一種采用低滲透壓收獲液收獲病毒的方法
【專利摘要】本發明提供了一種采用低滲透壓收獲液收獲病毒的方法。本發明的收獲液滲透壓為0～150mOsmol/kg，其配方為磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉或在此基礎上添加氯化鈉和/或蔗糖；或者選用稀釋后的細胞培養基或細胞緩沖液PBS作為低滲收獲液。本發明的低滲收獲液裂解細胞能在10-60分鐘內使細胞發生明顯膨脹，震搖后細胞裂解比例為100%，且收獲的病毒液滴度與現有技術相仿，無降低。本發明方法能夠高效裂解細胞，使胞內病毒釋放并得到有效收集，打破了在大規模平面培養病毒工藝中由于收獲工藝的限制帶來的壁壘。通過改變細胞滲透壓的方式收獲病毒的工藝方法操作簡單，便于規模化生產，可有效提高產業化能力。
【專利說明】一種采用低滲透壓收獲液收獲病毒的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體地，涉及一種采用低滲透壓收獲液裂解細胞使病毒釋放并使其得到有效收獲的工藝方法。
【背景技術】
[0002]水痘-帶狀皰疫病毒(Varicella-Zoster virus, VZV)屬a皰疫病毒亞科,為雙鏈DNA病毒，其原發感染為水痘，潛伏感染再激活時可引發帶狀皰疹。接種疫苗是預防由VZV引起的水痘與帶狀皰疹的最有效措施。迄今為止，水痘減毒活疫苗(Oka株)是唯一獲準用于預防由VZV引起的疾病的疫苗。接種疫苗是公認的預防由VZV引起的水痘的最有效措施。
[0003]輪狀病毒(Rotavirus，RV)是引起嬰幼兒嚴重腹瀉和脫水的主要病因，在發展中國家和發達國家都是一個重要的公共衛生問題，全世界〈5歲的兒童每年大約有600，000左右的死亡病例，85%的死亡兒童在發展中國家。輪狀病毒腹瀉不但造成社會的疾病負擔，而且帶來了巨大的經濟損失。疫苗免疫是唯一可行的預防輪狀病毒腹瀉較高發病率和死亡率的方法。有鑒于此，世界衛生組織在1997年將輪狀病毒疫苗的開發列為全球新疫苗研制開發的第一項目，世界各國的有關機構都在積極進行輪狀病毒疫苗的研制工作。
[0004]EV71病毒和CA16病毒均為引起嬰幼兒手足口病的主要病原體。人腸道病毒71型(EV71)屬于小RNA病毒科，基因組為單股正鏈RNA，長度約為7400個核苷酸，僅含有一個開放讀碼框，編碼的多聚蛋白約含2190個氨基酸。該病毒最早于1969~1970年間在美國加利福尼亞州發生中樞 神經系統癥狀的嬰兒糞便中分離得到。電鏡觀察發現該病毒的形態及理化特性都與當時已知的其他腸道病毒類似，但中和抗體試驗和免疫擴散試驗卻未發現交互作用，因此認為是一種新型腸道病毒，命名為人腸道病毒71型。
[0005]柯薩奇病毒A組16型(簡稱:CA16)于1958年被分離出，CA16是單正鏈RNA病毒，病毒顆粒呈球形，為二十面體立體對稱，無包膜。基因組長約7 400bp,包括5'及3'端的非編碼區和中間一個大的開放讀碼框(ORF)，依次由VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D 11個基因組成，主要編碼產生病毒結構蛋白。在歷次手足口病的流行中，EV71與CA16交替或共同出現，成為HFMD的主要病原體。
