貽貝寡肽的制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了貽貝寡肽的制備方法及其應用，屬于海洋生物技術應用領域。以紫貽貝為原料，采用堿性冷提法從貽貝凍干粉中獲得貽貝蛋白；通過復合酶解蛋白得到混合多肽，超濾獲得寡肽，采用衰老小鼠模型進行一系列抗衰老動物實驗及行為學實驗，并通過果蠅生存實驗，證明該貽貝寡肽具有延緩衰老的活性，為實現貽貝的科學化、高值化利用開創了新途徑。與現有技術相比，本發明的優點在于：提取制備了貽貝蛋白，采用最佳的蛋白酶和優選的工藝對貽貝蛋白進行酶解純化，避免了高溫對貽貝蛋白分子結構的分解，并使貽貝多肽在分子量水平上得到分級，從而使所得的貽貝寡肽延緩衰老的效果更純更好。
【專利說明】貽貝寡肽的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及制備一種具有延緩衰老活性的貽貝寡肽，可作為抗衰老食品、功能性食品或藥品，屬于海洋生物技術應用領域。
【背景技術】
[0002]貽貝，俗稱“海紅”，其干制品名為“淡菜”，是我國大量人工養殖的貝類。貽貝富含蛋白質，素有“海中雞蛋”的美稱，粗蛋白含量高于其他海產雙殼類軟體動物，且氨基酸種類較齊全。已有技術利用堿提貽貝蛋白(專利號:201010513556.2)，超聲波-微波輔助加酶單一酶解制備貽貝酶解液，然后用二氧化氯溶液稀釋，超微膜過濾純化截留分子量為50000道爾頓多肽(專利號:201110127662.1)，減法提取蛋白酶解并通過超濾富集活性肽具有抗氧化(專利號:201010234963.X)、抗癌(專利號:201010610946.1 及 201010296130.6)、降血壓(專利號:201010284271.6 及 201010612353.9)及增強免疫(專利號:201110246647.9)功能，但至今尚未見有關貽貝多肽抗衰老活性的報道。

【發明內容】

[0003]本發明以紫貽貝為原料，采用堿性冷提法從貽貝凍干粉中獲得貽貝蛋白；通過復合酶解蛋白得到混合多肽，超濾獲得寡肽，采用衰老小鼠模型進行一系列抗衰老動物實驗及行為學實驗，并通過果蠅生存實驗，證明該貽貝寡肽具有延緩衰老的活性，為實現貽貝的科學化、高值化利用開創了新途徑。與現有技術相比，本發明的優點在于:提取制備了貽貝蛋白，采用最佳的蛋白酶和優選的工藝對貽貝蛋白進行酶解純化，避免了高溫對貽貝蛋白分子結構的分解，并使貽貝多肽在分子量水平上得到分級，從而使所得的貽貝寡肽延緩衰老的效果更純更好。
[0004]本發明通過以下技術手段實現。貽貝寡肽的制備方法，按照下述步驟進行:`[0005]( I)制備貽貝凍干粉:
[0006]取紫貽貝的新鮮貽貝肉，連同汁液迅速冷凍干燥粉碎后得到貽貝粉；
[0007](2)制備貽貝蛋白:
[0008]將適量的貽貝粉，用0.2mol/L的NaOH溶液配成質量分數為1%的懸浮液，并用2mol/L的NaOH溶液調節pH值梯度為10-12，攪拌浸提60min(4°C );將浸提液于8000r/min條件下低溫離心20min (4°C)，收集上清液；將上述上清液，用2mol/L HCl調pH值為5_6，沉淀5-10分鐘，8000r/min，，4°C離心20min ;分別收集上清夜和沉淀，沉淀冷凍干燥為貽貝蛋白粉；
[0009](3)制備貽貝寡肽:
[0010]以貽貝蛋白粉于水中配成質量分數為2%的懸浮液，置于反應器中52.5°C水浴浸泡30分鐘后，加入中性蛋白酶與復合風味酶組合同時水解；加入蛋白酶量各為4000U/g底物蛋白，為PH6.0-7.0條件下，52.5°C水解2小時，煮沸IOmin滅酶。酶解液離心，取上清液分別采用10kDa、5kDa、3kDa、lkDa的超濾膜超濾；取小于IkDa濾液冷凍干燥,獲得貽貝寡肽。
[0011]中性蛋白酶與復合風味酶的質量比為1:2.5。
[0012]貽貝寡肽的應用，可以用于制備抗氧化活性和延緩衰老作用的食品。
