專利名稱：斑馬魚多發性硬化癥模型的建立方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于藥物篩選(評價)領域，具體涉及一種簡便、經濟、高通量的斑馬魚多發性硬化癥模型的建立方法，并利用該動物模型篩選多發性硬化癥治療藥物或評價化合物誘導的神經髓鞘損傷的方法。
背景技術：
多發性硬化癥(multiple sclerosis，MS)是以中樞神經系統白質脫髓鞘病變為特點的自身免疫病，可能是遺傳易感個體與環境因素作用而發生的神經免疫過程，由于其發病率較高，成慢性病程和傾向于年輕人罹患，而成為最重要的神經系統疾病之一 [1]。流行病學顯示該病在北美洲約有40萬例患者，我國約有6. 5萬例患者，全球的患者超過100萬例，女性患者多于男性，多發于20-40歲年齡段的人群[2]。MS新藥研發是國際主要制藥公司新藥研發的重點項目之一。盡管目前臨床已經有多種MS治療藥物，包括激素類、免疫調節類、免疫抑制類、他汀類藥物等，但是這些藥物對MS的療效有限，且毒副作用大，費用高， 因此迫切需要研發新的MS治療藥物[3]。MS病理損傷機制與T細胞介導的自身免疫反應，膽堿能神經的功能異常，胞漿型磷脂酶A2、激肽釋放酶等酶的激活和大量自由基釋放等密切相關[4]。傳統醫學認為MS是由T細胞介導的自身免疫性疾病，即人體對其自身組織發動免疫攻擊而造成發病。MS的動物模型實驗性變態反應性腦脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis,EAE)也證實激活的T細胞啟動了 MS的炎性過程導致脫髓鞘等病變，并伴隨炎癥細胞侵潤和炎性介質釋放，產生大量自由基、細胞因子及趨化因子等活性物質。這些活性物質可以直接成為發病的原因或加重因素，導致中樞神經系統(central nervous system,CNS)血管及組織的完整性破壞和功能異常[2_5]。EAE的臨床表現及病理改變與急性多發性硬化癥極其相似，因而成為研究MS免疫病理學機制及其實驗性治療的最佳動物模型[6]。EAE是一種人工誘導的中樞神經系統特異性自身免疫疾病，可以在多種動物品系中誘導產生。EAE可以通過主動免疫脊髓組織勻漿誘導產生，或經免疫弗氏完全佐劑乳化的髓鞘抗原蛋白如髓鞘堿性蛋白、蛋白脂蛋白或髓鞘少突膠質細胞糖蛋白，也可經被動注入髓鞘抗原反應活性的T細胞誘導產生[7_14]。雖然 EAE是經典的研究MS的方法，但該模型實驗周期長、操作復雜、成本高、特異性不強、重復性差、且無法實現高通量藥物篩選的目的。目前還沒有合適的研究髓鞘的體外細胞模型。有研究曾采用背根神經節(DOG)神經元和少突膠質細胞聯合培養的方法來探索髓鞘形成過程中生長因子對髓鞘形成的影響 [15_16]。但細胞聯合培養體系的建立耗時較長，方法不穩定，重復性差，尚不適宜進行體外高通量MS治療藥物篩選，并且體外細胞缺少藥物在生物整體的代謝轉化和體內的循環分布， 不能反映藥物在體內的真實情況[17]。因此建立一種能很好的模擬藥物在體內的過程，又能快速方便的評價與篩選多發性硬化癥治療藥物的動物模型具有重要意義。斑馬魚是一種新穎的模式生物。與傳統的體內和體外篩選模型相比較，活體斑馬魚篩選模型具有諸多優勢，克服了原有體外模型在吸收、分布、代謝和排泄環節驗證的欠缺及傳統體內篩選模型實驗周期長、操作復雜、成本高的弊端。斑馬魚是一種脊椎動物，與人類基因的相似度高達85%左右，實驗結果可比性強。與鼠類等哺乳動物相比，斑馬魚胚胎透明，可同時觀察分析多個器官，實驗周期短，樣本容量大，結果可信度高，所需費用低_。更重要的是，斑馬魚模型具有與生俱來的優點[18_19]:①飼養成本低，性成熟周期短繁殖能力強，一尾雌魚每次可產200 300枚卵；③生長發育速度快，在受精后24小時(24hpf)， 斑馬魚主要的組織器官原基已形成，可為研究提供大量的樣本和較短的實驗周期；④胚胎及幼魚透明，體外受精，體外發育，可直接觀察，并可同時分析多個器官系統；⑤胚胎有可以提供營養的卵黃，第一周內不需喂食，可避免化合物處理時化合物與食物成份的相互作用；
⑥胚胎體積小，幼魚體長只有l_4mm，能夠在一個標準的6、12、24、48或96孔板內進行分析；
⑦給藥方式簡單溶于水的小分子物質可直接經皮膚、鰓及消化系統進入斑馬魚體內；不溶于水的物質、大分子物質及蛋白質可進行顯微注射。因此斑馬魚可作為很好的評價與篩選藥物的高通量體內脊椎動物模型。研究表明斑馬魚的髓鞘少突膠質細胞的結構特性和細胞譜系關系與哺乳動物具有高度的可比性[2CH23]。斑馬魚體內與髓鞘形成相關的基因(如dm20基因，mbp基因和PO 基因等)與哺乳動物具有很好的同源性[23]。盡管這些基因與哺乳動物有些不同，但高度保守的基因序列足夠表達出功能類似的蛋白(表1)[24]。斑馬魚大約發育到2dpf時大腦內緊湊型髓鞘已經形成，在此之前，斑馬魚少突膠質細胞中與髓鞘形成相關的三大基因呈共同表達[24]。表I斑馬魚與哺乳動物中與髓鞘相關的主要蛋白的比較
