專利名稱：一種斑馬魚細菌感染模型的構建方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物模型構建領域，具體涉及一種斑馬魚細菌感染模型的構建方法及其應用。
背景技術：
細菌產生耐藥性是人類在病菌控制和治療中碰到的一個棘手問題，對抗生素產生耐藥性的細菌正在成為日益嚴重的威脅，并且變得越來越普遍。而抗生素的過度使用導致細菌產生多重耐藥性，從而使人類面臨“超級細菌感染”的危險[I]。大腸桿菌是革蘭氏陰性菌中最易產生耐藥性的細菌，2011年5月在德國爆發的腸出血性大腸桿菌(EHEC)疫情就是由一種名為“huSec41”的腸出血性大腸桿菌(EHEC)變種引起的，這一變種對很多抗生素具有耐藥性。抗生素在畜牧業中的濫用也導致多種動物源大腸桿菌具有了一定抗生素耐 藥性[2]，這使得畜牧業的穩定和健康發展時刻面臨巨大的威脅。要解決具有多重耐藥性的超級細菌對人類健康和畜牧業發展的威脅，除了加強對抗生素使用的規范管理，減少抗生素的濫用外，最根本的辦法還是要加快抗生素的研發速度，開發出新的、更為有效的抗生素。只有不斷采用新的研究技術和工藝，才能加快抗生素的研發速度。雖然體外細胞實驗可以很好地闡明病菌和宿主之間相互作用的關鍵步驟，但是無法獲得與整體動物相關的一些重要信息。隨著生物學技術的進步和動物替代模型的出現，曾經阻礙用活體動物進行病菌毒性研究的技術障礙和倫理問題都已經得到了很好地解決。常用的較為低等的病菌感染替代動物模型包括果蠅[3]、線蟲[4，5]和阿米巴蟲[6]等一些發育生物學研究已經很廣泛的動物，對這些低等動物發育生物學的深入研究已經為醫藥學家提供了大量的實驗工具和實驗材料。但是，果蠅和線蟲等低等動物與人類的生物等級差別太大，基因相似度低，生理結構和生理功能有較大差別，因此，其藥物實驗結果的預測可靠性與可比性較差。所以，迫切需要開發新的較為低等的動物模型，以便既能替代大小鼠等高等動物，又能保證實驗結果的預測可靠性與可比性較高。斑馬魚是一種硬骨魚，屬于脊椎動物，與果蠅、線蟲和阿米巴蟲等低等相比，斑馬魚與人類的基因相似度更高(85%以上)、生理結構和生理功能更為接近；與鼠類等哺乳動物相比，斑馬魚胚胎透明，可同時觀察分析多個器官，實驗周期短，樣本容量大，結果可信度高，所需費用低[7]。此外，斑馬魚有著與哺乳動物非常相似的發育良好的免疫系統(包括先天性免疫和獲得性免疫)[8，9]。這些優點使得斑馬魚成為了研究病菌感染機制和篩選抗生素的一種非常有用的動物模型。

發明內容
為了克服上述現有技術的缺陷和不足，發明人經研究，旨在提供一種簡單、快速、經濟、高通量的斑馬魚細菌感染模型的構建方法及其應用。本發明是通過以下技術方案實現的I. 一種斑馬魚細菌感染模型的構建方法，其特征在于，包括以下步驟(I)斑馬魚選取
挑取發育正常的斑馬魚放入微孔板中；(2)細菌注射設置若干個細菌注射組、I個溶劑注射組、I個空白對照組，將帶有熒光標記的細菌用滅菌的IXPBS緩沖液洗脫3次，然后用顯微注射的方式將細菌注入斑馬魚體內，注射結束后，洗脫除去殘留的麻醉劑，并將斑馬魚轉入6孔板中，每孔中加入等體積的養殖用水，作為細菌注射組；溶劑注射組注射等體積滅菌的IXPBS緩沖液；空白對照組注射等體積的養殖用水；恒溫培養。優選的，還包括以下步驟(3)圖像分析和/或微孔板分析；(4)統計學分析。
