擴張型心肌病斑馬魚疾病模型的建立與應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及擴張型心肌病斑馬魚疾病模型的建立與應用。首次構建了一種模擬人類擴張型先天性心肌病(Congenital Dilated CardioMyopathy，CDCM)的疾病模型，所述的疾病模型可作為篩藥模型，應用于篩選可改善CDCM所致心力衰竭癥狀藥物。本發明的方法是一種經濟快捷的高內涵篩選方法，得到的化合物具較高的特異性和成藥性。
【專利說明】擴張型心肌病斑馬魚疾病模型的建立與應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫藥【技術領域】，更具體地，本發明涉及一種肌小節缺陷致擴張型心肌 病的斑馬魚模型的建立及其應用。

【背景技術】
[0002] 擴張型先天性心肌病（Congenital Dilated CardioMyopathy，CDCM)是一類主要 的先天心肌病，臨床表現為左心室或者雙側心室擴張，伴隨正性肌力下降。兒童預后五年內 致死率達80%，幸存者也會患有后遺疾病或需心臟移植。成人中先天性基因變異所致DCM外 顯率在40歲后達95%，死亡率仍然很高（發病后平均存活時間男性1. 7年，女性3. 2年）， 其致殘致畸率在各種疾病及綜合征內也居于首位。
[0003] 心肌細胞肌小節缺陷是⑶CM主要的發病原因之一。Titin(TTN)是組裝肌小節和 紋狀肌的必要蛋白，提供正性肌力，調節收縮壓。TTN蛋白是人類蛋白組中最大的一個，它 含有大約33,000個氨基酸，是含量第三大的紋狀肌蛋白。生理狀態下，兩個TTN分子結合 形成大約2 μ m寬的肌小節，錨定于Z-Iine和M-line。2012年發表于新英格蘭醫學雜志的 研究報道了在312例擴張型心肌病（Dilated CardioMyopathy，DCM)中發現72例發生TTN 突變，并顯示TTN截短型突變是遺傳性DCM極其重要的病因，其在家族性擴張型心肌病家族 發病率約占25%，散發病例約為18%。TTN基因在轉錄過程中可以進行可變剪切，產生不同的 轉錄本，其中含有N2B結構域的轉錄本是在心肌細胞中特異表達的，可見N2B結構域在心肌 的正常發育和病理發生發揮一定的作用。明確TTN功能變異有助于提高對DCM病理生理認 識，從而幫助DCM患者能夠得到早期診斷、干預和治療。
[0004] 目前，對于DCM的病理和治療研究由于缺乏合適的動物模型而進展緩慢。盡管國 際上有部分用于心衰研究的小鼠模型，但主要集中于beta-腎上腺素受體活性調控方面， 無法模擬先天性心肌肌力缺陷這一主要心肌病的表征。
[0005] 因此，本領域亟待開發一種用于DCM研究的動物模型，以便深入探討新的治療方 案，在一定程度上替代心臟移植或提高預后生存率。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供擴張型心肌病斑馬魚疾病模型的建立與應用。
[0007] 在本發明的第一方面，提供一種篩選治療擴張型心肌病或心力衰竭的潛在藥物的 方法，所述方法包括：
[0008] (1)提供斑馬魚titin-/-突變型胚胎；
[0009] (2)按照受精后時間計算，從受精后20±2小時開始用候選藥物處理（1)的胚胎； [0010] ⑶至胚胎受精后32±2小時，48±2小時，分別觀測斑馬魚胚胎的表型；
[0011] 其中，若胚胎受精后48±2小時心臟博動頻率顯著增加，則所述的候選藥物是治 療擴張型心肌病或心力衰竭的潛在藥物；或
[0012] 若胚胎受精后32±2小時，心包腫大程度顯著緩解，心臟早期舒張、收縮能力顯著 加強或心臟縮小程度降低或血液循環顯著改善，則所述的候選藥物是治療擴張型心肌病或 心力衰竭的潛在藥物。
[0013] 在一個優選例中，所述的方法中，步驟（2)包括：在測試組中，從受精后20±2小時 開始用候選藥物處理（1)的胚胎；和/或
[0014] 步驟（3)包括：觀測斑馬魚胚胎的表型，并與對照組比較，其中所述的對照組是不 用所述候選藥物處理的、同步發育的斑馬魚titin-/-突變型胚胎；
[0015] 若與對照組相比，測試組胚胎受精后48±2小時心臟博動頻率顯著增加，則所述 的候選藥物是治療擴張型心肌病或心力衰竭的潛在藥物；或
[0016] 若與對照組相比，測試組胚胎受精后32±2小時，心包腫大程度顯著緩解，心臟早 期舒張、收縮能力顯著加強或心臟縮小程度降低或血液循環顯著改善，則所述的候選藥物 是治療擴張型心肌病或心力衰竭的潛在藥物。
[0017] 在另一優選例中，所述的心臟博動頻率顯著增加是：與對照組相比，測試組胚胎心 臟的博動次數顯著增加，如增加至每分鐘高于140次；較佳地高于150次；或
[0018] 所述的心包腫大程度顯著緩解是：與對照組相比，測試組胚胎心外膜擴大程度顯 著降低；或
