一種具有免疫抑制活性的桂皮多酚提取物及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有免疫抑制活性的桂皮多酚提取物及其制備方法和應用。所述提取物是來源于天竺桂、柴桂、油桂中的至少一種樹皮的提取物，所述提取物中的總多酚含量達50wt%以上。本發明所述的桂皮多酚提取物的半數細胞致死濃度＞50μg/mL，且對絲裂原ConA誘導的淋巴細胞的增殖及參與免疫調節和炎癥反應的重要細胞因子IL-6、IFN-γ的分泌均具有濃度依賴性的抑制作用，可望作為活性成分之一或唯一的活性成分用于制備治療免疫性疾病的藥物制劑，尤其可望作為活性成分之一或唯一的活性成分用于制備治療類風濕性關節炎的藥物制劑，具有藥用價值。
【專利說明】一種具有免疫抑制活性的桂皮多酚提取物及其制備方法和 應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種桂皮多酚提取物及其制備方法和應用，具體說，是涉及一種具有 免疫抑制活性的桂皮多酚提取物及其制備方法和應用，屬于中藥【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 類風濕性關節炎（RA)是當前危害人類健康的最重要疾病之一，被稱為"不死的癌 癥"。RA是一種以多關節受累、滑膜炎癥、骨與軟骨破壞等為主要特征的慢性全身性自身免 疫炎性疾病，其發病機理至今尚未完全闡明，普遍認為與遺傳、感染和免疫調節等因素紊亂 密切相關。我國RA的患病率約0. 3%?0. 4%，約有400萬患者，病程5-10年致殘率為60%， 晚期90%患者喪失社會勞動力和生活自理能力，是成人勞動力喪失的主要原因之一，因此 造成了很多家庭問題以及巨大的社會負擔。現行治療類風濕性關節炎的方法主要有手術治 療、化學藥物治療和細胞因子類生物制劑的治療。一般認為外科手術只適用于晚期畸形病 例，且費用昂貴，對機體創傷較大；化學藥物如非留體抗炎藥、抗風濕藥和糖皮質激素等的 長期應用會引起胃腸道不適、骨髓抑制、肝損傷、高血壓等嚴重的不良反應；生物制劑在干 預病變細胞的同時，對正常細胞也同樣會產生一定的作用，干擾機體的固有免疫和適應性 免疫，從而產生較大的毒性和破壞機體防御作用的風險。因此，尋求高效低毒的防治RA的 藥物仍是世界醫學界面臨的一項艱巨任務和難題。
[0003] 桂皮為樟科樟屬植物肉桂、柴桂、天竺桂、錫蘭桂、油桂等樹皮的通稱，為常用中 藥，又為食品香料或烹飪調料。商品桂皮的原植物比較復雜，約有十余種。研究表明（上海 中醫藥雜志，2011年第45卷第5期第82?86頁):不同種類桂皮的化學成分存在一定的差 異性，例如：肉桂中的總多酚含量為1. 31%，而柴桂中的總多酚含量為1. 92%。雖然李堯華等 報道（四川中醫雜志，1989, 2 :28):用肉桂25g+綠豆200g+陳石灰適量治療類風濕性關節炎 40例，顯效34例，有效6例；但是對其作用機制還不明確，其發揮藥效的物質基礎也尚未弄 清。
【發明內容】
[0004] 針對現有技術存在的上述問題，本發明的目的是提供一種具有免疫抑制活性的桂 皮多酚提取物及其制備方法和應用。
[0005] 本發明所述的具有免疫抑制活性的桂皮多酚提取物，是來源于天竺桂、柴桂、油桂 中的至少一種樹皮的提取物，所述提取物中的總多酚含量達50wt%以上。
[0006] 進一步說，所述提取物中的總多酚含量達70wt%?90wt%。
[0007] 本發明所述提取物的制備方法，包括如下步驟：
[0008] a)用乙醇水溶液或丙酮水溶液對天竺桂、柴桂、油桂中的至少一種樹皮藥材進行 提取；
[0009] b)減壓蒸餾除去提取液中的乙醇或丙酮，然后加適量水稀釋濃縮液，得粗提液；
[0010] c)用乙酸乙酯萃取粗提液2?6次，合并萃取得到的乙酸乙酯層，減壓蒸餾除去其 中的乙酸乙酯，得到乙酸乙酯部位；
[0011] d)將乙酸乙酯部位用少量甲醇或者乙醇溶解后加水稀釋并上樣于DM130大孔樹 脂柱，依次用3?5柱體積水、3?5柱體積lOvol%乙醇水溶液、3?5柱體積35vol%乙醇 水溶液和3?5柱體積70vol%乙醇水溶液洗脫，收集35vol%的乙醇流分，減壓濃縮，干燥， 即得所述的提取物。
