一種核酸適配體制備治療多發性骨髓瘤的藥物或制品的用途
【專利摘要】本發明提供了一種核酸適配體制備治療多發性骨髓瘤的藥物或制品的用途，該核酸適配體為TY04，是一段含有83個堿基的單鏈DNA。其作用原理是該核酸適配體能呈現細胞特異性和序列特異性地與多發性骨髓瘤細胞表面蛋白類物質穩定結合，通過下調細胞周期運行相關蛋白cyclin?B、CDK1、ERK1/2和γ-tubulin的表達，阻滯多發性骨髓瘤細胞周期的進程于G2/M期，從而抑制多發性骨髓瘤細胞增殖。目前，國內外核酸適配體應用于多發性骨髓瘤的治療還未見報道。該核酸適配體的發現和應用將為治療多發性骨髓瘤提供新的策略。
【專利說明】一種核酸適配體制備治療多發性骨髓瘤的藥物或制品的用途
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫學與臨床醫學【技術領域】，涉及一個與多發性骨髓瘤治療相關的核酸分子在制備治療多發性骨髓瘤的藥物或制品上的用途。
【背景技術】
[0002]核酸適配體(aptamer)是通過模擬自然進化過程的人工篩選技術-指數富集配體系統進化技術(SELEX)篩選得到的具有識別功能的短的單鏈DNA或RNA分子，能通過折疊形成特定的三維結構與靶分子結合。其具有高親和力、高特異性、無免疫原性、易合成、改造與標記、生物化學穩定性好、能可逆變性與復性、還能通過酶擴增、剪切等特性，特別是一些核酸適配子能特異性與其靶蛋白結合，抑制靶蛋白的功能活化，阻斷細胞內的信號轉導，使其在疾病靶向性治療中顯示出廣闊的應用前景。目前，由Eyetch/Pfizer開發的靶向VEGF 的核酸適配子-pegaptanib sodium (商品名Macugen)已獲得FDA的批準,成功地用于治療老年黃斑變性。在腫瘤治療中，核酸適配子通過靶向VEGF抑制腫瘤血管生成，靶向蛋白激酶如Her-2、Her_3、Raf-1等阻斷腫瘤細胞信號轉導，靶向核仁蛋白阻止腫瘤細胞增殖，靶向人乳頭瘤癌蛋白E7誘導腫瘤細胞發生凋亡等多種途徑發揮腫瘤治療作用，一些已進入臨床試驗，顯示出卓越的療效和廣闊的應用前景。
[0003]細胞-SELEX (Cell-SELEX)是在SELEX基礎上發展的一項新的細胞篩選技術，該技術篩選核酸適配體是以活細胞為篩選對象，不需要事先了解靶目標的分子特征，能確保目標分子保持天然構象，最大程度保留其生物功能，該技術不僅可用于確定某種疾病或細胞的生物標志物，而且也非常有利于獲得具有治療潛力的核酸適配體。
[0004]多發性骨髓瘤(mutiple myeloma,麗)是一種起源于衆細胞的血液系統惡性腫瘤，其特征表現為惡性漿細胞在骨髓內克隆性異常增殖。MM的發病率僅次于非霍奇金淋巴瘤，為第二大常見的造血系統惡性腫瘤，約占所有血液系統惡性腫瘤10%左右。目前，傳統的化療及造血干細胞移植等為臨床常用的 治療手段，但是其治療效果一直不佳，加之臨床多藥耐藥的出現，使其治療更為困難，患者的5年生存率僅40%左右，因此，臨床上迫切需要采取新的方法和手段治療MM患者，提高患者的生存期。核酸適配體TY04是用一種基于 Cell-SELEX的方法篩選出來的核酸適配體。我們首次研究發現，TY04能特異性地顯著抑制多發性骨髓瘤細胞株的增殖，而對正常淋巴細胞的生存活性沒有影響。核酸適配體TY04對多發性骨髓瘤的治療作用尚未見報道，其將為治療多發性骨髓瘤提供新的策略。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種核酸適配體TY04制備治療多發性骨髓瘤的藥物或制品的用途。