[0006]甲型病毒性肝炎簡稱甲型肝炎，是由甲型肝炎病毒(甲肝病毒)引起的一種急性傳染病，糞-口傳播是其主要傳播途徑。甲型肝炎病毒屬于微小核糖核酸病毒科，肝病毒屬。病毒顆粒呈球形，直徑約為27nm，無囊膜，衣殼由32個殼粒組成，呈20面體立體對稱，每個殼粒具有四個多肽分別為病毒蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，基因組為單股正鏈RNA，其長度相當于7500個核苷酸左右。在RNA的3'末端有多聚的腺苷序列，在5'末端以共價形式與病毒基因組蛋白。根據病毒核苷酸序列分析，人甲肝病毒可以分為四個基因型，但其抗原性相似，所以甲型肝炎病毒只有一個血清型。
[0007]病毒疫苗的制備一般是先將毒種接種于未感染的適宜代次的細胞上進行傳代，當達到一定程度細胞病變時收獲感染細胞，加適量疫苗液制成原液。原液經凍融，超聲破碎，離心，過濾澄清，得到上清液，加入疫苗穩定劑即半成品；半成品凍干或直接分裝后即成為凍干疫苗或液體劑型疫苗。
[0008]自1974年Oka株水痘減毒活疫苗問世以來，歐美等國家陸續開始了水痘疫苗的生產，其生產工藝均采用克氏瓶靜止培養，生產規模和病毒產量受到一定的限制。輪狀病毒的大規模培養主要采用轉瓶或細胞工廠，EV71、CA16病毒和甲肝病毒的大規模培養主要采用細胞工廠，上述病毒均屬于胞內病毒，在病毒的收獲工藝中需要有效的破碎裂解細胞使病毒釋放，并保證病毒顆粒的完整性。而不同的收獲工藝對細胞的裂解程度和病毒顆粒的完整性的影響不同。收獲方式直接影響病毒滴度值，而病毒收獲液的有效高滴度值是影響疫苗品質的重要因素。因此，選擇一種合適、有效的病毒收獲方式至關重要。[0009]水痘病毒、輪狀病毒、EV71病毒、CA16病毒和甲肝病毒均屬于細胞內病毒，具有很強的細胞結合活性，病毒收獲時必須收集并破碎細胞才能得到游離的病毒顆粒。目前針對上述病毒的上市產品中，各廠家多采用凍融法收集和破碎細胞，該方法適合于轉瓶和克式瓶等培養方式，但不適用于細胞工廠培養系統；也有廠家采用含EDTA或胰蛋白酶的消化液經消化收集細胞，并采用凍融法破碎細胞，該方法適用于細胞工廠培養系統，但存在引入消化液成份并難以去除的弊端，對疫苗的安全性存在風險。
[0010]現有的技術中，EV71病毒、CA16病毒和甲肝病毒采用10層或40層細胞工廠的大規模培養中，采用凍融方式收獲病毒的可行性差，需要大量的超低溫保存設備，消耗能源并延長生產周期；另一種方式則為收集病毒培養上清液，由于病毒為胞內病毒，上清液中病毒滴度值較凍融破碎細胞后收集的病毒液滴度值低，難以制成合格的成品。低滲收獲工藝可通過改變細胞內外的滲透壓使細胞膨脹并破裂，成功收獲細胞內的病毒，避免因凍融引起的操作時間的延長及病毒滴度的下降。

【發明內容】

[0011]本發明的目的在于提供一種采用低滲透壓收獲液收獲病毒的方法。
[0012]滲透壓法是通過滲透壓的改變達到破碎細胞、收獲病毒的目的。正常的滲透壓為285~310m0smol/kg，當細胞置于低滲透壓溶液中時，由于滲透壓的作用，水分滲入細胞發生膨脹，引起細胞破裂，通過震搖可使細胞脫落，從而實現收獲病毒。
[0013]本發明首先提供了一種用于破碎裂解細胞收獲病毒的低滲透壓收獲液，該低滲收獲液的滲透壓為0~150m0smol/kg。
[0014]本發明提供的低滲透壓收獲液含有磷酸二氫鹽和磷酸氫二鹽或在此基礎上添加氯化鈉和/或蔗糖。即該低滲收獲液可以僅含磷酸二氫鹽和磷酸氫二鹽，也可在這個基礎上添加氯化鈉，也可以在兩種磷酸鹽的基礎上添加蔗糖，還可以在兩種磷酸鹽的基礎上同時添加氯化鈉和蔗糖。