優選的，步驟⑴中挑選的斑馬魚為受精后2天的斑馬魚；優選的，步驟(2)中每個斑馬魚細菌注射量為3000-3500CFU ；優選的，步驟(2)中的注射方式為心包注射或卵黃囊注射；優選的，步驟⑵中細菌為大腸桿菌；優選的，所述養殖用水其溶解氧濃度為6-8mg/L、水溫為28°C、pH為7. 2-7. 6、總硬度為 200-250mg/L ；優選的，步驟⑵中斑馬魚恒溫培養的溫度為34°C ；優選的，步驟(2)中斑馬魚恒溫培養的時間為72h。優選的，圖像分析具體步驟為移除微孔板中的液體，加入等體積濃度為O. 64mM的甲磺酸將斑馬魚麻醉處死后，用3%甲基纖維素膠將斑馬魚固定于雙凹載玻片上后，置于熒光顯微鏡下觀察各實驗組斑馬魚體內的細菌生長情況并拍照保存，用ImageJ圖像分析軟件或尼康NIS-Elements D3. 10高級圖像處理軟件對圖像進行分析,計算斑馬魚體內的細菌相對熒光強度；優選的，微孔板分析具體步驟為將斑馬魚轉入96孔板，每孔I尾。然后將微孔板置于多功能微孔板分析儀下檢測熒光強度；優選的，統計學分析步驟為統計學處理結果以土SE表示，多組間比較采用單因子方差分析，兩組間比較采用Dunnett’ s T-檢驗進行統計學處理，p < O. 05為差異性顯著。2.前述的構建方法得到的斑馬魚細菌感染模型用于細菌感染研究的用途。3.前述的構建方法得到的斑馬魚細菌感染模型用于評價或篩選抗生素的用途。優選的，還包括以下步驟(3)化合物處理移除微孔板中的養殖用水，設置多個實驗組若干個化合物處理組，I個模型組，I個陽性對照組，化合物處理組中加入相同體積、濃度分別為O. I μ M、I μ M、10 μ M、100 μ M和200 μ M的化合物；模型組加入等體積的養殖用水；于34°C恒溫培養箱中培養；(4)圖像分析和/或微孔板分析；(5)統計學分析。優選的，步驟(3)陽性對照組加入的溶液為氨芐西林；優選的，圖像分析具體步驟為移除微孔板中的液體，加入等體積濃度為O. 64mM的甲磺酸將斑馬魚麻醉處死后，用3%甲基纖維素膠將斑馬魚固定于雙凹載玻片上后，置于熒光顯微鏡下觀察各實驗組斑馬魚體內的細菌生長情況并拍照保存，用ImageJ圖像分析軟件或尼康NIS-Elements D3. 10高級圖像處理軟件對圖像進行分析,計算斑馬魚體內的細菌相對熒光強度；優選的，微孔板分析具體步驟為將斑馬魚轉入96孔板，每孔I尾。然后將微孔板置于多功能微孔板分析儀下檢測熒光強度；優選的，統計學分析步驟為統計學處理結果以土SE表示，多組間比較采用單因子方差分析，兩組間比較采用Dunnett’ s T-檢驗進行統計學處理，p < O. 05為差異性顯著。優選的，化合物處理后的斑馬魚培養時間為48小時。優選的，所述的化合物為卡那霉素、慶大霉素、氯霉素或鏈霉素。本發明提供了一種斑馬魚細菌感染模型的構建方法及其應用，該方法具有簡便、快速、成功率高、重復性好且穩定可靠等優點，能實現定性分析與定量分析。將用熒光標記的細菌注射到斑馬魚體內之后，只要在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚體內的熒光強度就可以斑馬魚體內的細菌數量進行定性分析；在熒光顯微鏡下拍照并利用圖像分析軟件對斑馬魚體內的細菌數量進行定量分析；也可以用熒光酶標儀對斑馬魚體內的細菌數量進行高通量的定量分析。具體地說，本發明具有如下優點I)活體內——實驗材料為活體斑馬魚，作為一種脊椎動物，其篩選模型屬體內模型，能夠真實反映藥物在體內的吸收、分布、代謝與排泄，真正反映藥物的整體生物活性。2)高通量——斑馬魚幼魚很小，只有1-4毫米，能夠在一個標準的6，12，24，48，96或384孔板內進行分析和實驗周期短使斑馬魚成為一種能進行高通量自動化體內藥物篩選的理想模型。3)經濟一所需費用低，以猴子為實驗載體的篩選實驗每只每天耗費大于10美元，以老鼠為實驗載體的篩選實驗每只每天耗費大于I美元，而以斑馬魚為實驗載體的篩選實驗每只每天耗費小于0.01美元。