[0013]本發明的有益效果:相比較已有的酶解產物或其他活性多肽，本發明提供的貽貝寡肽具有更強的抗氧化活性和更顯著的延緩衰老作用，可用于制備抗衰老、提高認知能力的食品、功能性食品或藥品。
[0014]本發明原料來源豐富、制備簡便、功效顯著，為貽貝多肽的應用開辟一個新的領域，有利于促進海洋生物的開發利用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1:本發明的工藝流程圖，
[0016]圖2:貽貝寡肽組、對照組和加速衰老組小鼠一般狀態圖，
[0017]圖3:水迷宮空間探索實驗中各組小鼠在平臺象限停留的時間，
[0018]圖4:水迷宮空間探索實驗中各組小鼠穿過平臺的次數，
[0019]圖5:旋轉棒實驗中 各組小鼠在棒上的平衡時間。
[0020]【具體實施方式】
[0021]下面結合實施例和附圖對本發明做進一步闡述:
[0022]本發明中延緩衰老評價方法如下:
[0023]以果蠅的生存試驗評價貽貝寡肽可以延長平均壽命、最高壽命及提高性活力；并采用中年早衰小鼠模型，測定貽貝寡肽對小鼠腦、肝、腎組織抗氧化能力；通過測定小鼠行為、學習記憶能力以及腦衰老病變，測定貽貝寡肽對衰老小鼠認知能力的改善作用，從而全面評價貽貝寡肽具有延緩衰老的作用。圖1為本發明的工藝流程圖。
[0024]實施例1:制備貽貝寡肽
[0025]手工剝取紫貽貝的新鮮貽貝肉，連同汁液迅速冷凍干燥。將適量的貽貝凍干粉100g,用0.2mol/L的NaOH溶液配成質量分數為1%的懸浮液，并用2mol/L的NaOH溶液調節PH值梯度為12，低溫攪拌浸提60min (4°C，一直保持在低溫下操作)。將浸提液于SOOOr/min條件下離心20min(4°C )。收集上清。將上述制備的上清液，用2N HCl調pH值為5.3，沉淀10分鐘，離心(8000r/min，20min，4°C)。離心后分別收集沉淀。得到的沉淀冷凍干燥為貽貝蛋白粉。準確稱取貽貝凍干蛋白粉25克，加水配成蛋白質量分數為2%的懸浮液，放入反應器中，55°C水浴浸泡30分鐘，按照酶與蛋白質量比為8000U/g的量加入中性蛋白酶
1.2克，用磷酸緩沖液調節溶液pH至7.0 ;置于恒溫水浴鍋中55°C條件下酶解2小時，酶解物加熱煮沸10分鐘滅酶，6000r/min離心15分鐘，上清液用截留分子量10kDa、5kDa、3kDa、IkDa的超濾膜超濾；取小于IkDa濾液冷凍干燥，獲得貽貝寡肽。
[0026]本發明中使用的蛋白酶,中性蛋白酶(酶活力為16.0萬U/g)、復合風味酶(酶活力為6.9萬U/g)由無錫杰能科酶制劑有限公司提供。
[0027]實施例2:制備貽貝寡肽
[0028]手工剝取紫貽貝的新鮮貽貝肉，連同汁液迅速冷凍干燥。將適量的貽貝凍干粉100g,用0.2mol/L的NaOH溶液配成質量分數為1%的懸浮液，并用2mol/L的NaOH調節pH值梯度為12，低溫攪拌浸提60min (4°C，一直保持在低溫下操作)。將浸提液于8000r/min條件下離心20min(4°C )。收集上清。將上述制備的上清液，用2N HCl調pH值為5.3，沉淀10分鐘，離心(8000r/min，20min，4°C)。離心后分別收集沉淀。得到的沉淀冷凍干燥為貽貝蛋白粉。準確稱取干燥的貽貝蛋白粉25g，加水配成蛋白質量分數為2%的懸浮液，放入反應器中，50°C水浴浸泡30分鐘，按照酶與蛋白質量比為8000U/g的量加入復合風味酶3g，用磷酸緩沖液調節溶液pH至6.0 ;置于恒溫水浴鍋中50°C下酶解2小時，酶解物加熱煮沸10分鐘滅酶,6000r/min離心15分鐘,上清液用截留分子量10kDa、5kDa、3kDa、IkDa的超濾膜超濾；取小于IkDa濾液冷凍干燥，獲得貽貝寡肽。
[0029]實施例3:制備貽貝寡肽
