一種采用高滲透壓收獲液收獲病毒的方法
【專利摘要】本發明提供了一種采用高滲透壓收獲液收獲病毒的方法。本發明提供的高滲透壓收獲液滲透壓為1500～2500mOsmol/kg，包含細胞緩沖液PBS和蔗糖，其能夠高效的裂解細胞，使胞內病毒釋放并得到有效收集，是一種新的病毒收獲方式，打破了在大規模平面培養病毒工藝中由于收獲工藝的限制帶來的壁壘。通過改變細胞滲透壓的方式收獲病毒的工藝方法操作簡單，便于規?；a，可有效提高產業化能力，適用于企業的大規模生產，具有很強的實用性。本發明提供的高滲收獲液僅含蔗糖，可有效保證產品的安全性。
【專利說明】一種采用高滲透壓收獲液收獲病毒的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，具體地，涉及一種采用高滲透壓收獲液裂解細胞使病毒釋放并使其得到有效收獲的工藝方法。
【背景技術】
[0002]水痘一帶狀皰疫病毒(Varicella-Zoster virus, VZV)屬a皰疫病毒亞科,為雙鏈DNA病毒，其原發感染為水痘，潛伏感染再激活時可引發帶狀皰疹。接種疫苗是預防由VZV引起的水痘與帶狀皰疹的最有效措施。迄今為止，水痘減毒活疫苗(Oka株)是唯一獲準用于預防由VZV引起的疾病的疫苗。接種疫苗是公認的預防由VZV引起的水痘的最有效措施。
[0003]輪狀病毒(Rotavirus，RV)是引起嬰幼兒嚴重腹瀉和脫水的主要病因，在發展中國家和發達國家都是一個重要的公共衛生問題，全世界〈5歲的兒童每年大約有600，000左右的死亡病例，85%的死亡兒童在發展中國家。輪狀病毒腹瀉不但造成社會的疾病負擔，而且帶來了巨大的經濟損失。疫苗免疫是唯一可行的預防輪狀病毒腹瀉較高發病率和死亡率的方法。有鑒于此，世界衛生組織在1997年將輪狀病毒疫苗的開發列為全球新疫苗研制開發的第一項目，世界各國的有關機構都在積極進行輪狀病毒疫苗的研制工作。
[0004]EV71病毒和CA16病毒均為引起嬰幼兒手足口病的主要病原體。人腸道病毒71型(EV71)屬于小RNA病毒科，基因組為單股正鏈RNA，長度約為7400個核苷酸，僅含有一個開放讀碼框，編碼的多聚蛋白約含2 190個氨基酸。該病毒最早于1969~1970年間在美國加利福尼亞州發生中樞神經系統癥狀的嬰兒糞便中分離得到。電鏡觀察發現該病毒的形態及理化特性都與當時已知的其他腸道病毒類似，但中和抗體試驗和免疫擴散試驗卻未發現交互作用，因此認為是一種新型腸道病毒，命名為人腸道病毒71型。
[0005]柯薩奇病毒A組16型(簡稱:CA16)于1958年被分離出，CA16是單正鏈RNA病毒，病毒顆粒呈球形，為二十面體立體對稱，無包膜。基因組長約7400bp，包括5'及3'端的非編碼區和中間一個大的開放讀碼框(ORF)，依次由VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D 11個基因組成，主要編碼產生病毒結構蛋白。在歷次手足口病的流行中，EV71與CA16交替或共同出現，成為HFMD的主要病原體。
[0006]甲型病毒性肝炎簡稱甲型肝炎，是由甲型肝炎病毒(甲肝病毒)引起的一種急性傳染病，糞-口傳播是其主要傳播途徑。甲型肝炎病毒屬于微小核糖核酸病毒科，肝病毒屬。病毒顆粒呈球形，直徑約為27nm，無囊膜，衣殼由32個殼粒組成，呈20面體立體對稱，每個殼粒具有四個多肽分別為病毒蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，基因組為單股正鏈RNA，其長度相當于7500個核苷酸左右。在RNA的3'末端有多聚的腺苷序列，在5'末端以共價形式與病毒基因組蛋白。根據病毒核苷酸序列分析，人甲肝病毒可以分為四個基因型，但其抗原性相似，所以甲型肝炎病毒只有一個血清型。
[0007]病毒疫苗的制備一般是先將毒種接種于未感染的適宜代次的細胞上進行傳代，當達到一定程度細胞病變時收獲感染細胞，加適量疫苗液制成原液。原液經凍融，超聲破碎，離心，過濾澄清，得到上清液，加入疫苗穩定劑即半成品；半成品凍干或直接分裝后即成為凍干疫苗或液體劑型疫苗。
