抽提細胞總RNA。分別取各種細胞IX 107， PBS洗二次，加 PBS lml后平分移入兩支1.5ml Eppendorf管中，1200rpm離心棄上清后， 細胞加溶液D500 μ 1迅速吸打使細胞裂解以抑制RNA酶活性。加50 μ 1 2M NaAc (pH4. 0)， 500 μ 1，DEPC H20飽和的新鮮重蒸酚，200 μ 1氯仿：異戊醇（49 : 1)，混勻后置冰浴15分 鐘，12000rpm離心15分鐘。吸出含RNA水相，加1倍體積異丙醇混勻，-20°C過夜。12000rpm 琉璃心15分鐘，沉淀家150 μ 1溶液D溶解后，加等體積異丙醇，-20°C放置1小時以上， 12000rpm離心15分鐘。沉淀用75%乙醇洗一次后用50 μ 1 DEPC水溶解，65°C水浴10分 鐘，-70°C凍存備用。
[0053] 4. PCR
[0054] 先94°C 5分鐘，接60°C 5分鐘，然后進行35個循環反應，最后72°C 10分鐘。反應 體系為 30μ 1(10X 反應緩沖液 3μ 1，5'及 3'引物各 1μ l(25pmol)，L 25mmol dNTP 2μ 1， 樣品DNA1 μ個，ddH20至30 μ 1)。反應結束后1. 5-2%凝膠水平或6% PAGE垂直凝膠電泳 鑒定。
[0055] 5. RT-PCR
[0056] 逆轉錄反應：取各細胞總RNA各5 μ 1 (1 μ g/ μ 1)，加入RNA酶抑制劑0. 5 μ 1，隨機 引物2μ 1，65°C 5分鐘后置冰浴上加入RNA酶抑制劑0·5μ l，5XRuffer4y 1，dNTP 7μ 1， Mo-MuLV逆轉錄酶1 μ 1后置37°C 1. 5小時。加入終止液后備用。
[0057] PCR反應：各取上述逆轉錄反應液2μ 1作為模板，按上述PCR方法進行擴增， β -actin引物作為內標準。
[0058] 6. Southern 印跡雜交
[0059] (l)DNA酶解：取各細胞基因組DNA各30yg，溶于17μ1水中，加2μ1 Sac I酶切 緩沖液（10倍），混勻后加入2 μ 1 Sac I (30U/ μ 1)，37°C保溫過夜。
[0060] ⑵電泳及轉移：上述酶解液5°C加2°C溴酚蘭上樣緩沖液后，上1 %瓊脂糖凝膠電 泳，70V、30mA電泳2-3小時。EB染色觀察是否酶解完全。如果酶解不完全，則再加入1 μ 1 Sac I繼續保溫2-3小時使其完全溶解。然后按上述條件進行電泳，電泳結束后膠浸泡于變 性液（1.5M NaCl，0.5M NaOH)中40分鐘，然后再中和液（1M Tris.Cl，1.5M NaCl)中浸泡 30分鐘。轉移至尼龍膜方法按分子克隆手冊進行。
[0061] (3)探針制備：以含細胞因子基因的逆轉率病毒載體質粒為模板，按上述PCR方法 制備 Neo 及 GM-CSF 的 DNA 探針，dNTP 用寶靈曼的 PCR DIG labeling mix (No. 1585550)替 代。雜交及檢測：采用寶曼靈公司推薦方法進行。
[0062] 7.粒巨細胞集落刺激因子基因修飾人肺癌細胞種子細胞凍存
[0063] 0. 25%胰酶消化粒巨細胞集落刺激因子基因修飾人肺癌細胞種子細胞后，移入 5ml培養液中，以800rpm離心5分鐘，將上清吸盡，按1 X 106細胞加 lml凍存液（含30 % 小牛血清及10% DMS0)，移入凍存管中。先放在4°C降溫30分鐘，然后移入氣態的液氮中繼 續降溫30分鐘，最后將凍存管放入液氮生物容器內的液氮保存。
[0064] 第五步：瘤苗的滅活
[0065] 1.細胞收集及洗滌
[0066] 常規擴增培養的粒巨細胞集落刺激因子基因修飾人肺癌細胞，用PBS洗滌兩次 后，以0. 25%胰酶消化，收集IX 108細胞至400ml離心瓶中，內含400ml pH7. 4無鈣、鎂磷酸 緩沖液（PBS)。以lOOOrpm離心10分鐘清晰，共清洗三次，最后將PBS上清吸盡，按1 X 107 細胞加 lml凍存液，移入凍存管中。
[0067] 2.6°Co照射粒巨細胞集落刺激因子基因修飾人肺癌細胞瘤苗癌細胞
[0068] 在6°Co治療儀（THERATRON 780-C)下，按40G、60G、100G輻射強度分別進行照射， 照射后的細胞命名為粒巨細胞集落刺激因子基因修飾人肺癌細胞瘤苗（A549/GM-CSF)。
