一種新型非酒精性脂肪肝病模型制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種新型非酒精性脂肪肝病模型制備方法，包括以下步驟：a.將飼養小鼠隨機分兩組，第一組：模型小組：第二組：對照小鼠；每天記錄狀態并取尿液、肝組織及血液作脂質分析；b.處理實驗對象；c.建立模型；d.肝組織與血液采集；e.將鼠肝組織標本進行常規冰凍切片，取材、普通膠水包冰凍切片、染色后封片；e.對模型小鼠常規進行病理檢查；f.對對照小鼠常規進行病理檢查；將f）和g）步驟中得出的動態分析肝組織脂肪進行對比。本發明建立的新型非酒精性脂肪肝病模型，路線合理，易操作，且針對性強，是進一步研究非酒精性脂肪肝的有效工具。
【專利說明】一種新型非酒精性脂肪肝病模型制備方法【技術領域】
[0001]本項發明涉及一種人類非酒精性脂肪肝病(NAFLD)模型制備方法。具體可用于人類NAFLD發生機制解析、診斷方法評價、藥物篩選和防治，屬于醫學領域。
【背景技術】
[0002]非酒精性脂肪肝病(NAFLD)分原發性和繼發性兩大類，前者與胰島素抵抗和遺傳易感性有關，而后者則由某些特殊原因所致。營養過剩所致體重增長過快和體重過重，肥胖、糖尿病、高脂血癥等代謝綜合征相關脂肪肝，以及隱源性脂肪肝均屬于原發性非酒精性脂肪性肝病范疇；而營養不良、全胃腸外營養、減肥手術后體重急劇下降、藥物、環境和工業毒物中毒等所致脂肪肝則屬于繼發性非酒精性脂肪性肝病范疇。
[0003]根據脂肪肝發病機理的不同，已建立了非酒精性及其他脂肪性肝病等模型，分為自發或誘導遺傳突變引起和后天獲得性脂肪肝模型兩大類，后者通常由食物或藥理學處理造模，建模方法分為改良的CMDD飼料動物模型，高脂飲食動物模型，高糖飲食脂肪肝模型及其他如芳香酶基因Cyp9敲除、毒物(四氯化碳)和藥物(高脂+四環素注射)模型等。優點是針對人類NAFLD發病某一因素探討機制；不足的是高糖、高脂或基因敲除，與人類NAFLD發生、發展差異較大，且難以調控。目前還沒有文獻顯示建非基因敲除、非高脂肪、非高糖的NAFLD代謝調控模型，而該模型的建立對探討脂肪代謝異常機制，推動NAFLD的防治更為有益。

【發明內容】

[0004]本發明的主要任務在于提供一種在正常飲食狀態下，利用外源性肉毒堿類似物拮抗體內肉毒堿，使脂肪在肝線粒體中代謝發生障礙，建立一種新型非酒精性脂肪肝病模型的制備方法。
[0005]為了解決以上技術問題，本發明的方案如下:
一種新型非酒精性脂肪肝病模型制備方法，包括以下步驟:
模型制備:采用雄性4~6周齡野生型(打/打)野鼠，在潔凈環境中飼養；隨機分兩組，第一組:模型小組:第二組:對照小鼠；
a、以正常喂飼對照小鼠，體內肉毒堿濃度是脂肪氧化所必須(正常飲食與機體合成的量已滿足代謝要求);
b、對模型小鼠采用經腹腔拮抗體內運送長鏈脂肪酸進入線粒氧化的載體(肉毒堿)，致肝組織脂肪持續積累，逐步形成NAFLD，建立非基因敲除、非高糖/高脂肪與NAFLD發病相似的模型；
C、肝組織和血液的采集:分別將兩組小鼠放在密封容器內，加入乙醚溶液，在小鼠不活動時，將其四肢及頭固定在平板上，酒精消毒腹部，迅速剖腹，從鼠心采血后，取出肝組織，切成大小為1.5 cm X1.5 cm X0.3 cm的組織塊,分別放在AAF混合固定液(乙醇、乙酸、中性甲醛，V/V/V，參見許平等(河南醫科大學學報，1999，34 (4): 75)介紹的方法固定;
d、將鼠肝組織采用Leica-CM1900型恒冷切片機和Feather —次性刀片對肝組織標本進行常規冰凍切片，取材、普通膠水包埋(冰凍)、切片、染色后封片。
[0006]e、對模型小鼠常規進行病理檢查(H&E染色)；鼠肝組織以油紅O法進行脂肪染色，動態分析肝組織脂肪堆積；