[0006]一種核酸適配體TY04的用途，所述的核酸適配體TY04的序列為SEQ ID N0.1，用于制備治療多發性骨髓瘤的藥物或制品。[0007]本發明的TY04是特異性靶向多發性骨髓瘤的核酸適配體，具有核酸適配體通用的特點，如:高親和力、高特異性、無免疫原性、無毒性等。核酸適配體TY04對不同的多發性骨髓瘤細胞株增殖有特異性的抑制作用，TY04能呈現劑量依賴性抑制多發性骨髓瘤細胞株MM.1S的增殖(IC50值為3.89 PM)，而對正常人永生化B淋巴細胞未見明顯影響；TY04 對多發性骨髓瘤MM.1S細胞的作用具有序列特異性；熒光核酸適配體TY04與多發性骨髓瘤MM.1S細胞有顯著的結合，且隨著濃度的增大結合強度增加；經鑒定核酸適配體TY04與 MM.1S細胞結合的物質部分為細胞膜上的蛋白質；核酸適配體TY04能影響MM.1S細胞周期的進程，阻滯細胞周期在G2/M期，從而導致腫瘤細胞增殖紊亂而死亡；核酸適配體TY04降低了細胞中cyclin B、CDKl、ERKl/2和Y-tubulin蛋白的表達量。綜上，TY04對多發性骨髓瘤治療活性的發現，將有助于豐富臨床治療MM的手段和方法，有助于具有自主知識產權的靶向性治療MM的核酸類新藥的開發。
[0008]本發明的主要優點和有益效果
[0009]核酸適配體具有高親和力、高特異性、分子量小、易修飾、低毒性和無免疫原性等特點。核酸適配體TY04能抑制多種多發性骨髓瘤細胞株(H929、KM3、0PM2)的增殖，進一步研究發現TY04能與多發性骨髓瘤MM.1S細胞結合，并特異性地抑制多發性骨髓瘤細胞株MM.1S的增殖，同等情況下其對正常淋巴細胞的生長沒有影響，表明核酸適配體TY04作用多發性骨髓瘤細胞株具有序列和細胞特異性，進一步的研究發現核酸適配體TY04阻滯 MM.1S 細胞周期于 G2/M 期，降低 MM.1S 細胞中 cyclin B、CDKl、ERKl/2 和 y -tubulin 蛋白的表達量，上述結果顯示TY04是一種新的治療多發性骨髓瘤的候選制劑。本發明對多發性骨髓瘤的治療具有靶向特異性的重大意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為采用CCK-8檢測核酸適配體TY04對不同多發性骨髓瘤細胞株和正常人永生化B淋巴細胞存活率的影響；
[0011]圖2為不同濃度的核酸適配體TY04對多發性骨髓瘤細胞株MM.1S和正常人永生化B淋巴細胞增殖的影響；
[0012]圖3為不同濃度的ssDNA library (文庫對照)和核酸適配體TY04對多發性骨髓瘤MM.1S細胞增殖的影響，顯示核酸適配體TY04抑制MM.1S細胞增殖具有序列特異性；
[0013]圖4顯示核酸適配 體TY04與多發性骨髓瘤MM.1S細胞能特異結合；
[0014]圖5顯示核酸適配體TY04與多發性骨髓瘤MM.1S細胞的結合強度強于文庫對照與麗.1S細胞的結合強度；
[0015]圖6顯示多發性骨髓瘤MM.1S細胞與核酸適配體TY04的結合穩定性檢測；
[0016]圖7顯示多發性骨髓瘤MM.1S細胞與核酸適配體TY04的結合部位檢測；
[0017]圖8為核酸適配體TY04與多發性骨髓瘤MM.1S細胞表面結合物質類型的鑒定；
[0018]圖9為檢測核酸適配體TY04處理多發性骨髓瘤MM.1S細胞后細胞周期變化情況；
[0019]圖10為核酸適配體TY04對多發性骨髓瘤MM.1S細胞周期和細胞增殖相關蛋白表達變化的影響。