[0030]手工剝取紫貽貝的新鮮貽貝肉，連同汁液迅速冷凍干燥。將適量的貽貝凍干粉100g,用0.2mol/L的NaOH溶液配成質量分數為1%的懸浮液，并用2mol/L的NaOH調節pH值梯度為12，低溫攪拌浸提60min (4°C，一直保持在低溫下操作)。將浸提液于8000r/min條件下離心20min(4°C )。收集上清。將上述制備的上清液，用2N HCl調pH值為5.3，沉淀10分鐘，離心(8000r/min，20min，4°C)。離心后分別收集沉淀。得到的沉淀冷凍干燥為貽貝蛋白粉。準確稱取干燥的貽貝蛋白粉25g，加水配成蛋白質量分數為2%的懸浮液，放入反應器中，52.5°C水浴浸泡30分鐘，按照酶與底物蛋白質量比為4000U/g的量加入中性蛋白酶0.6g和復合風味酶1.5g，用磷酸緩沖液調節溶液pH至6.0 ;置于恒溫水浴鍋中52.5°C下酶解2小時，酶解物加熱煮沸10分鐘滅酶，6000r/min離心15分鐘，上清液用截留分子量10kDa、5kDa、3kDa、lkDa的超濾膜超濾；取小于IkDa濾液冷凍干燥,獲得貽貝寡肽。
[0031]動物抗衰老活性試驗舉例(以測定實施例3中制備的材料為例)。
[0032]試驗I貽貝寡肽對果蠅壽命的影響
[0033](1)選取IOh內孵出的未交配的雌、雄野生黑腹果蠅，用乙醚麻醉，然后按性別隨機分為對照組、添加貽貝寡肽高劑量組(3mg/mL)及添加貽貝寡肽低劑量組(0.3mg/mL)，每組雌雄各100只，置于溫度(25± I) °C，濕度55-65%的12小時光照交替的培養箱中進行培養。每管放2ml培養基,用雙層紗布封口。
[0034](2)前兩周均使用基礎培養基，除對照組外，14天后各組開始使用添加貽貝寡肽
的培養基。
[0035](3)每天上午10:00 (或定時)觀察并統計果蠅死亡數，4天更換一次培養基，觀察至果蠅全部死亡為止。實驗過程中剔除非正常原因死亡和操作過程中不慎飛走的果蠅數。
[0036](4)最后統計各組果蠅平均壽命和最大壽命。平均壽命以每組全部果蠅的存活時間計算，每組最后死亡的20只果蠅存活天數的平均數為該組最大壽命的實驗結果。
[0037]結果見表1，高劑量的貽貝寡肽顯著提高(P〈0.05)雌雄果蠅的平均壽命和最高壽命10-21天。
[0038]表1貽貝寡肽對雌雄果蠅壽命的影響(X土s)
[0039]
【權利要求】
1.貽貝寡肽的制備方法，其特征在于按照下述步驟進行: (1)制備貽貝凍干粉: 取紫貽貝的新鮮貽貝肉，連同汁液迅速冷凍干燥粉碎后得到貽貝粉； (2)制備賭貝蛋白: 將適量的貽貝粉，用0.2mol/L的NaOH溶液配成質量分數為1%的懸浮液，并用2mol/L的NaOH溶液調節pH值梯度為10-12，4°C攪拌浸提60min ;將浸提液于8000 r/min條件下4°C離心20min，收集上清液；將上述上清液，用2mol/L HCl調pH值為5_6，沉淀5_10分鐘，8000 r/min,，4°C離心20min ;分別收集上清夜和沉淀,沉淀冷凍干燥為貽貝蛋白粉； (3)制備貽貝寡肽: 以貽貝蛋白粉于水中配成質量分數為2%的懸浮液，置于反應器中52.5 1:水浴浸泡30分鐘后，加入中性蛋白酶與復合風味酶組合同時水解；加入蛋白酶量各為4000U/g底物蛋白，為pH 6.0-7.0條件下，52.5°C水解2小時，煮沸IOmin滅酶；酶解液離心，取上清液分別采用10kDa、5kDa、3kDa、lkDa的超濾膜超濾；取小于IkDa濾液冷凍干燥,獲得貽貝寡肽。
2.根據權利要求1所述的貽貝寡肽的制備方法，其特征在于中性蛋白酶與復合風味酶的質量比為1:2.5。
3.貽貝寡肽·的應用，用于制備抗氧化活性和延緩衰老作用的食品。
【文檔編號】A61K38/01GK103710414SQ201310343042
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年8月7日 優先權日:2013年8月7日
【發明者】董英, 周越 申請人:江蘇大學