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一種腫瘤細胞靶向性穿膜肽的制作方法

文檔序號:1254592閱讀:413來源:國知局
一種腫瘤細胞靶向性穿膜肽的制作方法
【專利摘要】本發明涉及生物【技術領域】,具體涉及一種腫瘤細胞靶向性穿膜肽、多核苷酸分子、用途以及含其的靶向給藥系統。本發明公開了一種腫瘤細胞靶向性穿膜肽,其特征在于其含有具有細胞穿膜肽活性的CPPs結構域和具有對腫瘤細胞特異性靶向親和的EGF第三環樣人工模擬肽結構域。本發明所述腫瘤細胞靶向性穿膜肽表現出了顯著的穿膜作用效果,同時具有細胞特異性和種屬特異性兩種新型特性,可用于腫瘤疾病的診斷、治療過程中所需藥物的開發應用。
【專利說明】一種腫瘤細胞靶向性穿膜肽

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】,具體涉及一種腫瘤細胞靶向性穿膜肽、多核苷酸分子、 用途以及含其的靶向給藥系統。

【背景技術】
[0002] 細胞膜由脂質雙分子層組成,其內部由疏水性的非極性分子構成。細胞膜是物質 進出細胞的一道屏障,許多生物大分子如多肽、蛋白質、DNA是不能自由跨越細胞膜進行物 質和信息傳遞的。這一屏障雖然對機體有保護作用,但也使許多有應用前景的藥物被摒棄。
[0003] 近年來,國外學者在對一些病毒轉染特性的研究中相繼發現了一類蛋白結構 域,如:人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV-1)的反式轉錄激活因 子(TAT)、果蠅艇角同源異形域(ANTP)、單純皰疹病毒I型VP22轉錄因子,不僅具有細 胞穿透能力,而且具有介導異源蛋白、寡聚核苷酸、脂質體等大分子直接透過細胞膜進入 細胞的功能,將其命名為細胞穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPPs)細,也被稱之 為蛋白轉導域(protein transduction domain,PTD),細胞穿膜膚(cell penetrating peptides,CPPs)又稱為蛋白轉導域或膜轉導肽,是一種由30個或者更少氨基酸組成的能 夠穿透細胞膜的多肽,能夠運載包括藥物在內的許多物質,共有的性質:1)具有凈正電荷 性和兩親性;2)穿膜轉運效率高;3)可以導入近乎所有的細胞;4)可以攜帶多種活性物 質進入細胞;5)可以通過固相合成或原核表達制備,方法成熟簡便。大量研究表明,CPPs 具有強大的運載潛能,CPPs攜帶的物質可以為蛋白質(綠色熒光蛋白、RNA酶、半乳糖苷酶 等)、多肽(100個氨基酸殘基以下)、DNA、化學小分子藥物、寡核苷酸(100bp以下)、反義 核酸、肽核酸、納米顆粒、熒光素、有機分子、腺病毒載體、成像物質、脂質體及鐵顆粒等,運 載能力可以達到120kDa(如半乳糖苷酶)、40nm(如鐵顆粒),沒有明顯的證據表明運載極 限。CPPs可以通過化學結合或基因融合等方式攜帶各種生物大分子。CPPs與藥物的連接 方式有兩種:非共價連接和共價連接。但CPPs這種非特異性地穿膜特征雖然體現了 CPPs 在體內應用上的廣泛性,但在實際應用過程中也將導致生物活性藥物給藥量的加大,藥物 治療效率的降低,不良反應增加的憂慮。因此,對CPPs穿膜轉運方式的改進不僅在臨床應 用上具有非常廣闊的應用前景,而且也具有巨大的經濟價值。
[0004] 大量研究證實,在大多數常見的腫瘤細胞表面都有表皮生長因子受體(EGFR)過 度表達或者突變。EGFR異常高表達的腫瘤包括乳腺癌、肺癌、胃癌、結直腸癌、胰腺癌、卵巢 癌、膀胱癌、腎癌、神經膠質瘤、鼻咽癌、頭頸部鱗狀細胞癌等(Salomon等,Crit Rev Oncol Hematol. 1995,19:183)。腫瘤細胞表面EGFR的過度表達以及腫瘤細胞的生長依賴于生長 因子的特點使得EGFR成為了目前腫瘤專一性治療研究的一大熱點。EGFR被作為識別腫瘤 細胞的專一'I"生導向祀標,大量用于腫瘤專一'I"生治療藥物的開發與研究(Seshacharyulu等, Expert Opin Ther Targets. 2012,16:15)。但由于正常人體細胞表面也存在有EGFR,這些 EGFR是正常細胞發揮其日常生理功能所必需。因此,雖然EGFR是一個非常適宜的腫瘤專一 性治療靶向物,但在利用其進行腫瘤治療靶向藥物的開發過程中,如何盡量避免其對正常 細胞的影響,減少藥物不良反應的發生,穩定發揮和提高藥物的療效是廣大藥物開發研究 人員必須考慮和面對的問題。
[0005] 研究發現,在自然界人體中,EGFR除了與動物本人自身分泌的EGF等生長因子能 與其EGFR專一性結合發揮作用外,人體分泌的許多其它生長因子,甚至包括一些由病毒分 泌的生長因子由于其空間結構的某一部分與動物來源的生長因子類似,也能與EGFR進行不 同程度的結合,誘導相應的生物學效應。這些生長因子包括人轉化生長因子-a (hTGF- α ), 人表皮調節素(hEPR),人β細胞素(hBTC),二性調節素(Amphiregulin),肝素結合EGF樣 生長因子(HB-EGF),Heregulin,Betacelluin等等。病毒來源的有如痘苗病毒生長因子 (VGF),Shope纖維瘤病毒生長因子(SVGF),粘液瘤病毒生長因子(MVGF)等。通過對此類生 長因子的序列比對研究發現,能與EGFR結合的EGF類多肽具有類似的結構和功能,分子內 都有6個Cys殘基,可形成3個二硫鍵,并將50-90個左右的氨基酸肽鏈折疊成三環結構 (見圖1A,引自Cell, Vol. 110, 775 - 787, S印tember20, 2002),并共同具有絲裂原功能,在 TGF- β存在的條件下可引起細胞轉化,在軟瓊脂錨著實驗中可形成細胞集落,這類TGF- α 和病毒生長因子多肽被稱之為EGF樣多肽。后續研究表明,EGF樣多肽中三環結構是其生物 活性所必須的。以EGF為例,A環的R41殘基在Site2處,B環的K28、C31、N32、C33殘基在 Sitel 處,C 環的 Q43、R45、L47 殘基在 Site3 處分別與 EGFR 上 Domain I 與 Domain III 部位 的3個不同部位專一性結合(見圖1B,引自Cell, Vol. 110, 775 - 787, S印tember20, 2002)。 在這其中,EGF的第三環(C環)上的氨基酸殘基更是插入到EGFR結合位點的深處發揮作用 (Ogiso等,Cell,2002,110:775)。EGF和EGF樣多肽在一級結構某些固定部位的氨基酸殘 基是非常保守的,為維持其生物活性所必需,它們起到維持空間構象和提供氫鍵和非極性 疏水結合的作用。這些保守氨基酸任何缺失或大段缺失突變,都會導致這些生長因子與其 受體結合活性的降低或完全喪失,從而影響其生物學功能。