[0015]具體地，本發明的低滲透壓收獲液含有如下組分:0.0026%-0.052%的磷酸二氫鹽、0.029%-0.58%的磷酸氫二鹽、0-0.34%的氯化鈉和0_1%的蔗糖。所述％均為質量體積比，單位為g/ml。
[0016]優選地，上述低滲透壓收獲液含有如下組分:0.0052%-0.026%的磷酸二氫鹽，0.058%-0.290%的磷酸氫二鹽，0-0.170%的氯化鈉和0-1%的蔗糖。所述％均為質量體積比，單位為g/ml。[0017]更優選地，上述低滲透壓收獲液含有如下組分:0.026%的磷酸二氫鹽，0.290%的磷酸氫二鹽，0%的氯化鈉和0%的蔗糖。所述％均為質量體積比，單位為g/ml。
[0018]本發明所述的磷酸二氫鹽、磷酸氫二鹽為鉀鹽或鈉鹽。
[0019]上述低滲透壓收獲液的配制為采用注射用水為溶劑，將磷酸二氫鹽和磷酸氫二鹽和/或氯化鈉和/或蔗糖按照上述的質量體積比分別加入至注射水中，至完全溶解，PH值為7.0-7.5，過濾除菌，備用。
[0020]另一方面，本發明所述的低滲透壓收獲液還可以為稀釋后的細胞培養基或細胞緩沖液PBS。將細胞培養基或細胞緩沖液進行稀釋一定倍數，使其滲透壓處于0~150m0Smol/kg的范圍內，常用的培養基為MEM、199、無酚紅199。
[0021 ] 本發明提供了上述低滲透壓收獲液在制備疫苗中的應用。
[0022]進一步地，本發明提供了一種采用低滲透壓收獲液收獲病毒的方法，包括如下步驟:
[0023]( I)在病毒培養環境中，當細胞出現病變并CPE程度大于50%時，棄去細胞培養液，加入上述低滲透壓收獲液，室溫靜置；
[0024](2)顯微鏡下觀察細胞狀態，待細胞發生明顯膨脹時震搖使細胞脫落，收集病毒液。
[0025]本發明所述的低滲透壓收獲液收獲病毒的方法適用于胞內病毒，包括水痘-帶狀皰疫病毒、輪狀病毒、EV71病毒、CA16病毒或甲肝病毒。
[0026]本發明方法中，采`用細胞瓶或細胞工廠培養病毒。病毒培養采用的細胞為疫苗行業常用的如Vero細胞、二倍體細胞等。采用細胞瓶或細胞工廠等平面培養的模式培養細胞。
[0027]步驟(1)中加入低滲收獲液后,室溫靜置5~30min。
[0028]并顯微鏡下觀察細胞狀態，待細胞發生明顯膨脹時震搖細胞瓶或細胞工廠，收集病毒液。
[0029]本發明提供了低滲透壓收獲液在制備用于預防或治療水痘病毒、輪狀病毒、EV71病毒、CA16病毒或甲肝病毒所致疾病的疫苗或藥物中的應用。
[0030]本發明提供的低滲透壓收獲液配方主要由小分子鹽類組成，可有效保證產品的安全性和有效性。該低滲收獲液裂解細胞能在10-60分鐘內使細胞發生明顯膨脹，震搖后細胞裂解比例為100%，且收獲的病毒液滴度與現有技術相仿，無降低。本發明方法能夠高效裂解細胞，使胞內病毒釋放并得到有效收集，打破了在大規模平面培養病毒工藝中由于收獲工藝的限制帶來的壁壘。采用傳統的凍融方式收獲病毒由于時間過長影響病毒穩定性導致滴度下降；通過直接收集培養上清液的方式收獲的病毒由于胞內病毒在培養過程中不能完全的釋放而導致病毒滴度值較低，由于傳統的疫苗生產中的轉瓶工藝批間差大、污染的風險較大并且耗費能源已經制約了一些疫苗企業的產能及效益；采用本發明所述的低滲透壓法收獲病毒對病毒的滴度無任何影響，其滴度值明顯高于凍融對照組和上清對照組，在大規模的生產過程中能夠提高病毒產量，且工藝簡單，便于操作，具有明顯的優勢，使得使用細胞工廠工藝收獲細胞內病毒成為可能。
【具體實施方式】[0031]以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。