f、對對照小鼠常規進行病理檢查(H&E染色)，鼠肝組織以油紅O法進行脂肪染色，動態分析肝組織脂肪；
g、將f)和g)步驟中得出的動態分析肝組織脂肪進行對比，得出脂肪酸及總脂肪酸動態變化模型建立過程中肝組織脂肪積累，肝組織長鏈脂肪酸、短鏈脂肪酸及總脂肪酸、外周血中、長鏈脂肪酸、短鏈脂肪酸及總脂肪酸水平改變。
[0007]在以上基礎上，所述c)步驟中肉毒堿拮抗物為[3-(2，2，2-trimethylhydrazinium) propionate dihydrate, ΤΗΡ],腹腔經拮抗技術的使用方法為:每天按照小鼠的實際體重，按0.05% (W/W)計算THP用量，以0.85%NaCl溶解，經腹腔注射一次/天，注射2~4周，長鏈脂肪酸因缺少載體不能進入線粒體氧化，肝組織脂肪積累。
[0008]在上述基礎上，所述兩組野生型(wt/wt)小鼠均置于濕度55%，溫度為22 土 2V，12小時晝/夜交替的恒溫環境飼養，每天記錄體重、活動狀態、留取尿液、留取肝組織作病理學檢查和脂質分析，留取血液作脂質分析。
[0009]在上述基礎上，所述對照小鼠以等量0.85%NaCl (W/V)溶液，以與THP注射法相同
方法，經腹腔注射與飼養。
[0010]在上述基礎上，所 述f)步驟中鼠肝組織以油紅O法進行脂肪染色，動態分析肝組織和血液中脂肪酸堆積。具體步驟如下:
1、小鼠肝組織以10%福爾馬林液(V/V)固定，冰凍切片，厚IOym;
2、配制油紅O染色液(稱取0.5g油紅O,以I, 2-丙二醇(Sigma，Cat#P4347) 100 ml溶解，置磨口瓶內保存備用；
3、切片干燥后入50%乙醇(V/V)稍洗；
4、油紅O染液作用8分鐘；
5>50%乙醇(V/V)分化，自來水終止分化；
6、常規蘇木素復染核，蒸餾水返藍，甘油明膠封片；
7、肝細胞內的脂肪滴呈紅色，細胞核呈藍色。
[0011]8、肝組織和血液脂肪酸分析方法,參見Ccederblad等(Clin Chim Acta, 1972;37: 235-243)介紹的方法。
[0012]本發明的優點:
1、如圖1所示，生物體內脂肪，經活化生成酰基CoA，需血中肉毒堿運載進入肝細胞線粒體，肉毒堿則穿過線粒體再重復轉運工作。外膜CPT-1將脂酰和肉毒堿轉變為脂酰肉毒堿，內膜CPT-1I將其轉化為脂酰CoA后進行β -氧化，體內長鏈脂肪酸需肉毒堿轉運通過線粒體進入基質氧化，生成ATP供能。在整個機理代謝過程中，肉毒堿作為人體內的一個運輸工具，起著承上啟下的作用，從該機理中也可以看出，肉毒堿的數量或工作量在一定程度上，影響著脂肪肝的發病率。
[0013]具體如下:在機體發生疾病的狀態下或因某些因素如病毒感染后，多種內源性代謝物與肉毒堿競爭結合，出現肉毒堿缺乏、酰基CoA和脂肪酸積聚；或高熱致CPT-1I活性低下，肉毒堿轉運障礙；或攝取脂肪過多超過肉毒堿處理能力等形成NAFLD。
[0014]根據上述原理，針對該代謝過程，設計采用肉毒堿類似物[3-(2，2，2- trimethylhydrazinium) propionate dihydrate, THP,圖2]拮抗體內肉毒堿,使脂肪代謝障礙,建立NAFLD模型，如圖3所示。
[0015]本發明建立的新型非酒精性脂肪肝病模型，路線合理，易操作，且針對性強，是進一步研究非酒精性脂肪肝的有效工具。
[0016]2、本發明的應用前景:
NAFLD是除酒精和其他明確的損肝因素外，所致的以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變性為主、肝臟脂質蓄積過多的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪肝及演變的脂肪性肝炎和肝硬化，按肝脂肪超過肝重程度分為輕度(5%)、中度(10%)和重度(25%)脂肪肝。NAFLD患者血游離脂肪酸(FFA)增加，肝臟合成三酰甘油(TG)增加，同時肝細胞合成脂蛋白脂酶功能和清除TG能力均減低；血FFA增加反向抑制胰島素信號傳遞，促進NAFLD發生、發展。