[0012] 步驟a)中所述的提取可以是冷浸提取、溫浸提取或回流提取。
[0013] 步驟a)中所述的提取可以為1?3次；每次提取時，1克樹皮藥材使用5?50毫 升的乙醇水溶液或丙酮水溶液。
[0014] 上述的乙醇水溶液和丙酮水溶液的體積百分比濃度均優選為20%?70%。
[0015] 步驟c)中的萃取，每次用于萃取的乙酸乙酯的體積推薦為被萃取的粗提液體積 的0. 5?1. 5倍。
[0016] 步驟d)中所述的干燥優選為真空干燥或冷凍干燥。
[0017] 研究表明：本發明所述的桂皮多酚提取物的半數細胞致死濃度（CC50) >50 μ g/ mL，且對絲裂原ConA誘導的淋巴細胞的增殖及參與免疫調節和炎癥反應的重要細胞因子 IL-6、IFN- γ的分泌均具有濃度依賴性的抑制作用,可望作為活性成分之一或唯一的活性 成分用于制備治療免疫性疾病的藥物制劑，尤其可望作為活性成分之一或唯一的活性成分 用于制備治療類風濕性關節炎的藥物制劑。
[0018] 本發明中所述的藥物制劑形式是任何可藥用的口服劑型或注射劑，包括：片劑、糖 衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖 齊IJ、丸劑、散劑、注射液、粉針劑等。
【具體實施方式】
[0019] 下面結合實施例對本發明作進一步詳細、完整地說明，但并不因此限制本發明；本 領域的技術人員根據下述內容所作的一些非本質的改進或替換均屬于本發明的保護范圍。
[0020] 實施例中所用的天竺桂樹皮藥材產自江西上饒，實施例中所用的柴桂和油桂樹皮 藥材均產自云南。實施例中關于提取物中的總多酚含量的測定是參照文獻"上海中醫藥雜 志，2011年第45卷第5期第83頁"中所述方法。
[0021] 實施例1
[0022] a)在40°C用體積濃度為50%的丙酮水溶液對天竺桂樹皮藥材進行溫浸提取1次， 其中：1克天竺桂樹皮藥材用50毫升丙酮水溶液；
[0023] b)減壓蒸餾除去提取液中的丙酮，然后加適量水稀釋濃縮液，得粗提液；
[0024] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的體積為被萃取的粗提液體 積的1倍，共萃取3次；合并萃取得到的乙酸乙酯層，減壓蒸餾除去其中的乙酸乙酯，得到乙 酸乙酯部位；
[0025] d)將得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀釋并上樣于DM130大孔樹脂 柱，依次用4柱體積水、4柱體積lOvol%乙醇水溶液、4柱體積35vol%乙醇水溶液和4柱體 積70vol%乙醇水溶液洗脫，收集35vol%的乙醇流分，減壓濃縮，冷凍干燥，即得本發明所述 的提取物。
[0026] 經測定分析，本實施例制得的提取物中，總多酚的含量為76wt%。
[0027] 實施例2
[0028] a)在室溫下，用體積濃度為50%的丙酮水溶液對天竺桂樹皮藥材進行攪拌提取2 次，其中：1克天竺桂樹皮藥材用25毫升丙酮水溶液；
[0029] b)減壓蒸餾除去提取液中的丙酮，然后加適量水稀釋濃縮液，得粗提液；
[0030] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的體積為被萃取的粗提液體 積的1倍，共萃取5次；合并萃取得到的乙酸乙酯層，減壓蒸餾除去其中的乙酸乙酯，得到乙 酸乙酯部位；
[0031] d)將得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀釋并上樣于DM130大孔樹脂 柱，依次用4柱體積水、4柱體積lOvol%乙醇水溶液、4柱體積35vol%乙醇水溶液和4柱體 積70vol%乙醇水溶液洗脫，收集35vol%的乙醇流分，減壓濃縮，冷凍干燥，即得本發明所述 的提取物。
[0032] 經測定分析，本實施例制得的提取物中，總多酚的含量為72wt%。
[0033] 實施例3