[0032]若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段；實施例中所用的試劑為市售商品。本發明所述的MEM、199、無酚紅199培養基為常用市售產品，并按照說明書進行的配制。
[0033]實施例1低滲透壓收獲液的配制
[0034]于無菌環境中配制低滲透壓收獲液，步驟如下:
[0035]( I)向注射水中分別加入磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉和/或氯化鈉和/或蔗糖，充分溶解；
[0036]或者，將細胞培養基或細胞緩沖液PBS采用無菌注射水稀釋；加量或稀釋倍數見表1、表2所不。
[0037](2)將步驟(1)已充分溶解的溶液采用注射水定容至目標體積；
[0038](3 )維持 pH 值為 1.0-7.5 ；
[0039](4)過濾除菌,室溫保存,備用。
[0040](5)采用全自動冰點滲透壓計法測定各溶液滲透壓。
[0041]表1低滲收獲液成分表(I)
【權利要求】
1.一種用于破碎細胞收獲病毒的低滲透壓收獲液，其特征在于，該低滲收獲液的滲透壓為 O ~150m0smol/kg。
2.根據權利要求1所述的低滲透壓收獲液，其特征在于，含有磷酸二氫鹽和磷酸氫二鹽或在此基礎上添加的氯化鈉和/或蔗糖。
3.根據權利要求2所述的低滲透壓收獲液，其特征在于，含有如下組分:0.0026%-0.052%的磷酸二氫鹽、0.029%-0.58%的磷酸氫二鹽、0-0.34%的氯化鈉和0_1%的蔗糖，前述％均為質量體積比，單位為g/ml。
4.根據權利要求2所述的低滲透壓收獲液，其特征在于，含有如下組分:0.0052%-0.026%的磷酸二氫鹽，0.058%-0.290%的磷酸氫二鹽，0-0.170%的氯化鈉和0-1%的蔗糖；前述％均為質量體積比，單位為g/ml。
5.根據權利要求2所述的低滲透壓收獲液，其特征在于，含有如下組分:0.026%的磷酸二氫鹽，0.290%的磷酸氫二鹽，0%的氯化鈉和0%的蔗糖，前述％均為質量體積比，單位為g/ml o
6.根據權利要求1所述的低滲透壓收獲液，其特征在于，為稀釋后的細胞培養基或細胞緩沖液PBS。
7.根據權利要求6所述的低滲透壓收獲液，其特征在于，所述細胞培養基為MEM培養基、199培養基或無酚紅培養基。
8.一種采用低滲透壓收獲液收獲病毒的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)在病毒培養環境中，當細胞出現病變CPE程度大于50%時，棄去細胞培養液，加入權利要求1-7任一所述的低滲透 壓收獲液，室溫靜置5-30min ； (2)顯微鏡下觀察細胞狀態，待細胞發生明顯膨脹時震搖使細胞脫落，收集病毒液。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的病毒為胞內病毒。
10.權利要求1-7任一所述的低滲透壓收獲液在制備用于預防或治療水痘病毒、輪狀病毒、EV71病毒、CA16病毒或甲肝病毒所致疾病的疫苗或藥物中的應用。
【文檔編號】A61K39/125GK103602639SQ201310363119
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年8月16日 優先權日:2013年8月16日
【發明者】黃金鳳, 張嵬, 于巍, 孟凡紅, 何玉君, 谷業新, 高強, 尹衛東 申請人:科興（大連）疫苗技術有限公司