4)化合物用量少——檢測化合物用量少，通常只需幾毫克，而傳統的篩選實驗則需幾毫克以上的化合物。5)簡便一實驗過程操作簡單，斑馬魚經藥物處理后便可直接觀察并進行定量與定性分析，不需要其它實驗操作，而傳統實驗操作過程復雜且容易產生假陽性結果。6)快速一實驗周期短，可在2 3天內完成；而老鼠常需要數周到數月的時間，猴子常需要數月至數年的時間。斑馬魚在第一個72小時(h)以內完成胚胎發育。多數的內部器官，包括心血管系統、腸、肝臟和腎，在24-48h內快速成型，傳統的實驗載體老鼠和猴子則分別需要21天和9個月方可完成胚胎發育。7)高效一斑馬魚胚胎及幼魚透明，可同時觀察多個器官系統，實驗分析方法簡單、快速。8)可靠的預測性一斑馬魚的基因與人類基因的相似度高達85%以上，其生物學功能與哺乳動物及人類高度相似，實驗結果可比性強，預測性好。9)直觀性強一胚胎及幼魚透明，可直接置于顯微鏡下觀察細菌的生長和繁殖。10)穩定性高、重復性好一本發明重復實驗十幾次，所獲實驗結果基本相同。·
本發明應用價值斑馬魚細菌感染模型具有可靠、快速、高效、低廉、高性價比等優點，本模型可用于細菌感染研究以及篩選抗生素。本發明對加快降血脂藥物的研發及改善高脂血癥患者的治療具有意義重大。發明詳述本發明的目的在于提供一種斑馬魚細菌感染模型的構建方法及其應用。本發明提供的方法具有簡便、快速、經濟、高效、高通量等優點。一、本發明提供一種建立斑馬魚細菌感染模型的方法，設計方案為I.細菌的培養將帶有卡那霉素抗性的紅色熒光質粒RFP(Kan+)轉入氯霉素抗性大腸桿菌BL21(DE3)Plyss (Chl+)中，轉化成功后涂LB固體平板(Kan+、Chl+)，篩選能夠產生紅色熒光且具有卡那霉素抗性和氯霉素抗性的大腸桿菌(下文簡稱BL21RFP)，長出單菌落后4°C保存平板。每次對斑馬魚進行細菌注射前一天，挑取BL21RFP單菌落到LB液體培養基中(Kan+、Chl+)，37°C>200rpm 培養 16h,備用。2.斑馬魚選取取4 5對斑馬魚親本交配,按照Westerfield[10]的方法孵化胚胎。將處于最佳處理階段的斑馬魚置于解剖顯微鏡下觀察，挑取發育正常且發育階段一致的斑馬魚移入
6、12、24、48、96或384孔微孔板中，根據微孔板規格放入不同數量的斑馬魚。3.細菌注射設置5個實驗組3個細菌注射組、I個溶劑注射組、I個空白對照組。將步驟I中培養好的細菌用滅菌的IXPBS緩沖液洗脫3次；將斑馬魚麻醉后，用顯微注射的方式將細菌注入斑馬魚體內——可采用心包注射或卵黃囊注射。3個細菌注射組的細菌注射量分別為600-700CFU、3，000-3，500CFU和15，000-18，000CFU,溶劑注射組注射等體積滅菌的IXPBS緩沖液。注射結束后，洗脫除去殘留的麻醉劑，并將斑馬魚轉入6孔板中，每孔中加入等體積的養殖用水(溶解氧質量濃度為6-8mg/L ;水溫為28°C ；pH為7. 2-7. 6 ;總硬度為200-250mg/L,下同)，按最佳培養時間長度于34°C恒溫培養箱中培養。4.結果分析統計各實驗組的斑馬魚存活率，并在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚體內細菌的生長情況，拍照并保存。用ImageJ圖像分析軟件或尼康NIS-Elements D3. 10高級圖像處理軟件對圖像進行分析，定量分析斑馬魚體內的細菌熒光強度，進而定量評價斑馬魚體內的細菌生長情況。二、本發明提供了一種利用斑馬魚細菌感染模型評價與篩選抗生素的方法，設計方案為I.