[0034] a)在40°C用體積濃度為20%的丙酮水溶液對柴桂樹皮藥材進行溫浸提取2次，其 中：1克柴桂樹皮藥材用25毫升丙酮水溶液；
[0035] b)減壓蒸餾除去提取液中的丙酮，然后加適量水稀釋濃縮液，得粗提液；
[0036] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的體積為被萃取的粗提液體 積的1.5倍，共萃取2次；合并萃取得到的乙酸乙酯層，減壓蒸餾除去其中的乙酸乙酯，得到 乙酸乙酯部位；
[0037] d)將得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀釋并上樣于DM130大孔樹脂 柱，依次用4柱體積水、4柱體積lOvol%乙醇水溶液、4柱體積35vol%乙醇水溶液和4柱體 積70vol%乙醇水溶液洗脫，收集35vol%的乙醇流分，減壓濃縮，冷凍干燥，即得本發明所述 的提取物。
[0038] 經測定分析，本實施例制得的提取物中，總多酚的含量為70wt%。
[0039] 實施例4
[0040] a)用體積濃度為20%的丙酮水溶液對柴桂樹皮藥材進行回流提取1次，其中：1克 柴桂樹皮藥材用50毫升丙酮水溶液；
[0041] b)減壓蒸餾除去提取液中的丙酮，然后加適量水稀釋濃縮液，得粗提液；
[0042] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的體積為被萃取的粗提液體 積的1倍，共萃取3次；合并萃取得到的乙酸乙酯層，減壓蒸餾除去其中的乙酸乙酯，得到乙 酸乙酯部位；
[0043] d)將得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀釋并上樣于DM130大孔樹脂 柱，依次用5柱體積水、5柱體積lOvol%乙醇水溶液、5柱體積35vol%乙醇水溶液和5柱體 積70vol%乙醇水溶液洗脫，收集35vol%的乙醇流分，減壓濃縮，冷凍干燥，即得本發明所述 的提取物。
[0044] 經測定分析，本實施例制得的提取物中，總多酚的含量為70wt%。
[0045] 實施例5
[0046] a)在室溫下，用體積濃度為70%的乙醇水溶液對柴桂樹皮藥材進行攪拌提取1次， 其中：1克柴桂樹皮藥材用50毫升乙醇水溶液；
[0047] b)減壓蒸餾除去提取液中的乙醇，然后加適量水稀釋濃縮液，得粗提液；
[0048] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的體積為被萃取的粗提液體 積的1倍，共萃取3次；合并萃取得到的乙酸乙酯層，減壓蒸餾除去其中的乙酸乙酯，得到乙 酸乙酯部位；
[0049] d)將得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀釋并上樣于DM130大孔樹脂 柱，依次用5柱體積水、5柱體積lOvol%乙醇水溶液、5柱體積35vol%乙醇水溶液和5柱體 積70vol%乙醇水溶液洗脫，收集35vol%的乙醇流分，減壓濃縮，冷凍干燥，即得本發明所述 的提取物。
[0050] 經測定分析，本實施例制得的提取物中，總多酚的含量為78wt%。
[0051] 實施例6
[0052] a)在室溫下，用體積濃度為50%的乙醇水溶液對油桂樹皮藥材進行攪拌提取2次， 其中：1克油桂樹皮藥材用25毫升乙醇水溶液；
[0053] b)減壓蒸餾除去提取液中的乙醇，然后加適量水稀釋濃縮液，得粗提液；
[0054] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的體積為被萃取的粗提液體 積的1倍，共萃取5次；合并萃取得到的乙酸乙酯層，減壓蒸餾除去其中的乙酸乙酯，得到乙 酸乙酯部位；
[0055] d)將得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀釋并上樣于DM130大孔樹脂 柱，依次用3柱體積水、3柱體積lOvol%乙醇水溶液、3柱體積35vol%乙醇水溶液和3柱體 積70vol%乙醇水溶液洗脫，收集35vol%的乙醇流分，減壓濃縮，冷凍干燥，即得本發明所述 的提取物。