[0069] 3. A549/GM-CSF 凍存
[0070] 先放在4°C降溫30分鐘，然后移入氣態的液氮中繼續降溫30分鐘，最后將凍存管 放入液氮生物容器內的液氮里保存。
[0071] 4.A549/GM-CSF細胞存活率測定
[0072] 將復蘇后的A549/GM-CSF，用5ml完全培養液懸浮。取4滴于載玻片上，用0. 1% 臺酚蘭（溶于0.9%生理鹽水）染色2-3分鐘，觀察結果。細胞中有深藍色顆粒浸潤即為死 亡細胞，透亮的則為活細胞。4滴樣品各隨機取視野計數100個細胞，將總細胞數X存活率 即得總活細胞數。
[0073] 第六步：瘤苗的熱休克
[0074] 將瘤苗放到65°C溫浴lh，熱休克處理人肺癌細胞瘤苗。
[0075] 本項目已將GM-CSF基因修飾過的A549肺癌細胞株作為實驗瘤苗，經證實其在體 內能持續分泌相應的細胞GM-CSF，提高機體的免疫原性，激活機體的免疫系統進行腫瘤殺 傷，預防腫瘤的復發及轉移。國外有類似藥物已進入II期臨床試驗，但國內尚無類似藥品 開發。本項目目前已經將編碼GM-CSF的基因克隆克隆于仙臺病毒載體SV/GM-CSF，用該載 體轉錄包裝細胞PA317,獲得病毒顆粒。用含GM-CSF基因的重組仙臺病毒轉導肺癌細胞株 (A549/-A2陽性），并進行分子生物學分析，確定轉導細胞能分泌GM-CSF。實驗瘤苗經 6°Co 照射后，轉導細胞尚能持續分泌細胞因子長達2?3周，但致瘤性消失，且不含仙臺病毒的 復制能力。主要用于肺癌手術后復發、轉移或不能手術且缺乏其它治療方法的晚期肺癌患 者。
[0076] 本生產工藝新穎、技術成熟。該工藝目前已經達到了國際先進水平、工藝簡單、易 于工業化、成本大大降低，適合中國的購買需求，產品上市后將填補國內市場的空白。
[0077] 具體實施例1
[0078] 選擇我國人群I類抗原頻率最多的A549肺癌細胞株為對象。采用GM-CSF-mRNA 的抽提及cDNA的合成、PCR擴增GM-CSF基因、GM-CSF cDNA的克隆、含GM-CSF重組仙臺病 毒載體的構建、GM-CSF重組仙臺病毒包裝細胞制備、人肺癌細胞株A549的感染、 6°Co治療儀 進行照射滅活腫瘤細胞等細胞生物學、分子生物學、病毒學等技術，獲得GM-CSF表達活性 的基因工程人肺癌細胞瘤苗，經常規擴增培養，將瘤苗放到42°C?65°C溫浴0. 5h?2h進 行熱處理，在6°Co治療儀進行照射滅活，照射后的細胞命名為GM-CSF基因工程人肺癌細胞 瘤苗（A549/GM-CSF)。
[0079] 具體實施例2
[0080] 粒巨細胞集落刺激因子基因修飾人肺癌細胞經不同劑量的6°Co輻射后在體外均 喪失了增殖能力，且隨著培養天數的增加，細胞存活率下降，活細胞數減少。如表2所示，輻 射一周后細胞的存活率為50%，且不同輻射劑量間無差異。經60G和100G照射的細胞，在培 養至第25天時細胞全部死亡。將上述三種劑量照射的基因工程人肺癌細胞（HG-UGM-CSF) 接種于裸鼠，均未產生腫瘤，說明致瘤性消失。
[0081] 表1粒巨細胞集落刺激因子基因修飾人肺癌細胞6°co照射后的存活率
[0082]

【權利要求】
1. 一種腫瘤疫苗及其制備方法，其特征在于：該肺癌細胞株為A549,用粒巨細胞集落 刺激因子基因修飾人肺癌細胞有如下步驟得到：用含粒巨細胞集落刺激因子的重組仙臺病 毒上清感染A549,得到粒巨細胞集落刺激因子基因修飾人肺癌細胞，應用 6°Co照射使其滅 活并進行熱休克處理。該粒巨細胞集落刺激因子基因修飾人肺癌細胞瘤苗可以用于治療肺 癌。
2. 如權利要求1所述，其特征在于：肺癌細胞株為A549。
3. 如權利要求1所述，其特征在于：應用6°Co照射使其滅活。
4. 如權利要求1所述，其特征在于：熱休克處理人肺癌細胞瘤苗，具體方法：將瘤苗放 到42°C?65°C溫浴0· 5h?2h。
5. 如權利要求1所述，其特征在于：該粒巨細胞集落刺激因子基因修飾人肺癌細胞瘤 苗可以用于治療肺癌。
【文檔編號】A61P35/00GK104117060SQ201310152227
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月28日 優先權日:2013年4月28日
【發明者】趙鋼, 閆貴芹, 崔國巍 申請人:天津美德佰泰醫學科技發展有限公司