細菌的培養每次對斑馬魚進行細菌注射前一天，挑取BL21RFP單菌落到LB液體培養基中(Kan+、Chl+)，37°C、200rpm 培養 16h，備用。I.細菌的培養將帶有卡那霉素抗性的紅色突光質粒RFP (Kan+)轉入氯霉素抗性大腸桿菌BL21(DE3)Plyss (Chl+)中，轉化成功后涂LB固體平板(Kan+、Chl+)，篩選能夠產生紅色熒光且具有卡那霉素抗性和氯霉素抗性的大腸桿菌(下文簡稱BL21RFP)，長出單菌落后4°C保存平板。每次對斑馬魚進行細菌注射前一天，挑取BL21RFP單菌落到LB液體培養基中(Kan+、Chl+)，37°C>200rpm 培養 16h,備用。2.斑馬魚選取取4 5對斑馬魚親本交配,按照Westerfieldtici]的方法孵化胚胎。將處于最佳處理階段的斑馬魚置于解剖顯微鏡下觀察，挑取發育正常且發育階段一致的斑馬魚移入6、 12、24、48、96或384孔微孔板中，根據微孔板規格放入不同數量的斑馬魚。3.細菌注射設置9個實驗組7個細菌注射組、I個溶劑注射組、I個空白對照組。將步驟2中培養好的細菌用滅菌的IXPBS緩沖液洗脫3次；將斑馬魚麻醉后，用顯微注射的方式將細菌注入斑馬魚體內——可采用心包注射或卵黃囊注射。5個細菌注射組的細菌注射量均為3，000-3, 500CFU，溶劑注射組注射等體積滅菌的IXPBS緩沖液。注射結束后，洗脫除去殘留的麻醉劑，并將斑馬魚轉入6孔板中，每孔中加入等體積的養殖用水。4.化合物處理7個細菌注射組中，5個化合物處理組，I個模型組，I個陽性對照組。移除微孔板中的養殖用水，化合物處理組中加入一定體積(根據微孔板規格而定)濃度分別為O. ΙμΜ、I μ Μ、10-、100 μ M和200 μ M的慶大霉素；陽性對照組中加入氨芐西林；模型組加入等體積的養殖用水。按照最佳處理時間長度于34°c恒溫培養箱中培養。5.圖像分析移除微孔板中的液體，加入等體積濃度為O. 64mM的甲磺酸將斑馬魚麻醉處死后，用3%甲基纖維素膠將斑馬魚固定于雙凹載玻片上后，置于熒光顯微鏡下觀察各實驗組斑馬魚體內的細菌生長情況并拍照保存，定性評價化合物的體內抗菌效果。空白組和溶劑組在熒光顯微鏡下觀察無熒光，細菌注射模型組的熒光很強，陽性對照組和化合物處理組的熒光強度減弱(圖I)。用ImageJ圖像分析軟件或尼康NIS-Elements D3. 10高級圖像處理軟件對圖像進行分析，計算斑馬魚體內的細菌相對熒光強度(S)，定量評價化合物的體內抗菌效果(圖
2)。化合物的抗菌效果評價公式如下
權利要求
1.一種斑馬魚細菌感染模型的構建方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)斑馬魚選取 挑取發育正常的斑馬魚放入微孔板中； (2)細菌注射 設置若干個細菌注射組、I個溶劑注射組、I個空白對照組，將帶有熒光標記的細菌用滅菌的IXPBS緩沖液洗脫3次，然后用顯微注射的方式將細菌注入斑馬魚體內，注射結束后，洗脫除去殘留的麻醉劑，并將斑馬魚轉入6孔板中，每孔中加入等體積的養殖用水，作為細菌注射組；溶劑注射組注射等體積滅菌的IXPBS緩沖液；空白對照組注射等體積的養殖用水；恒溫培養。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，還包括以下步驟 (3)圖像分析和/或微孔板分析； (4)統計學分析。