[0056] 經測定分析，本實施例制得的提取物中，總多酚的含量為81wt%。
[0057] 實施例7
[0058] a)用體積濃度為20%的乙醇水溶液對油桂樹皮藥材進行回流提取3次，其中：1克 油桂樹皮藥材用10毫升乙醇水溶液；
[0059] b)減壓蒸餾除去提取液中的乙醇，然后加適量水稀釋濃縮液，得粗提液；
[0060] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的體積為被萃取的粗提液體 積的〇. 5倍，共萃取6次；合并萃取得到的乙酸乙酯層，減壓蒸餾除去其中的乙酸乙酯，得到 乙酸乙酯部位；
[0061] d)將得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀釋并上樣于DM130大孔樹脂 柱，依次用3柱體積水、3柱體積lOvol%乙醇水溶液、3柱體積35vol%乙醇水溶液和3柱體 積70vol%乙醇水溶液洗脫，收集35vol%的乙醇流分，減壓濃縮，冷凍干燥，即得本發明所述 的提取物。
[0062] 經測定分析，本實施例制得的提取物中，總多酚的含量為71wt%。
[0063] 實施例8
[0064] a)在40°C下，用體積濃度為70%的乙醇水溶液對油桂樹皮藥材進行溫浸提取2 次，其中：1克油桂樹皮藥材用25毫升乙醇水溶液；
[0065] b)減壓蒸餾除去提取液中的乙醇，然后加適量水稀釋濃縮液，得粗提液；
[0066] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的體積為被萃取的粗提液體 積的1倍，共萃取4次；合并萃取得到的乙酸乙酯層，減壓蒸餾除去其中的乙酸乙酯，得到乙 酸乙酯部位；
[0067] d)將得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀釋并上樣于DM130大孔樹脂 柱，依次用3柱體積水、3柱體積lOvol%乙醇水溶液、3柱體積35vol%乙醇水溶液和3柱體 積70vol%乙醇水溶液洗脫，收集35vol%的乙醇流分，減壓濃縮，冷凍干燥，即得本發明所述 的提取物。
[0068] 經測定分析，本實施例制得的提取物中，總多酚的含量為76wt%。
[0069] 實施例9
[0070] a)用體積濃度為70%的乙醇水溶液對油桂樹皮藥材進行回流提取1次，其中：1克 油桂樹皮藥材用50毫升乙醇水溶液；
[0071] b)減壓蒸餾除去提取液中的乙醇，然后加適量水稀釋濃縮液，得粗提液；
[0072] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的體積為被萃取的粗提液體 積的1倍，共萃取6次；合并萃取得到的乙酸乙酯層，減壓蒸餾除去其中的乙酸乙酯，得到乙 酸乙酯部位；
[0073] d)將得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀釋并上樣于DM130大孔樹脂 柱，依次用3柱體積水、3柱體積lOvol%乙醇水溶液、4柱體積35vol%乙醇水溶液和4柱體 積70vol%乙醇水溶液洗脫，收集35vol%的乙醇流分，減壓濃縮，冷凍干燥，即得本發明所述 的提取物。
[0074] 經測定分析，本實施例制得的提取物中，總多酚的含量為78wt%。
[0075] 實施例10
[0076] a)在40°C下，用體積濃度為50%的丙酮水溶液對油桂樹皮藥材進行溫浸提取2 次，其中：1克油桂樹皮藥材用30毫升丙酮水溶液；
[0077] b)減壓蒸餾除去提取液中的丙酮，然后加適量水稀釋濃縮液，得粗提液；
[0078] c)用乙酸乙酯萃取粗提液，每次萃取所用的乙酸乙酯的體積為被萃取的粗提液體 積的1倍，共萃取4次；合并萃取得到的乙酸乙酯層，減壓蒸餾除去其中的乙酸乙酯，得到乙 酸乙酯部位；