【發明內容】

[0006] 本發明所要解決的技術問題為提供一種腫瘤細胞靶向性穿膜肽,以提高治療藥物 的藥理作用效果,盡量減少對正常細胞的影響,減輕藥物不良反應的發生。
[0007] 為此,本發明一方面公開了一種新型腫瘤細胞靶向性穿膜肽,其特征在于其含有 具有細胞穿膜肽活性的CPPs結構域和EGF第三環樣人工模擬肽結構域。
[0008] 本發明的發明思路為將EGF第三環樣模擬肽氨基酸殘基序列與細胞穿膜肽序列 融合構成一種新型靶向型細胞穿膜肽,通過EGF第三環樣模擬肽結構域能與腫瘤細胞表面 表達豐富的EGFR專一性結合的特性,實現新型細胞穿膜肽在體內運輸的腫瘤靶向性,從而 發揮穿膜肽的專一性靶向轉運作用,將藥物分子在體內進行專一性的靶向投送傳遞進入腫 瘤細胞,達到控制腫瘤細胞生長,減少對正常細胞的不良影響的治療疾病的目的。
[0009] 本發明通過對EGF與EGFR受體結合立體3D模型的分析,特別是我們認為對在 EGF與EGFR結合過程中影響作用貢獻最大的第三環(C環)的結構進行分析研究,結合 對各種EGF樣多肽的氨基酸殘基一級結構序列進行結構比對分析的結果(Sato等,FEBS Letters. 2003, 553:232 ;McFadden 等,D01:10. 1006/rwcy. 2000. 03014),采用人工設計的 方式,構建模擬EGF第三環與EGFR結合區域的人工模擬肽(簡稱S3模擬肽),將其作為專一 性識別腫瘤細胞的靶向序列,其與CPPs融合構成靶向穿膜肽,構建成一種能夠專一性優先 定向結合到腫瘤細胞表面并實施穿膜運輸的新型靶向型穿膜肽,用于腫瘤疾病的診斷、治 療過程中所需藥物的開發應用。
[0010] 在一實施方式中,所述腫瘤細胞靶向性穿膜肽具有下式:R1-L-R2或R2-L-R1,其 中L是連接肽(模型結構示意圖見圖2),連接肽優選為卷曲連接肽,包括例如:
[0011] (GGGGS)N或(GGGS)N或(GGS)N或(EFGG) N或(VDGG)N,其中N是大于或等于1的 整數;
[0012] R1為EGF第三環樣人工模擬肽的氨基酸序列,其氨基酸序列如XaalC -^aa3-^aa4-^aa5^-^aa7-^aa8-^aa9^^ -^aal2-^aal3-^aal4-^aal5^
[0013] Xaal :1?、¥、1、隊6、1(、¥中之一,優選為1?;
[0014] Xaa3 :S、H、R、D、E、Q、V、G 中之一,優選為 S ;
[0015] Xaa4 :H、I、S、E、V、A、V 中之一,優選為 Η;
[0016] Xaa5 :G、S、V、A、Υ 中之一,優選為 G 或 S ;
[0017] Xaa7 :T、V、I、S、D 中之一,優選為 T ;
[0018] Xaa8 :G、S、A 中之一,優選為 G 或 S ;
[0019] Xaa9 :I、S、A、V、E、D 中之一,優選為 I ;
[0020] Xaal2 :Q、E、R、H、K 中之一,優選為 Q ;
[0021] Xaal3 :H、I、Y、R、E、G、A、L 中之一,優選為 H、A、L或 I ;
[0022] Xaal4 :V、F、R、A 中之一,優選為 V ;
[0023] Xaal5 :D、F、V、S 中之一,優選為 V ;
[0024] R2為細胞穿膜肽的氨基酸序列。
[0025] 在一實施方式中,所述R1的氨基酸序列包括但不局限于表1所示序列如SEQ ID NO. 1-20 所示。
[0026] 表1人工合成的部分S3模擬肽系列序列
[0027]