[0019] 所述的血液循環顯著改善是：與對照組相比，測試組胚胎有血液循環。
[0020] 在另一優選例中，所述的候選藥物包括（但不限于）：小分子化合物、肽。
[0021] 在另一優選例中，所述對照組僅包括候選藥物的溶劑；較佳地，所述的溶劑是 DMSO ;和/或還設置陽性藥對照組；較佳地，所述的陽性藥對照為藥物Digitoxin。
[0022] 在另一優選例中，所述的方法還包括：對獲得的潛在藥物進行進一步的細胞實驗 和/或動物試驗，以從候選藥物中進一步選擇和確定對于治療擴張型心肌病或心力衰竭有 用的物質。
[0023] 在另一優選例中，所述的擴張型心肌病是擴張型先天性心肌病。
[0024] 在本發明的另一方面，提供一種用于篩選治療擴張型心肌病或心力衰竭的潛在藥 物的篩選模型，所述的篩選模型是斑馬魚titin-/-突變型胚胎，其是由斑馬魚titin+/-突 變型雜合子交配產生的后代。
[0025] 在本發明的另一方面，提供所述的篩選模型的用途，用于篩選治療擴張型心肌病 或心力衰竭的潛在藥物。
[0026] 在本發明的另一方面，提供化合物或其藥學上可接受的鹽在制備治療擴張型心肌 病或心力衰竭的藥物組合物中的用途，所述化合物選自：
[0027]

【權利要求】
1. 一種篩選治療擴張型心肌病或心力衰竭的潛在藥物的方法，其特征在于，所述方法 包括： (1) 提供斑馬魚titin-/-突變型胚胎； (2) 按照受精后時間計算，從受精后20±2小時開始用候選藥物處理（1)的胚胎； (3) 至胚胎受精后32±2小時，48±2小時，分別觀測斑馬魚胚胎的表型； 其中，若胚胎受精后48±2小時心臟博動頻率顯著增加，則所述的候選藥物是治療擴 張型心肌病或心力衰竭的潛在藥物；或 若胚胎受精后32±2小時，心包腫大程度顯著緩解，心臟早期舒張、收縮能力顯著加強 或心臟縮小程度降低或血液循環顯著改善，則所述的候選藥物是治療擴張型心肌病或心力 衰竭的潛在藥物。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)包括：在測試組中，從受精后20±2 小時開始用候選藥物處理（1)的胚胎；和/或 步驟（3)包括：觀測斑馬魚胚胎的表型，并與對照組比較，其中所述的對照組是不用所 述候選藥物處理的、同步發育的斑馬魚titin-/-突變型胚胎； 若與對照組相比，測試組胚胎受精后48±2小時心臟博動頻率顯著增加，則所述的候 選藥物是治療擴張型心肌病或心力衰竭的潛在藥物；或 若與對照組相比，測試組胚胎受精后32±2小時，心包腫大程度顯著緩解，心臟早期舒 張、收縮能力顯著加強或心臟縮小程度降低或血液循環顯著改善，則所述的候選藥物是治 療擴張型心肌病或心力衰竭的潛在藥物。
3. 如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的心臟博動頻率顯著增加是：與對 照組相比，測試組胚胎心臟的博動次數顯著增加，如增加至每分鐘高于140次；較佳地高于 150次；或 所述的心包腫大程度顯著緩解是：與對照組相比，測試組胚胎心外膜擴大程度顯著降 低；或 所述的血液循環顯著改善是：與對照組相比，測試組胚胎有血液循環。
4. 如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的候選藥物包括（但不限于）：小 分子化合物、肽。
5. 如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述對照組僅包括候選藥物的溶劑；較 佳地，所述的溶劑是DMSO;和/或 還設置陽性藥對照組；較佳地，所述的陽性藥對照為藥物Digitoxin。
6. 如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括：對獲得的潛在藥物 進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以從候選藥物中進一步選擇和確定對于治療擴張 型心肌病或心力衰竭有用的物質。
7. -種用于篩選治療擴張型心肌病或心力衰竭的潛在藥物的篩選模型，其特征在于， 所述的篩選模型是斑馬魚titin-/-突變型胚胎，其是由斑馬魚titin+/_突變型雜合子交 配產生的后代。
8. 權利要求7所述的篩選模型的用途，用于篩選治療擴張型心肌病或心力衰竭的潛在 藥物。
9. 化合物或其藥學上可接受的鹽在制備治療擴張型心肌病或心力衰竭的藥物組合物 中的用途，所述化合物選自：
【文檔編號】A61K31/519GK104274464SQ201310294525
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月12日 優先權日:2013年7月12日
【發明者】周勇, 高磊, 鄧敏, 陳漪 申請人:中國科學院上海生命科學研究院