3.如權利要求I或2所述的建立方法，其特征在于優選的，步驟(I)中挑選的斑馬魚為受精后2天的斑馬魚； 優選的，步驟(2)中每個斑馬魚細菌注射量為3000-3500CFU ； 優選的，步驟(2)中的注射方式為心包注射或卵黃囊注射； 優選的，步驟(2)中細菌為大腸桿菌； 優選的，所述養殖用水其溶解氧濃度為6-8mg/L、水溫為28°C、pH為7. 2-7. 6、總硬度為200_250mg/L ； 優選的，步驟(2)中斑馬魚恒溫培養的溫度為34°C ； 優選的，步驟(2)中斑馬魚恒溫培養的時間為72h。
4.如權利要求2或3所述的構建方法，其特征在于 優選的，圖像分析具體步驟為移除微孔板中的液體，加入等體積濃度為O. 64mM的甲磺酸將斑馬魚麻醉處死后，用3%甲基纖維素膠將斑馬魚固定于雙凹載玻片上后，置于熒光顯微鏡下觀察各實驗組斑馬魚體內的細菌生長情況并拍照保存，用ImageJ圖像分析軟件或尼康NIS-Elements D3. 10高級圖像處理軟件對圖像進行分析,計算斑馬魚體內的細菌相對熒光強度； 優選的，微孔板分析具體步驟為將斑馬魚轉入96孔板，每孔I尾。然后將微孔板置于多功能微孔板分析儀下檢測熒光強度； 優選的，統計學分析步驟為統計學處理結果以表示，多組間比較采用單因子方差分析，兩組間比較采用Dunnett’ s T-檢驗進行統計學處理，p < O. 05為差異性顯著。
5.權利要求1-4所述構建方法得到的斑馬魚細菌感染模型用于細菌感染研究的用途。
6.權利要求I或3所述構建方法得到的斑馬魚細菌感染模型用于評價或篩選抗生素的用途。
7.如權利要求6所述的用途，其特征在于還包括以下步驟 (3)化合物處理 移除微孔板中的養殖用水，設置多個實驗組若干個化合物處理組，I個模型組，I個陽性對照組，化合物處理組中加入相同體積、濃度分別為O. I μ M、I μ M、10 μ M、100 μ M和·200 μ M的化合物；模型組加入等體積的養殖用水；于34°c恒溫培養箱中培養；(4)圖像分析和/或微孔板分析； (5)統計學分析。
8.如權利要求7所述的用途，其特征在于 優選的，步驟(3)陽性對照組加入的溶液為氨芐西林； 優選的，圖像分析具體步驟為移除微孔板中的液體，加入等體積濃度為O. 64mM的甲磺酸將斑馬魚麻醉處死后，用3%甲基纖維素膠將斑馬魚固定于雙凹載玻片上后，置于熒光顯微鏡下觀察各實驗組斑馬魚體內的細菌生長情況并拍照保存，用ImageJ圖像分析軟件或尼康NIS-Elements D3. 10高級圖像處理軟件對圖像進行分析,計算斑馬魚體內的細菌相對熒光強度； 優選的，微孔板分析具體步驟為將斑馬魚轉入96孔板，每孔I尾。然后將微孔板置于多功能微孔板分析儀下檢測熒光強度； 優選的，統計學分析步驟為統計學處理結果以表示，多組間比較采用單因子方差分析，兩組間比較采用Dunnett’ s T-檢驗進行統計學處理，P < O. 05為差異性顯著。
9.如權利要求8所述的用途，其特征在于 化合物處理后的斑馬魚培養時間為48小時。
10.如權利要求9所述的用途，其特征在于 所述的化合物為卡那霉素、慶大霉素、氣霉素或鏈霉素。
全文摘要
本發明涉及一種細菌感染模型的構建方法，并利用該動物模型進行細菌感染研究以及篩選抗生素。模型的構建方法主要包括斑馬魚選取，細菌注射，圖像分析和/或微孔板分析，統計學分析幾個步驟。本發明的方法具有簡便、快速、經濟、高效、高通量等優點，本模型可用于細菌感染研究以及篩選抗生素。本發明對加快降抗生素的研發及改善細菌感染患者的治療具有意義重大。
文檔編號A01K61/00GK102907356SQ201210377599
公開日2013年2月6日 申請日期2012年9月27日 優先權日2012年9月27日
發明者李春啟, 張勇, 勞喬聰, 朱鳳, 郭勝亞 申請人:杭州環特生物科技有限公司