[0017]近年，隨著經濟發展人們生活水平及生活方式改變，NAFLD發病率明顯上升(15~31%),已是歐、美、日等國慢性肝病及肝功能異常的首要病因，已成為我國基礎醫學和臨床醫學的新挑戰。NAFLD發生機制尚未完全闡明，目前理想的NAFLD體內研究模型是急需解決的重要問題。拮抗體內運送 長鏈脂肪酸進入線粒體氧化的肉毒堿，使肝脂肪代謝受阻形成肝脂肪積聚，創建非高糖或非高脂飲食、非基因敲除且與人類NAFLD接近，易調控與評價的新模型。新模型有助于人類NAFLD發生機制解析、診斷方法評價、藥物篩選和防治。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1肉毒堿運載脂肪進入肝細胞線粒體氧化示意圖 圖2肉毒堿拮抗物THP分子結構圖
圖3小鼠NAFLD模型圖
圖4肝組織出現大量脂肪積聚后的組織脂肪染色的比較分析。
[0019]左圖:低倍觀察；右圖:高倍觀察 上圖:對照鼠:下圖:模型鼠
圖5小鼠肝組織脂肪積累的動態模型制作對比圖 A:模型鼠肝臟脂肪積聚圖，B:對照組鼠肝臟圖 圖6小鼠THP拮抗后肝組織增重與其他的比較圖。
【具體實施方式】
[0020]采用C57BJ/6 j野生型(wt/wt)小鼠做模型鼠和對照鼠兩組，均4周齡，在潔凈環境中正常飼養；飼養環境:恒溫(22 土 2V )，溫度為55%，12小時晝/夜交替；每天記錄體重、活動狀態、留取尿液、留取肝組織作病理學檢查和脂質分析，留取血液作脂質分析。
[0021]模型鼠經THP腹腔注射拮抗肉毒堿(按小鼠實際體重計算0.05% (ff/ff) THP用量，以0.85%NaCl (W/V)溶解，經腹腔注射一次/天，注射2周。
[0022]對照鼠以等量0.85%NaCl (W/V)溶液，以與THP注射法相同方法，經腹腔注射與飼養。
[0023]將上述兩組小鼠進行肝組織和血液的采集:分別將兩組小鼠放在密封容器內，加入乙醚溶液(市售，優級純)，在小鼠不活動時，將其四肢及頭固定在平板上，酒精消毒腹部，迅速剖腹處死。
[0024]實施例1
對2周后處死模型鼠和對照鼠進行肝臟對比，其肝臟大小形狀如圖5所示:脂肪肝動物模型見大量肝脂肪積累(圖5A)。對照組鼠肝未見改變(圖5B)。用目測，肝臟大小有明顯的區別。
[0025]實施例2
將兩組小鼠處理后，分別從鼠心采血后5ml，及時分離血清于-20°C保存；取出小鼠肝臟，將肝組織分成大小為1.5 cm X1.5 cm X0.3 cm,分別放在AAF混合固定液(乙醇、乙酸、中性甲醛，V/V/V，參見許平等(河南醫科大學學報，1999，34 (4): 75)介紹的方法固定。
[0026]將兩組鼠肝組織采用Leica_CM1900型恒冷切片機和Feather —次性刀片對肝組織標本分別進行常規冰凍切片，取材、普通膠水包埋(冰凍)、切片、染色后封片。
[0027]對兩組小鼠常規進行病理檢查(H&E染色);鼠肝組織以油紅O法進行脂肪染色，動態分析肝組織脂肪堆積。
[0028]具體步驟如下:以模型小鼠為例。
[0029]模型鼠小鼠肝組織 以10%福爾馬林液(V/V)常規固定，冰凍切片，厚ΙΟμπι;
配制油紅O染色液(稱取0.5g油紅O,以I, 2-丙二醇(Sigma, Cat#P4347)100 ml溶解，
置磨口瓶內保存備用；
切片干燥(在室溫，22 土 2°C自然干燥)后入濃度為50%乙醇(V/V)稍洗5秒；
油紅O染液作用8分鐘；
50%乙醇(V/V)分化，自來水終止分化；
常規蘇木素復染核，蒸餾水返藍，甘油明膠封片；