[0008]自1974年Oka株水痘減毒活疫苗問世以來，歐美等國家陸續開始了水痘疫苗的生產，其生產工藝均采用克氏瓶靜止培養，生產規模和病毒產量受到一定的限制。輪狀病毒的大規模培養主要采用轉瓶或細胞工廠，EV71、CA16病毒和甲肝病毒的大規模培養主要采用細胞工廠，上述病毒均屬于胞內病毒，在病毒的收獲工藝中需要有效的破碎裂解細胞使病毒釋放，并保證病毒顆粒的完整性。而不同的收獲工藝對細胞的裂解程度和病毒顆粒的完整性的影響不同。收獲方式直接影響病毒滴度值，而病毒收獲液的有效高滴度值是影響疫苗品質的重要因素。因此，選擇一種合適、有效的病毒收獲方式至關重要。
[0009]水痘病毒、輪狀病毒、EV71病毒、CA16病毒和甲肝病毒均屬于細胞內病毒，具有很強的細胞結合活性，病毒收獲時必須收集并破碎細胞才能得到游離的病毒顆粒。目前針對上述病毒的上市產品中，各廠家多采用凍融法收集和破碎細胞，該方法適合于轉瓶和克式瓶等培養方式，但不適用于細胞工廠培養系統；也有廠家采用含EDTA或胰蛋白酶的消化液經消化收集細胞，并采用凍融法破碎細胞，該方法適用于細胞工廠培養系統，但存在引入消化液成份并難以去除的弊端，對疫苗的安全性存在風險。
[0010]現有的技術中，EV71病毒、CA16病毒和甲肝病毒采用10層或40層細胞工廠的大規模培養中，采用凍融方式收獲病毒的可行性差；另一種方式則為收集病毒培養上清液，由于病毒為胞內病毒，上清液中病毒滴度值較凍融破碎細胞后收集的病毒液滴度值低，造成不必要的損失，對成品的質量也具有一定的影響。

【發明內容】

[0011]本發明的目的在于提供一種有效的破碎細胞收獲病毒的方法。
[0012]滲透壓法是通過滲透壓的改變達到破碎細胞、收獲病毒的目的。正常的滲透壓為285~310m0smol/kg，當細胞置于高滲透`壓溶液中時，由于滲透壓的作用，細胞內水分便向外滲出，細胞發生收縮，易于脫落，通過震搖可達到收獲細胞的目的。當達到平衡后，將介質快速稀釋，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內，引起細胞快速膨脹而破裂，從而達到收獲病毒的目的。
[0013]本發明首先提供一種用于破碎細胞收獲病毒的高滲透壓收獲液，其滲透壓值為1500~2500m0smol/kg，其配方含有細胞緩沖液PBS和蔗糖；其中PBS為行業內常用組分，組分為0.876%氯化鈉、0.031%二水合磷酸二氫鹽和0.287%十二水合磷酸氫二鹽，其中所述鹽為鈉鹽或鉀鹽；蔗糖的濃度為40%-60%。前述％均為質量體積比，單位為克/毫升
[0014]本發明的高滲透壓收獲液通過以下方法配制得到，將蔗糖按照40%_60%的質量體積比加入緩沖液PBS中，至完全溶解，過濾除菌。
[0015]上述高滲透壓收獲液在制備病毒類疫苗或藥物中的應用應屬于本發明的保護范圍。
[0016]所述的病毒為水痘病毒、輪狀病毒、EV71病毒、CA16病毒或甲型肝炎病毒。
[0017]本發明還提供了采用高滲收獲液破碎細胞收獲病毒的方法，所述方法包括如下步驟:
[0018](I)采用細胞瓶或細胞工廠培養病毒；[0019](2)配制高滲收獲液；
[0020](3)棄細胞培養液后加入高滲收獲液，室溫靜置；
[0021](4)顯微鏡下觀察細胞狀態，待細胞發生明顯收縮時震搖細胞瓶或細胞工廠，收集病毒液；
[0022](5)加入無菌注射水，使細胞滲透壓恢復至等滲；使細胞破裂，釋放病毒。
[0023]上述方法還包括步驟(6)顯微鏡下觀察細胞破碎情況。
[0024]本發明所述的高滲透壓收獲病毒的方法適用于胞內病毒，包括水痘-帶狀皰疹病毒、輪狀病毒、EV71病毒、CA16病毒或甲肝病毒。
[0025]步驟(1)為病毒的培養，主要為胞內病毒，病毒的釋放需要裂解細胞方可完成，如水痘-帶狀皰疫病毒、輪狀病毒、EV71病毒、CA16病毒或甲肝病毒。病毒培養米用的細胞為疫苗行業常用的如Vero細胞、二倍體細胞等。采用細胞瓶或細胞工廠等平面培養的模式培養細胞。
[0026]步驟(2)中高滲收獲液的配制為采用PBS為溶劑，將蔗糖按照40 ￥-60%的質量體積比加入PBS緩沖液中，至完全溶解，過濾除菌，備用。