權利要求
1.一種活體斑馬魚多發性硬化癥模型的建立方法，其特征在于，包括以下步驟(1)斑馬魚選取挑取發育正常的斑馬魚放入微孔板中；(2)化合物處理移除微孔板中的培養液，設置多個實驗組若干個不同濃度的誘導劑處理組和I個空白對照組，每個實驗組根據微孔板的規格分別加入相同體積的相應溶液，然后恒溫培養；(3)整體斑馬魚免疫熒光染色；(4)圖像分析和/或微孔板分析；(5)統計學分析。
2.一種評價或篩選多發性硬化癥治療藥物的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)斑馬魚選取挑取發育正常的斑馬魚放入微孔板中；(2)化合物處理移除微孔板中的培養液，設置多個實驗組若干個化合物組合處理組、I個模型組、I個陽性對照組、I個溶劑對照組和I個空白對照組，每個實驗組根據微孔板的規格分別加入相同體積的相應溶液，然后恒溫培養；(3)整體斑馬魚免疫熒光染色；(4)圖像分析和/或微孔板分析；(5)統計學分析。
3.一種評價化合物誘導的髓鞘損傷的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)斑馬魚選取挑取發育正常的斑馬魚放入微孔板中；(2)化合物處理移除微孔板中的培養液，設置多個實驗組若干個待測化合物處理組、I個髓鞘損傷陽性對照組、I個溶劑對照組和I個空白對照組，每個實驗組根據微孔板的規格分別加入相同體積的相應溶液，然后恒溫培養；(3)整體斑馬魚免疫熒光染色；(4)圖像分析和/或微孔板分析；(5)統計學分析。
4.根據權利要求1-3所述的方法，其特征在于所述步驟(I)中斑馬魚為2dpf的斑馬魚，所述步驟(2)中斑馬魚培養時間為96小時，所述步驟(2)中空白對照組使用的溶液為斑馬魚養殖用水。
5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中的誘導劑為溴化乙錠 (EB)。
6.根據權利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于所述步驟(3)整體斑馬魚免疫熒光染色包括以下步驟1)固定；2)水化；3)加入封閉液，室溫下輕輕搖晃；.4)將斑馬魚與兔抗斑馬魚神經髓鞘蛋白抗體(anti-MBP)共同4°C靜置孵育過夜；.5)PBST 清洗；.6)加入FITC標記的羊抗兔IgG二抗，室溫孵育，避光；.7)PBST 清洗。
7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟(2)中化合物組合處理組加入的溶液為EB和待測化合物的混合溶液，模型組加入的溶液為EB溶液，陽性對照組加入的溶液為 EB和多發性硬化癥治療藥物的混合溶液，溶劑對照組中加入的溶液為O. 1%的DMS0。
8.根據權利要求3所述的方法，其特征在于步驟(2)中待測化合物處理組加入的溶液為待測化合物溶液，髓鞘損傷陽性對照組中加入的溶液為EB溶液，溶劑對照組中加入的溶液為O. 1%的DMS0。
9.根據權利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于所述步驟(4)圖像分析具體步驟為整體斑馬魚免疫熒光染色結束后，顯微鏡拍照并保存，一方面通過觀察斑馬魚髓鞘熒光強度來定性評價，另一方面利用軟件進行圖像分析，計算斑馬魚髓鞘熒光強度；所述步驟(4)微孔板分析具體步驟為整體斑馬魚免疫熒光染色后，將斑馬魚轉入96孔板中，每孔I 尾，然后將微孔板置于多功能微孔板分析儀下檢測熒光強度，定量評價化合物對髓鞘再生的影響或化合物誘導的髓鞘損傷。
10.根據權利要求1-3任一項所述的方法，所述步驟(3)整體斑馬魚神經髓鞘熒光染色使用免疫組織化學染色方法、活性染料熒光染色方法或非活性染料熒光染色方法。
全文摘要
本發明涉及一種斑馬魚多發性硬化癥模型的建立方法，并利用該動物模型篩選多發性硬化癥治療藥物或評價化合物誘導的神經髓鞘損傷的方法。主要包括斑馬魚選取，化合物處理，整體斑馬魚免疫熒光染色，圖像分析和/或微孔板分析，統計學分析幾個步驟。本發明的方法具有經濟、簡便、快速、高效、化合物用量少等優點，可實現體內高通量篩選多發性硬化癥治療藥物的目的，并對加速多發性硬化癥治療藥物的研發進程及多發性硬化癥患者的治療意義重大。
文檔編號A61K31/473GK102600156SQ20121001607
公開日2012年7月25日 申請日期2012年1月18日 優先權日2012年1月18日
發明者朱鳳, 朱曉宇, 李春啟, 郭勝亞 申請人:杭州環特生物科技有限公司