對照小鼠的過程與模型小鼠等同，在此不再累述。
[0030]肝細胞內的脂肪滴呈紅色，細胞核呈藍色，如圖4所示。
[0031]肝組織和血液脂肪酸分析方法,參見Cederblad等(Clin Chim Acta, 1972; 37:235-243)介紹的方法。
[0032]實施例3
動態分析肝組織脂肪。將染色后的兩組鼠肝進行動態分析，得出的動態分析肝組織脂
肪進行對比，得出脂肪酸及總脂肪酸動態變化模型建立過程中肝組織脂肪積累，肝組織長
鏈脂肪酸、短鏈脂肪酸及總脂肪酸水平(附表)；外周血中、長鏈脂肪酸、短鏈脂肪酸及總脂
肪酸水平改變。如小鼠肝組織中脂肪酸濃度的變化如下:
【權利要求】
1.一種新型非酒精性脂肪肝病模型制備方法，其特征在于:包括以下步驟: 飼養小鼠分組用雄性4~6周齡野生型(小鼠，在潔凈環境中飼養；隨機分兩組，第一組:模型小組:第二組:對照小鼠；每天記錄體重、活動狀態、留取尿液、留取肝組織作病理學檢查和脂質分析，留取血液作脂質分析 處理實驗對象:以正常兩組小鼠； 建立模型:對模型小鼠采用腹腔經拮抗體內運送長鏈脂肪酸進入線粒氧化的載體-------肉毒堿； 肝組織與血液采集:分別將兩組小鼠放在密封容器內，加入乙醚溶液，在小鼠不活動時，將其四肢及頭固定在平板上，酒精消毒腹部，迅速剖腹，從鼠心采血后，取出肝組織，切成大小為1.5 cm X1.5 cm X0.3 cm組織塊,分別放在AAF混合固定液中固定； 將鼠肝組織標本進行常規冰凍切片，取材、普通膠水包冰凍切片、染色后封片； 對模型小鼠常規進行病理檢查------H&E染色鼠肝組織以油紅O法進行脂肪染色，動態分析肝組織脂肪堆積； 對對照小鼠常規進行病理檢查-------H&E染色鼠肝組織以油紅O法進行脂肪染色，動態分析肝組織脂肪； 將f)和g)步驟中得出的動態分析肝組織脂肪進行對比，得出脂肪酸及總脂肪酸動態變化，模型建立過程中肝組織脂肪積累，肝組織長鏈脂肪酸、短鏈脂肪酸及總脂肪酸、外周血中、長鏈脂肪酸、短鏈脂肪酸及總脂肪酸水平改變。
2.根據權利要求1所述的一種新型非酒精性脂肪肝病模型制備方法，其特征在于:所述肉毒喊拮抗物，為 3-(2，2，2-trimethyl hydrazinium) propionate dihydrate,即THP ;每天按照小鼠的實際體重，按重量為0.05%計算THP用量，以0.85%NaCl溶解，經腹腔注射一次/天，注射2~4周。
3.根據權利要求1所述的一種新型非酒精性脂肪肝病模型制備方法，其特征在于:小鼠暫養條件:所述兩組野生型小鼠均置于濕度55%，溫度為22 土 2°C，12小時晝/夜交替的恒溫環境飼養。
4.根據權利要求1所述的一種新型非酒精性脂肪肝病模型制備方法，其特征在于:所述對照小鼠以等量0.85%NaCl溶液，經腹腔注射。
5.根據權利要求1所述的一種新型非酒精性脂肪肝病模型制備方法，其特征在于:所述油紅O配置染液的方法如下:稱取0.5g油紅0，以1，2-丙二醇(Sigma，Cat#P4347) 100ml溶解，置磨口瓶內保存備用。
6.根據權利要求1所述的一種新型非酒精性脂肪肝病模型制備方法，其特征在于:所述f )步驟中鼠肝組織以油紅O法進行脂肪染色:方法如下:b2切片干燥后入50%乙醇稍洗；c3、常溫(22 土 2V )浸置油紅O染液8分鐘；50%乙醇分化，自來水終止分化；常規蘇木素復染核，蒸餾水返藍，甘油明膠封片；肝細胞內的脂肪滴呈紅色，細胞核呈藍色。
【文檔編號】A61K31/205GK103462948SQ201310312133
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年7月24日 優先權日:2013年7月24日
【發明者】姚登福 申請人:南通大學附屬醫院