[0027]步驟(3)和(4)中待病毒接種一定時間或細胞病變到CPE程度大于50%時棄培養上清液，加入步驟(2)中配制的高滲收獲液，室溫靜置并顯微鏡下觀察細胞狀態，待細胞發生明顯收縮時震搖細胞瓶或細胞工廠，收集病毒液。
[0028]步驟(5)中在收集的病毒液中加入無菌注射水，使細胞的滲透壓瞬間變化，胞外水瞬間滲入細胞，引起細胞快速 膨脹裂解。
[0029]步驟(6)中取樣觀察細胞破碎程度，收獲的病毒液用于后續的生產工藝。
[0030]本發明提供的高滲透壓收獲液裂解細胞能在50分鐘內使細胞發生明顯收縮，震搖后細胞裂解比例為100%，且收獲的病毒液滴度與現有技術相仿，無降低。本發明方法克服了以往工藝中上述各種病毒由于收獲工藝的限制而不能大規模的采用平面培養的壁壘，為一種全新的病毒收獲工藝，不僅適用于實驗室小規模的研究，更適用于生產企業的大規模生產，具有很強的實用性、創新性和新穎性。
【具體實施方式】
[0031]以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。
[0032]若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段；實施例中所用的試劑為市售商品。
[0033]實施例1高滲收獲液的配制
[0034]于無菌環境中配制高滲收獲液，步驟如下:
[0035]( I)按照表1內容，分別向PBS緩沖液中加入蔗糖，使蔗糖與PBS緩沖溶液的質量體積比(g/ml)滿足表1的內容，充分溶解；共5組，其中A、E兩組為對照組。
[0036](2 )維持 pH 值為 1.0-7.5 ；
[0037](3)過濾除菌,室溫保存,備用。
[0038](4)采用全自動冰點滲透壓計法測定滲透壓。[0039]表1高滲收獲液成分表
【權利要求】
1.一種用于破碎細胞收獲病毒的高滲透壓收獲液，其特征在于，該高滲透壓收獲液的滲透壓為 1500 ~2500m0smol/kg。
2.根據權利要求1所述的高滲透壓收獲液，其特征在于，含有緩沖液PBS和蔗糖。
3.根據權利要求2所述的高滲透壓收獲液，其特征在于，蔗糖含量為40%-60%，所述％為蔗糖與緩沖液PBS的質量體積比，單位為g/ml。
4.根據權利要求2所述的高滲透壓收獲液，其特征在于，所述緩沖液PBS的配方為:0.876%氯化鈉，0.031% 二水合磷酸二氫鹽和0.287%十二水合磷酸氫二鹽，所述％為質量體積比，單位為g/ml。
5.根據權利要求2所述的高滲透壓收獲液，其特征在于，通過以下方法配制得到，將蔗糖按照40%-60%的質量體積比加入PBS緩沖液中，至完全溶解，過濾除菌。
6.權利要求1-5任一所述的高滲透壓收獲液在制備病毒類疫苗或藥物中的應用。
7.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述的病毒為水痘病毒、輪狀病毒、EV71病毒、CA16病毒或甲型肝炎病毒。
8.一種采用高滲透壓收獲液收獲病毒的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)培養病毒； (2)配制權利要求1-5所述的高滲透壓收獲液； (3)當細胞出現病變并且CPE程度大于50%時，棄細胞培養液后加入高滲透壓收獲液，室溫靜置5-30分鐘；` (4)顯微鏡下觀察細胞狀態，待細胞發生明顯收縮時震搖，使細胞脫壁，收集病毒液； (5)向收獲的病毒液中加注射水，使細胞滲透壓恢復至等滲。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(1)采用細胞瓶或細胞工廠培養病毒。
10.權利要求8-9任一項所述的方法在制備用于預防或治療水痘病毒、輪狀病毒、EV71病毒、CA16病毒或甲肝病毒所致疾病的疫苗或藥物中的應用。
【文檔編號】A61K39/29GK103614346SQ201310363215
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年8月16日 優先權日:2013年8月16日
【發明者】張嵬, 于巍, 姜德玉, 何玉君, 康樂, 楊利偉, 黃金鳳, 尹衛東 申請人:科興（大連）疫苗技術有限公司