【具體實施方式】[0020]以下結合實施例旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。
[0021]核酸適配體TY04是采用一種基于Cell-SELEX的方法，采用惡性血液腫瘤細胞作為篩選對象，經過24輪篩選出來能特異與惡性血液腫瘤細胞結合的核酸適配體。TY04的合成步驟大致如下:(I)合成單鏈DNA:依照TY04的序列順序，通過DNA合成儀(Polygen DNA-Synthesizer)合成，(2)DNA脫保護:用氨水和甲胺(I:1)脫保護后，然后把DNA溶解在TEAA溶液當中；(3)DNA純化:通過高效液相色譜儀(HPLC)純化；(4)DNA干燥:通過離心濃縮干燥；(5)溶解測定濃度備用:待DNA完全干燥后，溶于相應的溶液中(如滅菌水)，島津 UV-2450PC測定濃度后備用。
[0022]實施例1
[0023]為了明確核酸適配體TY04對多發性骨髓瘤細胞株的增殖是否有影響，我們采用 CCK-8的方法分別檢測了 M的TY04處理多發性骨髓瘤多種細胞株(MM.1S，H929，KM3， 0PM2)和正常人永生化B淋巴細胞(供試細胞的濃度均為IX IO5個/ml左右)96h后的相對存活率。通過三次獨立重復實驗后，發現經TY04處理后正常人永生化B淋巴細胞和不同的多發性骨髓瘤細胞(MM.1S, H929，KM3，·0PM2)的相對存活率(％)分別為:144±13.81， 47.72±5.7,69.42±15.1,58.23±0.65,57.08±4.24。與正常人永生化 B 淋巴細胞相比， TY04能導致多發性骨髓瘤各株細胞的存活率顯著較低，具有統計學差異(P < 0.05)(見圖 1，一般而言在細胞水平IC50值在10 ii M以內，都有抗腫瘤開發潛力)。進一步采用CCK-8檢測不同濃度的核酸適配體TY04(0，0.5，1.0,2.0,4.0u M)處理多發性骨髓瘤MM.1S細胞(供試細胞的濃度為3 X IO5個/ml左右)和正常人永生化B淋巴細胞(供試細胞的濃度為I X IO5 個/ml左右)96h后的生長情況，通過三次獨立重復實驗后，結果如圖2所示，顯示TY04能呈現劑量依賴性抑制多發性骨髓瘤細胞株MM.1S的增殖，而對正常人永生化B淋巴細胞的存活未見明顯影響。TY04作用麗.1S細胞的IC50值為3.89 u M，低于10 u M，符合抗腫瘤藥物開發潛力。不同濃度TY04對MMl.S的增殖抑制作用與對正常人永生化B淋巴細胞作用效果相比均存在顯著差異，濃度越高，抑制效果越好；有統計學意義(P < 0.05)。
[0024]實施例2
[0025]為了明確TY04抑制MM.1S的增殖是否具有序列特異性，我們進一步檢測了不同濃度的ssDNA文庫和TY04 (0，0.5，1.0，2.0，4.0 y M)處理多發性骨髓瘤MM.1S細胞(供試細胞的濃度為3 X IO5個/ml左右)96h后的生長情況。通過三次獨立重復實驗后，數據經統計學分析，結果如圖3所示，表明與TY04相比較，ssDNA文庫對多發性骨髓瘤MM.1S細胞的增殖沒有影響，進一步說明核酸適配體TY04對多發性骨髓瘤MM.1S細胞具有序列特異性。
[0026]實施例3