【權利要求】
1. 一種腫瘤細胞靶向性穿膜肽,其特征在于其含有具有細胞穿膜肽活性的CPPs結構 域和具有對腫瘤細胞特異性靶向親和的EGF第三環樣人工模擬肽結構域。
2. 如權利要求1所述的腫瘤細胞靶向性穿膜肽,其特征在于所述腫瘤細胞靶向穿膜肽 具有下式:R1-L-R2或R2-L-R1,其中L是卷曲型連接肽; R1為EGF第三環樣人工模擬肽結構域,其氨基酸序列如XaalC Xaa3Xaa4Xaa5Y Xaa7Xaa8Xaa9RC -^aal2-^aal3-^aal4-^aal5^ Xaal :R、V、I、N、G、K、L 中之一; Xaa3 :S、H、R、D、E、Q、V、G 中之一; Xaa4 :H、I、S、E、K、Q、P、V、N 中之一; Xaa5 :G、N、V、A、L、I 中之一; Xaa7 :T、V、F、I、H、S、D 中之一; Xaa8:G、S、A 中之一; Xaa9 :I、S、A、V、E、D 中之一; Xaal2 :Q、E、T、H、K 中之一; Xaal3 :H、T、Y、R、E、G、A、L 中之一; Xaal4 :V、F、R、A 中之一; Xaal5:D、F、V、S 中之一; R2為具有細胞穿膜肽活性的CPPs結構域。
3. 如權利要求1或2中所述的腫瘤細胞靶向性穿膜肽,其特征在于所述R1氨基酸序列 如 SEQ ID NO. 1-20 所示。
4. 如權利要求1或2中所述的腫瘤細胞靶向性穿膜肽,其特征在于所述CPPs結 構域為人免疫缺陷病毒轉錄激活因子TAT,單純皰疹病毒I型VP22轉錄因子,果蠅同 源觸角蛋白的 Penetratin,Transportan,ARF,BagP,CytC,hCT,hLF,hClock,TCTP, MPG,MAP, Pep-1, SynBl, Polyomavirus Vpl, Bac, NF-KB, SV40T antigen, HATF3, hCT, pVEC, Integrin, DPV6, S413PV, Poly-P,EC-SOD羧基末端肝素結合域中的一種。
5. 如權利要求1所述的腫瘤細胞靶向性穿膜肽,其特征在于所述腫瘤細胞靶向穿膜肽 為其氨基酸序列如SEQ ID NO. 21-27中之一所示的肽。
6. -種靶向選擇性的給藥系統,其特征在于其由權利要求1所述腫瘤細胞靶向性穿膜 肽與抗癌藥物或示蹤劑或生物活性物質或載體連接組成。
7. 如權利要求6所述的給藥系統,其特征在于所述給藥系統為權利要求1所述所述腫 瘤細胞靶向性穿膜肽序列通過連接肽共價連接凋亡素蛋白形成融合蛋白形成的給藥系統。
8. 如權利要求7所述的給藥系統,其特征在于所述融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO. 28-32中之一所示。
9. 如權利要求6所述的給藥系統,其特征在于所述抗癌藥物為阿霉素、紫杉醇、多西紫 杉醇、絲裂霉素、柔紅霉素、順鉬、卡鉬、喜樹堿、羥基喜樹堿、長春新堿、博萊霉素、5-氟尿嘧 啶、環磷酞胺、吉西他濱、甲氨蝶吟、卡培他濱、洛莫司汀、依托泊苷中之一。
10. 權利要求1所述腫瘤細胞靶向性穿膜肽在制備腫瘤細胞靶向性物質中應用。
【文檔編號】A61P35/00GK104140457SQ201310170530
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2013年5月8日 優先權日:2013年5月8日
【發明者】趙健, 王富軍, 傅云龍, 張濤鑄, 單含文, 任偉揚, 謝先文 申請人:浙江日升昌藥業有限公司
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