[0079] d)將得到的乙酸乙酯部位用少量乙醇溶解后加水稀釋并上樣于DM130大孔樹脂 柱，依次用3柱體積水、3柱體積lOvol%乙醇水溶液、3柱體積35vol%乙醇水溶液和3柱體 積70vol%乙醇水溶液洗脫，收集35vol%的乙醇流分，減壓濃縮，冷凍干燥，即得本發明所述 的提取物。
[0080] 經測定分析，本實施例制得的提取物中，總多酚的含量為73wt%。
[0081] 實施例11
[0082] 用MTT法檢測本發明所述的桂皮多酚提取物的細胞毒性：
[0083] 樣品組：用RPMI-1640培養液對實施例2、5、6、10所制備的提取物分別配制成濃度 為 12. 5 μ g/mL、25 μ g/mL 及 50 μ g/mL 的溶液；
[0084] 對照組：RPMI-1640培養液；
[0085] 將BALB/c小鼠脾淋巴細胞（4X IO5個/孔)與各實驗組樣品分別共培養48h，在培 養結束前4h加入MTT溶液（5mg/mL)。培養結束后，吸去培養上清150 μ 1，再加150 μ I DMSO 溶解甲臜顆粒，低速搖床l〇min，用酶標儀于570nm處讀取OD值。
[0086] 檢測各實驗組的細胞活性值（0D值)，詳細檢測結果見表1所示。
[0087] 表1各實驗組在作用48h后所測的細胞OD值（Xrhi, ;2=5)
[0088]
【權利要求】
1. 一種具有免疫抑制活性的桂皮多酚提取物，其特征在于：是來源于天竺桂、柴桂、油 桂中的至少一種樹皮的提取物，所述提取物中的總多酚含量達50wt%以上。
2. 如權利要求1所述的桂皮多酚提取物，其特征在于：所述提取物中的總多酚含量達 70wt% ?90wt%。
3. -種權利要求1所述的桂皮多酚提取物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： a) 用乙醇水溶液或丙酮水溶液對天竺桂、柴桂、油桂中的至少一種樹皮藥材進行提 取； b) 減壓蒸餾除去提取液中的乙醇或丙酮，然后加適量水稀釋濃縮液，得粗提液； c) 用乙酸乙酯萃取粗提液2?6次，合并萃取得到的乙酸乙酯層，減壓蒸餾除去其中的 乙酸乙酯，得到乙酸乙酯部位； d) 將乙酸乙酯部位用少量甲醇或者乙醇溶解后加水稀釋并上樣于DM130大孔樹脂柱， 依次用3?5柱體積水、3?5柱體積lOvol%乙醇水溶液、3?5柱體積35vol%乙醇水溶 液和3?5柱體積70vol%乙醇水溶液洗脫，收集35vol%的乙醇流分，減壓濃縮，干燥，即得 所述的提取物。
4. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟a)中所述的提取為冷浸提取、溫 浸提取或回流提取。
5. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟a)中所述的提取為1?3次；每 次提取時，1克樹皮藥材使用5?50毫升的乙醇水溶液或丙酮水溶液。
6. 如權利要求3或5所述的制備方法，其特征在于：所述的乙醇水溶液和丙酮水溶液 的體積百分比濃度均為20%?70%。
7. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟c)中的萃取，每次用于萃取的乙 酸乙酯的體積為被萃取的粗提液體積的0. 5?1. 5倍。
8. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟d)中所述的干燥為真空干燥或冷 凍干燥。
9. 一種權利要求1或2所述的桂皮多酚提取物的應用，其特征在于：以所述提取物作 為活性成分之一或唯一的活性成分用于制備治療免疫性疾病的藥物制劑。
10. 如權利要求9所述的應用，其特征在于：以所述提取物作為活性成分之一或唯一的 活性成分用于制備治療類風濕性關節炎的藥物制劑。
【文檔編號】A61P19/02GK104274528SQ201310273225
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月2日 優先權日:2013年7月2日
【發明者】李醫明, 楊以阜, 賈琦, 陳亮, 楊揚 申請人:上海中醫藥大學