[0027]為了明確核酸適配體TY04與多發性骨髓瘤麗.1S細胞的結合情況，將帶有FITC 熒光標記的核酸適配體TY04以不同濃度(0，25，125，250，500nM)與多發性骨髓瘤MM.1S細胞(供試細胞的濃度為I X IO6個/ml左右)進行孵育后，經流式細胞儀檢測TY04與麗.1S 細胞表面的結合情況。結果如圖4所示，熒光核酸適配體TY04與多發性骨髓瘤MM.1S細胞有顯著的結合，且隨著濃度的增大結合強度增加。為了檢測核酸適配體TY04與多發性骨髓瘤MM.1S細胞的結合是否具有特異性，將帶有FITC熒光標記的ssDNA文庫以不同濃度(0， 25，125nM)與多發性骨髓瘤MM.1S細胞進行孵育后，經流式細胞儀檢測TY04與MM.1S細胞表面的結合情況，以熒光適配體TY04的結合作為對照組。結果如圖5所示，與相同濃度下的適配體TY04和麗.1S細胞有明顯結合相比，ssDNA文庫與麗.1S細胞無結合，表明適配體TY04與MM.1S細胞的結合具有特異性。
[0028]實施例4
[0029]將Iml多發性骨髓瘤MM.1S細胞(供試細胞的濃度為IX IO6個/ml左右)在不同孵育條件下(4°C和37°C)與的FITC標記的熒光核酸適配體TY04 (250nM)進行結合實驗， 以未結合細胞作為對照，經流式細胞儀檢測細胞熒光信號強度。結果如圖6顯示，在4°C和 37°C的條件下，多發性骨髓瘤MM.1S細胞與熒光核酸適配體TY04的結合強弱沒有差異，說明核酸適配體與MM.1S細胞結合穩定，不受溫度的影響。為觀察TY04與MM.1S細胞的結合部位進一步將250nM FITC熒光標記的核酸適配體TY04與多發性骨髓瘤MM.1S細胞分別在 4°C和37°C條件下孵育，制片后在熒光顯微鏡下觀察，如圖7，在4°C和37°C條件下，適配體 TY04分布在MM.1S細胞膜上和胞質中。
[0030]實施例5
[0031]多發性骨髓瘤MM.1S細胞培養至對數生長期，將Iml MM.1S細胞(供試細胞的濃度為I X IO6個/ml左右)用0.05%胰酶和0.lmg/mL蛋白酶K分別處理2min和IOmin后；加 FBS中和酶后，Washing Buffer洗兩遍；接著用250nM的TY04分別在冰上MM.1S細胞共孵育50min后，Wash Buffer洗滌后，經流式細胞儀檢測熒光強度并分析結果。結果見圖8， 結果顯示，用胰酶和蛋白酶K處理細胞后，核酸適配體TY04與MM.1S細胞的結合明顯減少。 結果說明核酸適配體TY04通過一部分能被胰酶或蛋白酶K消化而失去活性的蛋白與MM.1S 細胞結合。
[0032]實施例6
[0033]用4 ii M核酸適配體TY04處理MM.1S細胞96h后(供試細胞的濃度為3 X IO5個/ ml左右)，收集一定數量細胞。經離心洗滌后，棄上清；加入100 u L破膜劑，混勻孵育Imin ； 再直接加入ImL PI染色液，混勻。流式細胞儀檢測后細胞周期分析軟件分析結果。結果見圖9和表1，經過4iiM核酸適配體TY04處理MM.1S細胞96h后，相對于未處理組，MM.1S細胞周期分布發生變化，G1/G0期和S期的細胞百分率減少，而G2/M細胞的百分率增加，說明細胞周期被阻滯在G2/M期。
[0034]表1:核酸適配體TY04處理MM.1S細胞后的細胞周期分布變化
【權利要求】
1.一種核酸適配體TY04的用途，其特征在于，所述的核酸適配體TY04的序列為SEQ ID N0.1，用于制備治療多發性骨髓瘤的藥 物或制品。
【文檔編號】A61K48/00GK103432594SQ201310343009
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月8日 優先權日:2013年8月8日
【發明者】劉靜, 譚蔚泓, 葉茂, 宋健輝, 戴紅娟 申請人:中南大學